細胞周期を停止させ、アポトーシス、壊死、および DNA 損傷を誘導する特定のジスピロピペラジン誘導体

Jun 06, 2023

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8674 (2023) この記事を引用

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2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ジスピロピペラジン化合物は、生物活性を与えることが知られている分子の一種ですが、細胞周期調節因子として研究されている化合物は少数です。 ここでは、2 つのジスピロピペラジン誘導体の特性評価と合成について報告します。以前に合成されたスピロ[2',3]-ビス(アセナフテン-1'-オン)ペルヒドロジピロロ-[1,2-a:1,2-d]-ピラジン(SPOPP-3, 1)、およびこれまで記載されていなかったその異性体、スピロ[2',5']-ビス(アセナフテン-1'-オン)ペルヒドロジピロロ-[1,2-a:1,2-d]-ピラジン( SPOPP-5、2)。 SPOPP-3 (1) は、18 種類のヒトがん細胞株のパネルに対して、0.63 ～ 13 μM の範囲の IC50 値で抗増殖活性を有することが示されましたが、SPOPP-5 (2) はそうではありませんでした。 フローサイトメトリー分析により、SPOPP-3 (1) が SW480 ヒト癌細胞の細胞周期を G2/M 期で停止させることができることが明らかになりました。 ウェスタンブロット分析により、細胞周期の停止が M 期にあることがさらに確認されました。 さらに、SPOPP-3 (1) は、SW480 細胞においてアポトーシス、壊死、および DNA 損傷を誘導するだけでなく、有糸分裂紡錘体の位置を破壊することが示されました。 これらの結果は、新規抗がん剤としての SPOPP-3 (1) のさらなる研究を正当化するものであり、特に放射線誘発細胞死に対してがん細胞を感作させ、がん免疫療法を強化し、アポトーシス関連の薬剤耐性を克服し、使用の可能性を検討する潜在的な能力について評価する必要がある。合成致死性のがん治療において。

化学物質と放射線を使用して DNA 損傷を誘発することは、がん治療に最も一般的に使用される方法です。 最近、新しい抗がん治療戦略として細胞周期を操作して有糸分裂破局を誘導することへの関心が高まっています1、2、3、4、5。 有糸分裂破局は、DNA または有糸分裂紡錘体の損傷により通常は G2/M 期で停止する細胞が、細胞周期チェックポイントの欠陥により誤って有糸分裂に進むことを特徴とします6。 最終結果は、アポトーシス、ネクローシス、またはオートファジーのいずれかを介した老化または細胞死です7。 この戦略は、細胞周期チェックポイント阻害剤と組み合わせた DNA 損傷剤または放射線の使用に依存しています。 実際、転移性結腸直腸癌に現在使用されている化学療法薬であるイリノテカンを含む、いくつかの G2/M 期チェックポイント阻害剤 1、2、3、4、5 は、腫瘍細胞を電離放射線に対して感作させる可能性を示しています。 そのため、G2/M 細胞周期停止を引き起こす新しい化合物の発見は、依然として癌研究の重要な分野です 8,9,10。

現在、生物学的に活性なジスピロピペラジン誘導体はほとんど知られていません。 その一つが塩化プロスピジウムです。 プロスピジンとしても知られるこの化合物は、細胞増殖抑制性、抗炎症性、免疫抑制性の特性を持っています11、12、13。 これは、リンパ芽球形質転換中の T 細胞および B 細胞の有糸分裂誘発を阻害する能力 11 と、ラットの発がん物質によって誘発された乳腫瘍の腫瘍体積を減少させる能力に基づいて、抗腫瘍化合物として分類されています 12。 現在、塩化プロスピジウムは難治性関節リウマチの抗リウマチ薬として使用されています14。

生物学的に活性なジスピロピペラジン化合物についてはこれまでに報告されているにもかかわらず、他の化学誘導体については十分に研究されていません。 今回、我々はスピロ[2',3]-ビス(アセナフテン-1'-オン)ペルヒドロジピロロ-[1,2-a:1,2-d]-ピラジン(SPOPP)の抗増殖活性を初めて報告する。 -3、1)、以前に合成されたジスピロピペラジン誘導体。 SPOPP-3 (1) は、一連のヒトがん細胞株に対して抗増殖活性を有し、細胞周期を G2/M 期で停止させ、アポトーシス、壊死、DNA 損傷を誘導し、紡錘体位置を破壊することができます。

最近の報告では、2 つのジスピロピペラジン誘導体、スピロ [2',3]-ビス(アセナフテン-1'-オン)ペルヒドロジピロロ-[1,2-a:1,2-d]-ピラジン (ここではSPOPP-3, 1) アセナフテンキノンを使用したアゾメチンイリド環化付加反応によるスピロ[2',5]-ビス(アセナフテン-1'-オン)ペルヒドロジピロロ-[1,2-a:1,2-d]-ピラジン(AcQ) および l-プロリンを基質として使用15。 「材料と方法」に記載されているようにわずかに変更を加えて同様の反応を実行し、SPOPP-3 (1) を得ました (図 1)。 驚くべきことに、少量のスピロ[2',5']-ビス(アセナフテン-1'-オン)ペルヒドロジピロロ-[1,2-a:1,2-d]-ピラジン(ここではSPOPPと呼ぶ)も得ました。 -5、2）（図1および補足図S2、S3、S6〜S11）、予測される好ましくない形成経路のためにこれまで単離されていなかった異性体15、16。 ここでは、FTIR（補足図S3）、NMR（補足図S6〜S10）およびX線によって決定されたSPOPP-5（2）の純度（補足図S2）と構造を初めて報告します。回折分析（補足図S11）。

ジスピロピペラジン誘導体 SPOPP-3 (1) および SPOPP-5 (2) の合成。

私たちの知る限り、SPOPP-3 の生物活性は報告されていません (1)。 ここで我々は、SPOPP-3 (1) がヒト結腸癌細胞の細胞生存率を有意に低下させることを初めて示します (図 2)。 SPOPP-3 (1) の IC50 は、SW480、HT29、および HCT116 ヒト結腸癌細胞においてそれぞれ 5.06 ± 1.43 μM、5.42 ± 0.96 μM、および 2.44 ± 0.83 μM でした (表 1)。 対照的に、その異性体 SPOPP-5 (2) には有意な影響はなく、IC50 > 100 μM でした (図 2; 表 1)。 SPOPP-3 (1) と SPOPP-5 (2) が異なる種類の癌細胞に対して異なる効果を及ぼすかどうかを判断するために、別の 8 つの異なる種類のヒト癌を含む追加の 15 種類のヒト癌細胞株に対してそれらを評価しました。 ドキソルビシンを細胞株の陽性対照として使用し、その概要を表 1 に示します。SPOPP-3 (1) は阻害性を維持し、IC50 値の範囲はヒト T リンパ芽球様細胞株 CEM では 0.63 ± 0.17 μM から CEM では 13.0 ± 1.96 μM でした。ヒト肝癌細胞株 HepG2。 再び、SPOPP-5 (2) は、さらに 4 つの癌細胞株 (MiaPaca-2、Panc-1、SKOV3、および MDA-MB-231) において有意ではない活性を示しました (表 1)。 SPOPP-5 (2) は 7 種類の癌細胞株に対して有意な抗細胞生存効果を示さなかったという結果に基づいて、他の細胞株についてはさらに評価しませんでした。 SPOPP-3 の抗増殖効果 (1) は、ヒト白血病細胞株 (IC50 0.63 ～ 3.60 μM)、ヒト神経膠芽腫細胞株 (IC50 2.95 ～ 6.30 μM)、ヒト結腸癌細胞株 (IC50 2.44 μM) に対して最大でした。ヒト子宮頸がん細胞株（IC50 4.23 μM）、ヒト卵巣がん細胞株（IC50 6.30 μM）およびヒト乳がん細胞株（IC50 4.00 から 6.17 μM）。 SPOPP-3 (1) は、ヒト肝がん細胞株 (IC50 13.03 μM)、ヒト膵臓がん細胞株 (IC50 8.62 ～ 9.17 μM)、およびヒト前立腺がん細胞株 (IC50 9.80 μM) に対してわずかに弱い抗増殖活性を持っています。 ）。 全体として、結果は、SPOPP-3 (1) がヒト癌細胞株のパネルに対して比較的強力な抗増殖効果を有することを示しました。 SPOPP-3 (1) が細胞に対して抗増殖効果を発揮するメカニズムを理解するために、以下の研究を実施しました。

SPOPP-3 (1) はヒト結腸癌細胞の生存率を阻害しました。 SW480、HT29、および HCT116 ヒト結腸癌細胞の細胞生存率は、MTT アッセイを使用して評価されました。 細胞をさまざまな濃度の SPOPP-3 (1) または SPOPP-5 (2) で 48 時間処理しました。 示されている結果は、3 つの別々の実験からの代表的なものです。 エラーバーはSEMです。

SPOPP-3 (1) が細胞生存率を低下させるメカニズムを解明するために、細胞周期分析のためにフローサイトメトリーを実施しました。 図 3 に示すように、20 μM SPOPP-3 (1) で処理すると、G2/M 期で細胞周期が停止しました (図 3b)。 SPOPP-5 については活性は観察されませんでした (2)。 SPOPP-3 (1) が G2 期または M 期で停止を誘導するかどうかをさらに調査するために、確立された高感度有糸分裂マーカー 17 であるホスホヒストン H3 を検出するためにウェスタンブロット分析を実行しました。 実際、SPOPP-3 (1) で処理した SW480 細胞ではホスホヒストン H3 レベルが明らかに増加しましたが、SPOPP-5 (2) では増加しませんでした (図 4)。これは、SPOPP-3 (1) が SW480 細胞を M 期で停止させることを示しています。細胞周期のこと。 細胞周期に対する SPOPP-3 (1) の影響をさらに調査するために、サイクリン B1 活性化を研究する免疫蛍光実験を実施しました。 サイクリン B1 は、有糸分裂への移行を制御する重要な因子の 1 つであり 18,19、その発現は G2 期に急速に増加し、G2 後期または M 期初期にピークに達します 20,21。 図５に示すように、２倍のＤＡＰＩシグナルを有する細胞によって示されるＳＰＯＰＰ－３（１）処理細胞における四倍体細胞の集団は、ＤＭＳＯ対照と比較した場合に有意に増加した。 これは、SPOPP-3 (1) が細胞が娘細胞に分裂できない G2/M 期で細胞周期停止を引き起こしたというフローサイトメトリーの結果を裏付けています。 対照細胞では、ほとんどの四倍体細胞は、SPOPP-3処理四倍体細胞と比較して、有意に高いサイクリンB1染色を示しました（図5b）。 したがって、我々の結果は、SPOPP-3 (1) 治療がサイクリン B1 活性化の欠陥と関連していることを示しています。

SPOPP-3 (1) は、SW480 細胞の G2/M 期で細胞周期を停止させました。 （ a ）SW480細胞を2％DMS​​O、20μM SPOPP-3（1）、または20μM SPOPP-5（2）で24時間処理した後、細胞を回収し、フローサイトメトリーを使用した細胞周期分析に供しました。 (b) (a) の結果と、別の 2 つの追加の生物学的複製 (n = 3) を組み合わせて、次のように表現しました。 細胞周期のパーセンテージは、Watson Pragmatic モデルに基づいて計算されました。 二元配置分散分析を実行しました: *p < 0.0001。

SPOPP-3 (1) は SW480 細胞においてホスホヒストン H3 を誘導しました。 (a) 2% DMSO、20 μM SPOPP-3 (1) または 20 μM SPOPP-5 (2) で 24 時間処理した際のホスホヒストン H3 および GAPDH の発現を示す免疫ブロット。 (b) (A) と別の 2 つの生物学的複製 (n = 3) の結果を平均し、次のように表しました。 t 検定を使用しました: *p < 0.05。

免疫蛍光実験によって示された、SPOPP-3 処理細胞におけるサイクリン B1 誘導の欠陥。 SW480 細胞を 40 μM SPOPP-3 または 2% DMSO で 24 時間処理した後、固定し、サイクリン B1 抗体と DAPI で免疫染色しました。 （a）SPOPP-3で処理した細胞の代表的な画像（下の画像）は、サイクリンB1染色のない大規模な四倍体細胞集団（矢印で示す）を示しています。 対照的に、DMSO 処理細胞には、サイクリン B1 を発現する四倍体細胞の集団が比較的少数含まれています。 (b) 四倍体細胞 (DAPI シグナルが 2 倍) (左) およびサイクリン B1 陽性の四倍体細胞の割合 (右) を各グループで定量化し、平均 ± SD として示しました。 一元配置分散分析を使用しました: *p < 0.05。 スケールバー20mm。

観察された細胞生存率の低下につながる細胞死に対する SPOPP-3 (1) の考えられる影響を調べるために、フローサイトメトリーを使用してアポトーシスと壊死を分析しました。 壊死とアポトーシスを検出するために一般的に使用される染色は、それぞれ 7-AAD と Annexin V-PE です。 SPOPP-3 (1)、SPOPP-5 (2)、または 2% DMSO で 24 時間処理した後、細胞を 7-AAD および Annexin V-PE で二重染色しました。 図6aに示すように、SPOPP-3で処理した細胞（1）は、DMSO処理細胞（Q1; 0.5％）と比較して、より壊死状態に変化しました（Q1; 32.64％）。これは統計的に有意です（図6a）。 .6b）。 SPOPP-3 (1) も SW480 細胞においてアポトーシス (Q2 + Q4) を有意に誘導しました (図 6)。 一方、SPOPP-5 (2) は、コントロールと比較して、アポトーシスまたは壊死に対して有意な影響を与えませんでした。

SPOPP-3 (1) は SW480 細胞のアポトーシスと壊死を誘導しました。 （ a ）SW480細胞を2％DMS​​O、20μM SPOPP-3（1）、または20μM SPOPP-5（2）で24時間処理した後、細胞溶解物を単離し、フローサイトメトリーを使用した細胞死分析に供しました。 (b) (a) と他の 2 つの追加の生物学的複製 (n = 3) の結果を組み合わせて、次のように表現しました。 二元配置分散分析を使用しました: *p < 0.005、**p < 0.0001。

微小管毒素としての SPOPP-3 (1) の潜在的な機能を調査するために、免疫蛍光研究が実施されました。 微小管を破壊することがよく知られている 2 つの薬剤、ビンブラスチンとコルヒチンを陽性対照として使用しました。 ビンカアルカロイドのファミリーに属するビンブラスチンは、特定の部位でチューブリンに結合し、細胞周期の破壊につながる紡錘体の形成を阻害します 22,23。 ビンブラスチンを高濃度で使用すると、チューブリン凝集体が密集して準結晶形成を引き起こすことが知られています 24。 実際、SW480細胞を50nMビンブラスチンで処理すると、準結晶が観察されました（図7）。 一方、コルヒチンは微小管を破壊し、細胞全体に拡散したα-チューブリン染色を引き起こしました（図7）。 対照的に、SPOPP-3 で処理した細胞では有糸分裂紡錘体が観察できました (1)。 しかし、DMSOで処理した対照細胞と比較すると、紡錘体の位置が破壊されているように見えました(図7)。 有糸分裂紡錘体の変位は、細胞の赤道における染色体の整列の欠如にも関連していました (図 7)。 要約すると、これらの結果は、SPOPP-3 (1) は微小管形成を妨害しないが、紡錘体位置が影響を受けるようであることを示唆しています。

SPOPP-3 (1) は微小管破壊を引き起こしません。 SW480 細胞を 50 nM ビンブラスチン、1 μM コルヒチンまたは 40 μM SPOPP-3 (1) で 24 時間処理した後、固定し、α-チューブリン抗体および DAPI で免疫染色しました。 SPOPP-3 (1) 処理細胞では有糸分裂紡錘体が明確に観察され、コルヒチンとビンブラスチンは異なる機構を介して微小管破壊を誘導しました。 コルヒチン処理およびビンブラスチン処理により、それぞれ細胞質内の拡散したα-チューブリン染色およびパラ結晶形成（矢印）が観察されます。 スケールバーは5mm。

SPOPP-3 (1) がサイクリン B1 ダウンレギュレーションおよび有糸分裂紡錘体変位に関連する G2/M 停止を引き起こすという発見に基づいて、SPOPP-3 (1) の活性は DNA 損傷を介している可能性があります 19,25。 この可能性を調査するために、qPCR ベースの方法 (LORD-Q) を使用して DNA 損傷を検出しました 26。 この方法は DNA 損傷の種類に関係なく DNA 損傷を検出できるため、これが最も適切な方法であると考えられます。 図 8 に示すように、データのばらつきが大きいためデータは統計的有意性には達しませんでしたが、DNA 損傷に対する SPOPP-3 (1) の効果は、処理後 1 時間という早さで検出できます。 しかし、そのような効果は20時間の処理後には大幅に減少しました（図8）。

SPOPP-3 (1) は DNA 損傷を誘発しました。 40 µM SPOPP-3 (1) で指定された期間処理した SW480 細胞における LORD-Q を使用した DNA 病変の定量化。 mtDNA 遺伝子から増幅された短いアンプリコンと長いアンプリコンは、ミトコンドリア DNA の損傷の定量化に使用されました。 提示されたデータは、3 つの生物学的複製±SEM から平均化されたものです (n = 3)。

この研究では、SPOPP-3 の合成を報告し (1)、SPOPP-3 が 18 種類のヒト癌細胞株に対して強力な抗増殖活性を有することを初めて示しました (表 1)。 驚いたことに、以前に報告された合成手順 15,16 を使用して、新規化合物である構造異性体 SPOPP-5 (2) も得ました。 Haddad et al.15 は合成反応を 65 °C で 2 時間還流したのに対し、我々は合成に 35 °C、3 時間を使用したため、SPOPP-5 (2) が私たちの手で形成されたと考えています。 付加環化反応中の合成温度が低いほど、より速度論的に制御された生成物が得られることが知られています16。 SPOPP-3 (1) とは対照的に、SPOPP-5 (2) には実質的に抗増殖活性がありませんでした (表 1)。 我々は、SPOPP-3 の 2 つのカルボニル基 (1) の配置、特にそれらの間に追加の化学成分が存在しないことが、その抗増殖活性に寄与しているのではないかと推測しています (図 1)。 この仮説を検証するには、今後の構造活性相関研究を実施する必要があるでしょう。 異なる癌細胞株に対する SPOPP-3 の異なる効果は、細胞株の増殖速度に関連している可能性があります。 たとえば、SPOPP-3 は、成長の速いヒト白血病細胞株 (K562、KG1a、CEM) および神経膠芽腫細胞株 (U251、U87) に対して強力な抗増殖効果を持っていますが、成長の遅い HepG2 肝がん細胞株に対しては弱い効果があります。 DU145 前立腺がん細胞株、および膵臓がん細胞株 (MiaPaca2、Panc1) (表 1)。 興味深いことに、これは、より速く成長する細胞（U251、U87）とよりゆっくりと成長する細胞（DU145、SKOV3）の両方に対して強力な抗増殖効果を示したポジティブコントロールのドキソルビシンには当てはまりません。 このような観察は、SPOPP-3 とドキソルビシンが異なるメカニズムを通じて抗増殖効果を発揮することを示唆しました。

SPOPP-3 の抗増殖活性 (1) は、アポトーシスと壊死を誘導する能力 (図 6)、および G2/M 期で細胞周期停止を引き起こす能力 (図 3) と関連していました。 リン酸化ヒストンH3をM期マーカーとして使用すると、少なくとも一部の細胞がM期で停止していることが示されました（図4）。 我々の結果は、SPOPP-3 (1) 処理によりサイクリン B1 発現が大幅に減少することも示しました (図 5)。 G2 期後期におけるサイクリン B1 発現の上昇とその核への移行は有糸分裂の開始に重要ですが、siRNA ノックダウンを使用したサイクリン B1 の枯渇は細胞を G2 期のみに停止させません。これは冗長な機能によって説明できます。サイクリン B218,27 の。 また、微小管はSPOPP-3 (1) 処理の影響を受けていないように見えるが、紡錘体の位置や凝縮した染色体の整列を含むM期の欠陥が観察されることも顕微鏡を用いて実証した(図7)。 サイクリン B1 は通常中心体および動原体に動員されることが知られているため、これはサイクリン B1 レベルの低下によるものである可能性があります 28,29。 DNA 損傷の結果としてサイクリン B1 レベルが低下することが報告されているため、SPOPP-3 (1) が DNA 損傷を引き起こすかどうかをさらに調査しました 30,31。 実際、我々の結果は、ブレオマイシン 26 と同様に、SPOPP-3 (1) が初期段階で DNA 損傷を引き起こすことを示唆しています。この損傷は、処理後 1 時間では検出可能でしたが、20 時間では検出できませんでした (図 8)。 これはブレオマイシン 26 の効果と似ており、迅速な DNA 損傷修復反応の結果であると考えられます 32。結果として、このような初期の DNA 損傷イベントは、細胞プロセスであるサイクリン B1 の減少、細胞周期停止、アポトーシスおよび壊死を引き起こす可能性があります。それはずっと後になって起こります。

SPOPP-3 の抗増殖特性 (1) は、がん治療において重要な意味を持っています。 合成致死性は、がん治療における新しいアプローチです4,5。 SPOPP-3 (1) は G2/M 停止の強力な誘導因子であるため、G2/M チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用​​して有糸分裂破局を引き起こす可能性があり、これは現在、細胞死を促進する好ましい治療戦略と考えられています。アポトーシス、ネクローシス、またはオートファジーを介して。 特に、サイクリン-CDK4 経路によって媒介される G1/S 移行に欠陥があり、DNA 損傷にさらされたときに細胞周期停止を誘導するための G2/M チェックポイントへの依存性が高まっているほとんどの黒色腫症例では、SPOPP-3 (1) がG2/M 阻害剤と組み合わせるとさらなる利点が得られます4。 第二に、SPOPP-3 (1) が壊死の誘発物質であることを発見しました。 いくつかの一連の研究により、癌免疫療法の強化における壊死の役割、およびアポトーシスに対する癌細胞の抵抗性を克服するための可能な戦略としての壊死の役割を支持する証拠が提供されている 33,34。 この目的を達成するには、SPOPP-3 (1) が、壊死のマーカーである高移動度グループ 1 (HMGB1) タンパク質などの損傷に関連する分子パターンを放出することによって、炎症促進プロセスを誘導する能力を持っているかどうかを評価することが重要です。 。 このような因子が細胞外マトリックスに放出されると、CD8+ 白血球の活性化が起こり、抗腫瘍免疫が促進される可能性があります 34。

SPOPP-3 (1) が細胞を G2/M 期で停止させるメカニズムをさらに解読することも重要です。 例えば、ピペラジン誘導体は細胞内で活性酸素種 (ROS) を生成することが示されています 35。 したがって、SPOPP-3 (1) が酸化的 DNA 損傷とその後の G2/M 期での停止につながる ROS を生成できるかどうかを調査することは興味深いでしょう。 SPOPP-3 で処理した細胞で検出される細胞死のモードの 1 つである壊死 (1) に関しては、壊死は単に制御されていない細胞プロセスではなく、一般にネクロトーシスとして知られる制御された経路である可能性があることがますます明らかになってきています 36。 ネクロプトーシスは、特定の細胞株におけるがん転移を増加させることも報告されています 37。 ネクロトーシスには抗腫瘍誘発性と腫瘍誘発促進性という二重性があるため、どのような状況でネクロトーシスが有益であるかを判断するための研究が依然として必要です。 我々は、癌細胞株の大きなパネルに対してSPOPP-3 (1) のかなりの抗増殖活性を発見したので、さまざまな細胞株における細胞死の様式をさらに研究することが不可欠であろう。

結論として、我々は、広範囲のヒト癌細胞株に対して強力な抗増殖活性を有する、SPOPP-3 (1) と呼ばれる特定のジスピロピペラジン誘導体の合成と生化学的特性評価について説明します。 SPOPP-3 (1) は、DNA 損傷、アポトーシス、壊死を誘発し、細胞周期を G2/M 期で停止させ、正常な有糸分裂紡錘体位置を破壊します。 この研究は、SPOPP-3 (1) のさらなる開発の基礎を築き、細胞プロセスを混乱させて理解するための化学ツールとして、また潜在的な抗がん化合物として使用できる可能性を目指しています。 後者については、SPOPP-3 (1) を合成致死アプローチで、また壊死を誘導する抗がん化合物として研究する必要があります。

我々は、スピロ[2',3]-ビス(アセナフテン-1'-オン)ペルヒドロジピロロ-[1,2-a:1,2-d]-ピラジン (SPOPP-3, 1) を合成するために前述の方法を採用しました15。 、16． アセナフテンキノン (1.822 g、10 mmol) と 1-プロリン (1.151 g、10 mmol、Sigma-Aldrich) の混合物をメタノール (200 mL) に溶解し、35 °C で 3 時間加熱しました。 酢酸エチル:ヘキサン(1:2; v/v)を使用する薄層クロマトグラフィー(TLC)によって反応をモニターし、UV光(254nm)を使用してスポットを視覚化した。 通常、最初の 1 時間でオレンジ色の沈殿が形成され、さらに 1 時間後にはオレンジがかった茶色に変化し、反応完了後は暗褐色に変化しました。 溶媒を減圧下で除去すると、暗褐色の粉末(1.722g)が残った。 SPOPP-3 (1) と SPOPP-5 (2) の両方を含む粗生成物を、200 mL メタノール中の 2 g の標準シリカと混合しました。 溶媒を減圧下で除去し、シリカ混合物をカラムに乾式充填した。 順相シリカ (50 g) およびヘキサンと酢酸エチルの 9:1 混合物を流速 12 mL/min で使用するフラッシュクロマトグラフィーによる精製を使用して、SPOPP-3 (1) と SPOPP の混合物を単離しました。 -5(2)。 続いて、合計６８６ｍｇの粗生成物を使用する３回のフラッシュクロマトグラフィーによる精製を行った。 9:1 (ヘキサン:酢酸エチル) で Rf = 0.14 に相当する 530 ～ 830 mL で溶出するオレンジ色のバンドを減圧下で乾燥させ、280 mg の半精製 SPOPP-3 (1) を生成しました。 続いて、SPOPP-3 (1) を、Phenomenex Luna 5u Phenyl-Hexyl 4.60 mm × 250 mm カラムを使用する HPLC による生物学的試験用に精製しました。 流速 2 mL/min で 6 分間の 80 ～ 92% アセトニトリルの勾配を溶離液条件として使用しました。 半精製ＳＰＯＰＰ－３（１）については、合計１２．５ｍｇをＨＰＬＣに注入し、５ｍｇ（１６％）の精製ＳＰＯＰＰ－３（１）（保持時間４．０８分）を得た。 Rf = 0.24 (9:1 ヘキサン:酢酸エチル) に相当する 320 ～ 405 mL で溶出する黄色のバンドにより、120 mg の精製 SPOPP-5 (2) が生成されました。 SPOPP-5 (2) は、SPOPP-3 (1) と同じ HPLC 条件を使用して精製しました。 １２０ｍｇの半精製ＳＰＯＰＰ−５（２）をＨＰＬＣに注入し、２１ｍｇ（３％）の精製ＳＰＯＰＰ−５（２）を得た（保持時間６．０２分）。 HPLC-MS および NMR 分析を使用して、SPOPP-3 (1) および SPOPP-5 (2) の同一性を確認しました。 1D および 2D NMR スペクトルは、アルバータ大学の 5 mm Kimble NMR チューブ (ロックウッド、テネシー州、米国) を備えた Agilent/Varian Inova 400 MHz NMR 分光計、またはアルバータ大学の凍結プローブを備えた Bruker 600 MHz NMR で記録されました。ブリティッシュコロンビア。 すべての HPLC 分析は UV 検出器を備えた Agilent 1260 Infinity Systems で実行され、質量分析は Agilent 6120 Single Quad MS を使用して実行されました。

SPOPP-5 (2) (50 mg) の単一のオレンジ色の不規則結晶を、アセトニトリル (10 mL) からゆっくりと蒸発させることによって再結晶させた。 結晶は 7 日目に得られました。寸法 0.22 × 0.20 × 0.11 mm3 の適切な結晶を選択し、Bruker APEX II 面検出器回折計に取り付けました。 データ収集中、結晶は一定の T = 90(2) K に保たれました。 この構造は、デュアル メソッドとグラフィカル インターフェイスとして Olex239 を使用する ShelXT38 ソリューション プログラムで解決されました。 モデルは、F2 での完全行列最小二乗最小化を使用して XL38 で改良されました。

UNBC の Ranjana Bird 博士から入手した HT29 (結腸腺癌) を除き、すべての細胞株は American Type Culture Collection から入手しました。 以下を除いて、すべての細胞をイーグル最小必須培地（Lonza）で維持した：MiaPaca-2およびPanc-1はダルベッコ改変イーグル培地（Lonza）で維持したが、K562、KG1aおよびCEMはRPMI 1640培地（Lonza）で維持した。 すべての培地には、10% ウシ胎児血清 (Life Technologies Inc.) および抗生物質が補充されました。

細胞傷害性 MTT アッセイは、以前に記載されているように細胞生存率を評価するために使用されました 40。 簡単に説明すると、細胞を 1.5 × 103 細胞/ウェルの密度で 96 ウェル プレートに播種しました。 24 時間後、細胞を 0.16 ～ 100 μM の濃度範囲の SPOPP-3 (1) または SPOPP-5 (2) で 48 時間処理しました。 細胞を、0.003～0.8μMの陽性対照ドキソルビシンで処理した。 すべての吸光度データは、100% 細胞生存率として、コントロール (0.1% DMSO) と比較して表されました。

SW480 細胞を 6 ウェルプレートにウェルあたり 3.0 x 105 細胞の密度で播種し、翌日、20 μM SPOPP-3 (1)、20 μM SPOPP-5 (2)、または 2% DMSO で処理しました。 24時間。 細胞溶解物は前述のように調製されました41。 イムノブロット分析では、タンパク質サンプルを 10% SDS-PAGE で分離し、ニトロセルロース膜に転写しました。 ホスホ H3 抗体 (Ser10) (D2C8、1:1,000、Cell Signaling) を 4 °C で一晩インキュベートして使用しました。 抗 GAPDH (G8795、クローン GAPDH-71.1、1:20,000、Sigma) も使用しました。 抗マウス IgM-HRP (sc-2064、1:4000、Santa Cruz Biotechnology)、抗マウス IgG-HRP (W402B、1:4000、Promega)、および抗ウサギ IgG-HRP (W401B、1:4000、Promega) ）を二次抗体として使用した。 すべてのブロットは、FluorChem Q システム (ProteinSimple) で視覚化されました。 濃度測定分析は、AlphaView Q ソフトウェア (ProteinSimple) を使用して実行されました。

細胞を6ウェルプレートに2.5×105細胞/ウェルでプレーティングし、上記のように化合物で処理した。 細胞をトリプシン処理した後、遠心分離し、リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄した。 アポトーシス検出キット I (BD Pharmingen) の製造元の説明書に従って、生細胞を PE アネキシン V および 7-AAD で染色し、BD FACSMelody セルソーター (BD Biosciences) および BD FACSChorus ソフトウェア (V 1.0) を使用してフローサイトメトリーによって分析しました。 細胞周期分析では、BD サイクルテスト プラス DNA 試薬キットを使用して DNA を染色し、データはソフトウェア FlowJo を使用して分析しました。

SW480 細胞を、0.5 mL EMEM を含む 1 ウェルあたり 15 × 104 細胞の密度で 4 ウェルのカバーガラスチャンバーに播種しました。 細胞を指定の薬剤で 24 時間処理した後、100% メタノール (-20 °C) で 10 分間固定しました。 続いて、2% BSA および 0.1% Triton-x-100 を含む PBS を使用して細胞をブロックし、α-チューブリン抗体 (1:100; Ab4074; Abcam) またはサイクリン B1 抗体 (D5C10、1:200、細胞シグナル伝達) で染色しました。 ）。 抗マウスAF594および抗ウサギAF594(1:200; Molecular Probes)をそれぞれ二次抗体として使用した。 使用したすべての抗体は、0.5% BSA および 0.1% Triton-x-100 を含む PBS で希釈しました。 すべてのブロッキングおよび抗体インキュベーションのステップは室温で 1 時間実行されました。 各抗体インキュベーションステップの後、細胞を、PBS中に0.1% Triton-x-100を含む洗浄緩衝液で3回(各10分)洗浄した。 サイクリン B1 免疫蛍光の場合、細胞を 4% パラホルムアルデヒド中で室温で 15 分間固定しました。 DNA を染色するために、二次抗体による免疫染色後、細胞を DAPI 二塩酸塩 (PBS で希釈した 300 nM) とともに 5 分間インキュベートしました。 すべての蛍光画像は、電動ステージを備えた倒立 Zeiss Axio Observer Z1 顕微鏡、Zeiss Axiocam 503 モノラル カメラ、Colibri 2 マルチカラー LED 光源、Plan-Apochromat 20x/0.8 M27 または Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27 を使用して撮影されました。目標として。 四倍体細胞の定量化では、Zen ソフトウェアの関心領域機能を使用して、各画像内の各細胞の DAPI シグナルを定量化しました。 四倍体細胞は、同じ画像内の残りの細胞の 2 倍の DAPI シグナルで識別されました。 各グループからの 3 つの画像 (それぞれ少なくとも 36 個の細胞) が定量化されました。 次に、サイクリン B1 陽性の四倍体細胞の集団が各画像で決定され、各グループの平均として表示されました。 微小管毒素の陽性対照として、硫酸ビンブラスチンおよびコルヒチン (両方とも Sigma から購入) が含まれていました。

SPOPP-3 処理が DNA 損傷を引き起こすかどうかを評価するために、長期実行のリアルタイム PCR ベースの方法 (LORD-Q) を修正して使用しました 26。 SW480細胞（2.5×106個）を6ウェルプレート内でDMSO（コントロール）または40μM SPOPP-3で指定の期間処理した後、DNeasy Blood and Tissueキット（Qiagen）を使用して総DNAを単離するために回収しました。 LORD-Q 法は、mtDNA 遺伝子の長いアンプリコンと短いアンプリコンの両方に対して確立されたプライマーセットを使用して実行されました26。 PCR 効率は、PCR 反応ごとに 37.5、18.75、9.375、および 4.688 ng の DNA をテンプレートとして使用して計算されました。 rtPCR 反応 (総量 15 μL) は、0.05 × ResoLight 色素、1 × KAPA2G Fast Hot Start ReadyMix、500 nM のフォワードおよびリバース プライマー、およびテンプレートとして前述の量の単離 DNA で構成されました。 参照としての短いアンプリコンの増幅には、Quantabio PerfeCTa® SYBR® Green FastMix® を使用しました。 リアルタイム PCR 分析は Bio-Rad CFX96 システムを使用して実行され、データ分析は CFX Maestro ソフトウェアを使用して実行されました。 10 kb あたりの病変の数は、以前に確立された式 26、42 に基づいて計算されました。 提示されたデータは、3 つの生物学的複製から平均化されたものです ± SEM

細胞傷害性 MTT アッセイを 3 回繰り返して (3 ウェル/処理)、それぞれのコントロールからの吸光度の読み取り値を 100% の細胞生存率とみなしました。 イムノブロット分析では、ホスホヒストン H3 バンドの濃度測定をそれぞれの GAPDH バンドに対して正規化し、DMSO コントロール (1.0 として取得) と比較して表しました。 一元配置または二元配置 ANOVA を指示どおりに実行しました。 データは平均±SDとして表され、GraphPad Prismバージョン8.0.2（カリフォルニア州ラホーヤ）またはt検定を使用して分析されました。 Holm-Sidak テストを事後分析に使用しました。 p 値 < 0.05 は統計的に有意であるとみなされます。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、責任著者からの要求に応じて入手できます。

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このプロジェクトは、CHL への NSERC Discovery Grant (227158)、CHL へのカナダイノベーション財団 (34711)、および CHL への BC Knowledge Development Fund (103970) からの資金提供によって支援されました。 VL、MZ、JL は UNBC Research Project Awards によって支援されました。

北ブリティッシュコロンビア大学理工学部化学生化学学科、プリンスジョージ、ブリティッシュコロンビア州、V2N 4Z9、カナダ

ビクター・P・リュー、ワイミン・リー、ジャック・ロフロス、メーリーン・ゼブ、チョウ・H・リー

ブリティッシュコロンビア大学化学科、ブリティッシュコロンビア州バンクーバー、V6T 1Z1、カナダ

ブライアン・O・パトリック

マキュアン大学物理科学部、10700-104 Avenue、エドモントン、AB、T5J 4S2、カナダ

ティナ・M・ボット

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VPL、WML、CHL は研究を概念化し、設計しました。 VPL は合成と実験を行って図を作成しました。 図１、３、４、６および図１、３、４、６。 S1 ～ S11。 WML は実験を実施し、図を作成しました。 BOP は X 線結晶構造解析実験を実施し、図 S11 を作成しました。 VL、JL、および CHL が MTT アッセイを実施し、図 2 および表 1 を作成しました。MZ がフローサイトメトリー実験の一部を実施し、図 6 を作成しました。CHL、WML および TMB が監督を行いました。 CHL は原稿の初稿を書き、原稿の改訂を管理しました。 CHL は資金と研究施設を提供しました。 著者全員が最終原稿を確認し、承認しました。

チョウ・H・リー氏への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Liu, VP、Li, WM.、Lofroth, J. 他細胞周期を停止させ、アポトーシス、壊死、および DNA 損傷を誘発する特定のジスピロピペラジン誘導体。 Sci Rep 13、8674 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35927-6

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受信日: 2023 年 3 月 16 日

受理日: 2023 年 5 月 25 日

公開日: 2023 年 5 月 29 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35927-6

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