乾燥保存された多層線維芽細胞シートは、創傷治癒を促進する再生医療のための新しい管理可能なツールです

Apr 03, 2023

Scientific Reports volume 12、記事番号: 12519 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

本研究では、乾燥保存した多層線維芽細胞シート（ドライシート）の皮膚潰瘍に対する治療効果を検討しました。 ドライシートは、多層に重ねられた線維芽細胞シート（リビングシート）を自然乾燥させて生命活動を停止させたものです。 in vivo での適用前に、創傷治癒における乾燥シートのメカニズムを調べるために、培地への成長因子の放出をテストしました。 血管内皮増殖因子 (VEGF) と肝細胞増殖因子 (HGF) は乾燥シートと生きたシートの両方から放出されましたが、高レベルの線維芽細胞増殖因子 2 (FGF-2) と高移動度グループ ボックス 1 (HMGB1) タンパク質は乾燥シートと生きたシートの両方からのみ放出されました。乾いたシート。 インビトロ線維芽細胞増殖アッセイにより、乾燥シート溶出液は、生シート溶出液と比較して、細胞増殖およびＶＥＧＦおよびＨＧＦ産生を有意に増強することが明らかになった。 FGF-2 中和抗体は、この増殖反応を大幅にブロックしました。 糖尿病マウスに作られた創傷では、自己細胞または同種異系細胞を使用したドライシート治療群は、無治療群と比較して有意に加速された創傷閉鎖を示しました。 乾燥シートの保存安定性は、室温よりも冷蔵温度の方が優れており、少なくとも 4 週間は安定でした。 私たちのデータは、同種異系ドライシートが創傷治癒を促進する再生医療のための有望な新しいツールであることを示しました。

近年、移植領域での移植細胞の保持力を向上させる細胞シート技術が開発され1、虚血性心筋症、肺手術後の空気漏れ、内視鏡的粘膜下組織術後の狭窄など、さまざまな疾患や術後合併症の予防に細胞シート移植療法が使用されています。食道の解剖2、3、4。 この技術は皮膚潰瘍の治療にも使用できます。

以前、我々は線維芽細胞と末梢血単核球（PBMNC）からなる混合細胞シートを開発しました。これは、PBMNCとの共培養と低酸素プレコンディショニング処理の相乗効果により、線維芽細胞からの血管内皮増殖因子（VEGF）分泌を増加させました5。 、６． 細胞シートの治療効果の主な作用機序の 1 つは、細胞シートからの成長因子とサイトカインの産生によるパラクリン効果に関係します。 混合細胞シートは、マウスおよびウサギの皮膚潰瘍モデルの創傷治癒に成功することが示されています5、6。 私たちは以前の研究で、多層細胞シートを製造する簡単な方法を開発し、低酸素プレコンディショニングで処理した自家多層混合シートのマウス皮膚潰瘍モデルにおける有用性を報告しました7。 さらに、PBMNCとヒト口腔粘膜線維芽細胞を含む低酸素プレコンディショニング済み自家多層混合細胞シートを下腿潰瘍に移植した臨床研究において、これらの安全性と創傷治癒促進効果が確認されました8。 しかし、6 例のうち 3 例は移植に至らなかった。1 例は線維芽細胞の増殖不足が原因で、他の 2 例は VEGF 産生が不十分のため移植の基準を満たさなかった8。 自己細胞を使用したこの臨床研究では、患者の線維芽細胞のパフォーマンスが高率で低下していることも明らかになりました。 自己細胞を用いた細胞シート治療は、患者の治療効果が期待できる有望な治療法であり、同種細胞を用いて作製した細胞シートの安定供給が求められています。 混合細胞シート内の自家 PBMNC の目的は、線維芽細胞の分泌能力を向上させることでした。 しかし、細胞シートを積層することで線維芽細胞シートの機能は十分に増強され、マウス皮膚潰瘍モデルでは線維芽細胞単独と混合細胞シートの効果にほとんど差がありませんでした7。 マウス潰瘍モデルにおいて、多層線維芽細胞シートから十分な成長因子が分泌され、同種多層線維芽細胞シートの創傷治癒効果が自家細胞シートと同等であることを確認しました。 ある程度の局所免疫は発生しますが、これは創傷治癒に悪影響を及ぼしません9。 したがって、細胞シート移植療法の臨床応用を考えると、安定供給可能な他家細胞から作製した細胞シートが最適と考えられる。

細胞シート治療の利便性と普及率を向上させるためには、迅速に使用できる簡単な細胞シート保存法の開発が不可欠です。 選択肢の 1 つは、凍結融解によって脱細胞化される細胞外マトリックス (ECM) シートの使用です10。 これらのシートは、保存安定性と免疫拒絶率の低下という利点があり、移植時に細胞の足場として機能します10、11。 しかし、凍結融解による細胞損傷のため、生理活性物質はほとんど保持されません。 それ以外の場合は乾燥保存が利便性の点で最適な方法です。 凍結乾燥した表皮細胞シート 12、13 および羊膜シート 14、15 に関する研究が行われています。 しかし、乾燥保存された線維芽細胞シートに関する報告はまだありません。 そこで本研究では、乾燥保存多層線維芽細胞シート（ドライシート）を開発し、マウス皮膚潰瘍モデルにおいて同種線維芽細胞を用いてその治療効果を評価することを目的とした。 ドライシートの有効性を検証するため、凍結融解を繰り返しても細胞内容がほとんど含まれない凍結融解シート（FTシート）や線維芽細胞を多層に重ねたシート（リビングシート）と比較しました。 この研究で使用したすべての細胞シート、生シート、乾燥シート、および FT シートは、低酸素プレコンディショニングが線維芽細胞の分泌能力を高めるのに効果的であるため、以前に報告されている 7、低酸素プレコンディショニングされた多層線維芽細胞細胞シートから製造されました 5,6。 in vivo での適用に先立って、創傷治癒における乾燥シートの作用メカニズムを研究するために、培地への成長因子の放出がテストされました。 乾燥シートは、生シートが分泌するＶＥＧＦや肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などの血管新生因子を分泌しないと考えられる。 しかし、乾燥により細胞膜が損傷され、再水和時に細胞内物質が放出される可能性があります。 この研究では、放出される線維芽細胞成長因子 2 (FGF-2)16、17、18、19、20 および高移動度グループ ボックス 1 (HMGB1) タンパク質 21、22、23、24、25、26 に焦点を当てました。損傷した細胞から除去され、創傷治癒に関与します。 これらの成長因子が乾燥シートから培地中に放出されるかどうか、またそれらの生物活性が保持されるかどうかを調査しました。

マウス尾皮膚由来の培養初代線維芽細胞 (C57BL/6N) を、通常の 24 ウェル培養プレートに 1 ウェルあたり 4.2 × 105 細胞で播種して多層細胞シートを形成し、細胞を正常酸素条件下でインキュベートしました (37低酸素プレコンディショニングの治療のために、低酸素条件（33 °C、5% CO2、2% O2）を 1 日間続けた後、低酸素条件（33 °C、5% CO2、2% O2）で 2 日間処理しました 5、6、7。 インキュベーション後、この研究でリビングシートとして使用するために、ディスパーゼ処理後に多層線維芽細胞シートを培養プレートから静かに剥がしました。 図1aに示すように、ドライシートとFTシートは両方とも、それぞれ30分間の自然乾燥または凍結融解サイクルによってリビングシートから製造されました。 詳細については、「材料と方法」セクションで説明します。 各細胞シートの形態学的観察を図1bに示します。 培養プレートから剥がすと、リビングシートは取り付けられていたサイズの約半分に縮みました。 乾燥したシートはピンセットで掴めるほど硬かったが、その構造は維持されていた（補足図S1）。 FTシートはリビングシートよりも透明度が高かった。

細胞シートの調製と組織学的分析。 (a) 多層線維芽細胞シート、乾燥保存多層線維芽細胞シート、凍結融解（FT）シートの製造の模式図。 (b) 生シート、乾燥シート、FT シートの形態観察。 各細胞シートを 24 ウェル プレートのウェルに配置しました (スケール バー = 5 mm)。 (c) HE 染色によるリビング、乾燥、および FT シートの断面図 (スケール バー = 50 μm)。 (d) アザン染色による生きたシート、乾燥したシート、および FT シートの断面図 (スケール バー = 50 μm)。 （ e ）コラーゲンタイプI（赤）およびDAPI（青）の免疫蛍光染色を施した、生きているシート、乾燥シート、およびFTシートの断面図（スケールバー= 50μm）。 (f) 各細胞シートの平均厚さ。 値は平均 ± SD (*P < 0.05、Tukey-Kramer 検定、グループあたり n = 6) として表されます。 (g) 各細胞シートの平均層数。 値は平均 ± SD (Tukey-Kramer 検定、グループあたり n = 6) として表されます。 (h) 各細胞シート内の核の平均数。 各細胞シートの切片において、長軸に沿って100μm以内の核の数を測定した。 値は平均 ± SD (**P < 0.01、Tukey-Kramer 検定、グループあたり n = 6) として表されます。 リビング：リビングシート。 乾燥: シートを乾燥させます。 FT: 凍結融解したシート。

ヘマトキシリン・エオシン（HE）およびアザンで染色した各シート（つまり、生シート、乾燥シート、またはFT）の断面を図1c、dに示します。 すべてのシートは多細胞層でした。 乾燥シート（21±4.2μm）はリビングシート（25.7±5.1μm）よりわずかに薄く、5〜7層でした（図1f、g）。 乾燥したシートでは、細胞核にわずかな形態変化があり、膨張してサイズがより多様になりました。 シートの長さ 100 μm あたりの核の数は、おそらく乾燥後の体積が小さくなったため、乾燥シートの方が大幅に高かった (図 1h)。 FT シートでは変化が比較的大きく、核とクロマチンの数が顕著に減少していました。 青色領域 (アザン染色によりコラーゲンを示す) と赤色領域 (蛍光免疫染色により明らかになった ECM I 型コラーゲンを示す) の両方が 3 枚のシートすべてで見つかりました。 それらの顕著性は、リビングシート、ドライシート、FTシートの順にランク付けされました（図1eを参照）。

細胞シートをバイオクリーンベンチ上で、温度30.7℃（27.6～31.4℃の範囲）、湿度39.6％（31.1～49.6％の範囲）、風速0.1～0.1℃の条件で風乾した。 0.4m/秒まで。 風乾中のリビングシートからドライシートまでの重量変化を測定した。 リビングシートの平均重量は６．９ｍｇであった。 風乾により細胞シートの水分含有量が減少し、3 回の独立した実験から平均 13.7 分 (9、12、および 20 分) で細胞シートの重量が平衡に達しました。 平衡に達した乾燥シートの平均重量は 0.31 mg でした (図 2a)。 乾燥シートの平均表面積は０．３１ｃｍ ２ ／枚であり、カールフィッシャー法により測定した乾燥シートの含水率は３．２％であった。 初期乾燥速度は７．９ｍｇ／分・ｃｍ ２ であった。

乾燥時間による細胞シートの重量変化と細胞毒性の調査。 (a) バイオクリーンベンチでの乾燥時間中の多層線維芽細胞シートの重量変化。 リビングシートの平均重量は６．９ｍｇであった。 乾燥中、平均 13.7 分後の平均重量は 0.31 mg でした。 3 つの独立した実験が実行されました。 実線は重量を、点線は初期乾燥速度を示します。 (b) 未固定のリビングシートと乾燥シートの DAPI 染色。 メタノールに浸した生体シートをポジティブコントロールとして使用し、付着した細胞シートをネガティブコントロールとして使用しました（スケールバー = 50 μm）。 (c) ポジティブコントロールとして溶解バッファーに浸漬したリビングシートとネガティブコントロールとして PBS を使用した LDH 放出アッセイによる細胞シートの乾燥時間と細胞膜損傷の関係の評価。 値は平均 ± SD (**P < 0.01、ns: 陽性対照に対して有意ではない、Tukey-Kramer 検定、グループあたり n = 6) として表されます。 (d) 24 時間の再培養後の細胞シートの接着能力の観察。 生きたシート (左) は培養皿に付着し、線維芽細胞が端から遊走することが観察されましたが、乾燥シート (右、スケール バー = 50 μm) では遊走しませんでした。 （e）WST-8試薬による24時間再培養細胞シートの細胞代謝活性の評価。 値は平均 ± SD (**P < 0.01、ns: 有意ではない、Tukey-Kramer 検定、グループあたり n = 4) として表されます。 培地: CTS AIM-V + 10% FBS。

乾燥による細胞死を評価するために、未固定の細胞シートを 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) で染色し、細胞膜の損傷を検出しました。 リビングシートでは核の一部のみが DAPI で染色されました (図 2b)。 乾燥の5、10、および15分で、細胞シートの核は細胞シートの周囲からDAPIで染色されましたが、細胞シートの中心には染色されていない領域がありました（補足図S2）。 30分間乾燥させたシートのほぼすべての核がDAPIで染色されました（図2b）。 この観察は、細胞膜の透過性が乾燥プロセスの影響を受けたことを示唆しています。 損傷した細胞膜を定量的に評価するために、乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH) 放出アッセイを実行し、乾燥時間と損傷した細胞の割合との関係を調査しました。 ポジティブコントロール（溶解緩衝液で処理したリビングシート）と比較して、リビングシートのLDH放出率は21%でした。 LDH の放出率は乾燥時間とともに増加し、10 分で 88%、15 分で 92%、30 分後には 98% 以上となり、平衡乾燥重量の達成に相当しました (図 2c)。

細胞の生存を確認するために、細胞シートを 24 時間再培養しました。 生きたシートは培養皿の底面に接着し、シートの縁から線維芽細胞が遊走しましたが、乾燥シートでは培養皿への接着も線維芽細胞の遊走もありませんでした（図2d）。 24時間培養した乾燥細胞シートは代謝活性を示さず、吸光度は培地の吸光度に匹敵しました（図2e）。 これらの結果は、乾燥シート上の細胞膜が乾燥によりかなり弱くなり、シートの乾燥により細胞死を反映して不可逆的に生命活動が停止することを示している。

これらの観察結果を総合して、信頼性の高い乾燥条件を確保するために乾燥時間を 30 分に設定しました。 したがって、以下の実験は、30 分間自然乾燥させ、室温 (23 °C) で最大 1 週間保存した乾燥シートを使用して実行されました。

溶解細胞シートの上清を使用して乾燥シートに残っている成長因子とサイトカインを評価するために、ELISA を使用して VEGF、HGF、FGF-2、および HMGB1 のレベルを測定しました。 乾燥シートでは、各成長因子の量は生きたシートと同等でしたが、FTシートでは有意に低い値が示されました（図3a）。 続いて、これらの成長因子が乾燥シートから培地中に放出されるかどうかを調べました。 各細胞シートを 200 μL の培地に浸漬し、24 時間インキュベートした後、浸漬した細胞シートから上清を回収しました。 VEGFおよびHGFは、リビングシート溶出液と乾燥シート溶出液の両方で検出されましたが、FGF-2およびHMGB1は乾燥シート溶出液でのみ検出されました（図3b）。 さらに、間接免疫蛍光染色により各細胞シートにおける FGF-2 と HMGB1 の局在を調べました。 FGF-2は主に生きたシートと乾燥したシートの細胞質に局在していましたが、FTシートでは検出されませんでした（図3c）。 HMGB1は、生きているシートと乾燥したシートの細胞核に主に共局在していることがわかりましたが、FTシートでは検出されませんでした（図3d）。 さらに、FGF-2およびHMGB1の免疫染色シグナルは、浸漬後の乾燥シートでは著しく減少しました（補足図S3）。 これらの観察は、細胞膜と核膜が風乾によって弱くなったため、乾燥シート中の細胞内FGF-2とHMGB1が細胞から容易に放出されたことを示しています。

乾燥シート中の成長因子とサイトカインが細胞から放出されます。 (a) 各細胞シートからの成長因子の保持レベル。 ELISAにより測定した各細胞シート溶解物の上清のVEGF、HGF、FGF-2およびHMGB1の濃度。 細胞シートを 200 µL の細胞溶解バッファー 2 に浸して溶解物を調製しました。値は平均 ± SD として表されます (**P < 0.01、ns: 有意ではありません、Tukey-Kramer 検定、グループあたり n = 3)。 (b) 各細胞シートからの成長因子の放出量。 ELISAで測定した溶出サンプルの上清のVEGF、HGF、FGF-2およびHMGB1の濃度。 溶出液サンプルは、各細胞シートを 10% FBS を含む 200 μL CTS AIM-V に正常酸素圧条件で 24 時間浸漬することによって調製しました。 値は平均 ± SD (**P < 0.01、Tukey-Kramer 検定、グループあたり n = 4) として表されます。 有意差は、生きているシート、乾燥したシート、および FT シートの間でのみ調べられました。 Culture su.：シート作製時の培養上清（CTS AIM-V + HFDM-1(+) + 5% FBS）、培地：CTS AIM-V + 10% FBS。 (c) FGF-2 (赤) および DAPI (青) の免疫蛍光染色を施した、生シート、乾燥シート、および FT シートの断面図。 (スケールバー = 50 μm)。 (d) HMGB1 (赤) および DAPI (青; スケール バー = 50 μm) の免疫蛍光染色を施した、生きたシート、乾燥シート、および FT シートの断面図。 リビング：リビングシート。 乾燥: シートを乾燥させます。 FT: 凍結融解したシート。

乾燥シート溶出物の生物活性を調査するために、本発明者らは、インビトロでの細胞増殖および線維芽細胞におけるＶＥＧＦおよびＨＧＦ産生を調べた。 線維芽細胞を培地と溶出液を1:1の比率で混合して48時間培養しました。 乾燥シート溶出液は対照よりも 1.75 倍高く、生または FT シート溶出液よりも有意に高い細胞増殖を示しました (図 4a)。 次に、培養上清中のVEGFおよびHGFの濃度を測定しました（図4b、c）。 図3bに見られるように、線維芽細胞を含む乾燥溶出液では、対照と比較して有意な量のVEGFおよびHGFが検出されましたが、線維芽細胞を含まない乾燥溶出液では高レベルのVEGFおよびHGFは検出されませんでした。 これは、48 時間のインキュベーション中の成長因子の安定性によるものと考えられます。 したがって、線維芽細胞の有無による溶出液の値の差を、溶出液の刺激により線維芽細胞から新たに生成されたVEGFおよびHGFの含有量とみなして、対照との比率として比較しました（図4d、e）。 乾燥シート溶出液は、対照の場合の 1.53 倍および 4.64 倍という有意に高い VEGF および HGF 産生速度を誘導しました。 これらの結果は、乾燥シート溶出液が細胞に対して生物学的影響を及ぼしたことを示しています。

乾燥シートの溶出液による線維芽細胞における細胞増殖、VEGFおよびHGF産生の促進。 各細胞シートを 200 μL DMEM に 24 時間浸漬することにより溶出サンプルを調製し、遠心分離後に上清を回収しました。 （ a ）線維芽細胞を、10％FBSを含む100μLのDMEM中でウェルあたり8000細胞の濃度で96ウェルプレートに播種し、続いて100μLの溶出サンプルまたは対照としてDMEMを添加した。 さらに、線維芽細胞を含まない溶出液サンプルとして、ウェル当たり100μLの溶出液サンプルを10％FBSを含む100μLのDMEMに加えた。 正常酸素条件下で 48 時間インキュベートした後、培養上清を収集し、WST-8 試薬による細胞増殖アッセイを実行しました。 細胞増殖速度は、対照としてDMEM中で培養した線維芽細胞を使用して計算した。 (b、c) 溶出液によって刺激された線維芽細胞の培養上清中の VEGF および HGF の濃度。 (d、e) 溶出液刺激時の線維芽細胞からの VEGF および HGF 生成比。 比率は、次の式を使用して計算しました: [(溶出液サンプルで培養した線維芽細胞の上清) - (線維芽細胞を含まない溶出液サンプルの上清)]/(DMEMで培養した線維芽細胞の上清)。 DMEM中で培養した線維芽細胞を対照として使用した。 (f) 溶出サンプルを抗 FGF-2 またはコントロール抗体とともに 37 °C で 60 分間インキュベートしました。 線維芽細胞を、1% FBS を含む 100 μL DMEM 中の 1 ウェルあたり 8000 細胞の濃度で 96 ウェル プレートに播種し、続いて抗体を含む溶出サンプル、または rFGF-2 (0 または5 ng/mL）抗体を含む。 正常酸素条件下で 48 時間インキュベートした後、培養上清を吸引し、WST-8 試薬による細胞増殖アッセイを実行しました。 細胞増殖率は、対照抗体を用いて0 ng/mL rFGF-2中で培養した線維芽細胞を対照として計算した。 すべてのパネルのデータは平均 ± SD (*P < 0.05、**P < 0.01、Tukey-Kramer 検定、グループあたり n = 9) として表されます。 Living: リビングシート溶出液、Dry: 乾燥シート溶出液、FT: 凍結融解シート溶出液、rFGF-2: 組換え FGF-2 タンパク質。

FGF-2 は強力な成長因子です。 乾燥シート溶出液には大量の FGF-2 が含まれており、FGF-2 が生物活性に影響を与える可能性があることが示唆されました。 したがって、FGF-2 に対する中和抗体または組換え FGF-2 タンパク質 (rFGF-2) を使用して、溶出液中の FGF-2 が線維芽細胞の増殖に直接影響するかどうかを調べました。 対照抗体（マウス IgG1 アイソタイプ対照）の存在下では、乾燥シート溶出液または rFGF-2 によって線維芽細胞の増殖応答が促進されました。 しかし、これらの増殖反応は、FGF-2の中和によって有意に阻害されました（図4f）。 これらの結果は、乾燥シートの生物学的活性が主に FGF-2 の効果によるものであることを示しています。

自己細胞（C57BL/6N マウス）および同種異系細胞（C3H/He マウス）細胞シートを糖尿病マウス（雄、C57BL/6N）の全厚 6 mm の背部皮膚欠損に移植し、各創傷を 0 日目、1 日目、 3、5、7、9、11、および 13 (n = 6、図 5a、b)。 5日目の創傷閉鎖率は、自家ドライシート治療群および同種異系ドライシート治療群の方が無治療対照群よりも有意に高かった（自家ドライシートおよび同種異系ドライシート群対無治療対照群：74.2±5.0%） P < 0.05] および 80.0 ± 4.9% [P < 0.01] 対 51.0 ± 7.2%)、7 日目 (自家乾燥シートおよび同種異系乾燥シート 対 無処置: 95.8 ± 2.1% [P < 0.01] および 90.0 % ± 4.0% [P < 0.05] vs. 72.4 ± 5.7%)、および 9 日目 (自家乾燥シート vs. 無処理: 99.4 ± 0.5% [P < 0.01] vs. 91.0 ± 2.4%;図 5c 、d）。

乾燥保存多層線維芽細胞シートの治療効果。 (a) 自家細胞シート移植療法の 0、1、3、5、7、9、11、および 13 日目の創傷の代表的な肉眼画像。 自己線維芽細胞（C57BL/6Nマウス）により作製したリビングシート群、ドライシート群、FTシート群を、糖尿病雄C57BL/6Nマウスの6mm背部全層皮膚創傷閉鎖モデルの皮膚欠損上に転写した。 対照は治療を行わないことを示します。 (b) 同種細胞シート移植療法の 0、1、3、5、7、9、11、および 13 日目の創傷の代表的な肉眼画像。 同種線維芽細胞（C3H/Heマウス）により作製したリビングシート、ドライシート、FTシート群を、糖尿病雄C57BL/6Nマウスの6mm背部全層皮膚創傷閉鎖モデルの皮膚欠損部に転写した。 対照は治療を行わないことを示します。 (c) 生体シート (n = 6)、乾燥シート (n = 6)、FT シート (n = 6) および対照 (無治療) 群 (n = 6) による自家細胞シート移植療法の創閉鎖率）。 創傷閉鎖率は、示された時点における初期創傷面積のパーセンテージとして計算されました。 エラーバーは標準誤差を示します。 値は平均 ± SE (*P < 0.05、**P < 0.01、Tukey-Kramer 検定) として表されます。 (d) 生体シート(n=6)、乾燥シート(n=6)、FTシート(n=6)、対照群(無治療)群(n=6)による同種細胞シート移植療法の創閉鎖率）。 創傷閉鎖率は、示された時点における初期創傷面積のパーセンテージとして計算されました。 エラーバーは標準誤差を示します。 値は平均 ± SE (*P < 0.05、**P < 0.01、Tukey-Kramer 検定) として表されます。

各細胞シートの移植後30日後に得られた組織標本を観察すると、無治療群と比較して、自家細胞と同種異系細胞の両方を使用したすべての細胞シート移植群で創傷治癒後の組織に異常所見は見られませんでした（補足図S4）。 。

創傷治癒中の同種ドライシートの位置を調査しました。 シートのコラーゲン線維がアザン染色によって青色に染色されたため（図1d）、乾燥シートは適用部位の青色領域と区別されました（図6b、d）。 移植から 1 日後、乾いたシートが傷全体を覆いました (図 6a、c)。 乾燥したシートには、好中球またはマクロファージと思われる白血球が浸潤していました。 浸潤した白血球とシートとでは核の色に明らかな違いがあった。 HE染色を使用すると、浸潤した白血球の核がはっきりと見えましたが、乾燥シート由来細胞の核は、移植後の時間の経過とともにかすかに不明瞭に染色されました（補足図S5）。 乾燥シートの移植後 3、5、および 7 日目では、移植 1 日後と比較して、アザン染色では「折り畳まれた」シート状構造と崩壊が示されました。 乾燥シートは形成されたかさぶたまたは表皮の直下に存在し、9日目の断面からは確認できませんでした。対照的に、無治療対照群ではシート状構造は観察されませんでした（図6e、f） ）。

ドライシート移植後の治療経過の組織学的分析。 (a) 1、3、5、7、9 日目の乾燥シートを移植したマウス皮膚創傷の HE 染色断面図 (スケール バー = 500 μm)。 黒い矢印は新生上皮の端を示しています。 (b) 1、3、5、7、9 日目の乾燥シートを移植したマウス皮膚創傷のアザン染色断面図 (スケール バー = 500 μm)。 黒い矢印は新生上皮の端を示しています。 (c) 1、3、5、7、9 日目の (a) の四角で囲まれた画像 (スケール バー = 50 μm)。 白い矢印は乾燥したシートを示します。 (d) 1、3、5、7、9 日目の (b) の四角で囲まれた画像 (スケール バー = 50 μm)。 白い矢印は乾燥したシートを示します。 HE: ヘマトキシリン・エオシン。 （ e ）1、3、5、7および9日目の無治療群のマウスの皮膚創傷のHE染色断面図（スケールバー= 500μm）。 黒い矢印は新生上皮の端を示しています。 （ f ）1、3、5、7および9日目の無治療群のマウスの皮膚創傷のアザン染色断面図（スケールバー= 500μm）。 黒い矢印は新生上皮の端を示しています。

興味深いことに、組織学的観察により、ドライシート治療が創傷治癒を促進することが示されました。 移植後3日目に、同種異系ドライシート治療グループは、無治療グループと比較して、創傷端のケラチノサイト層と微小血管の数の大幅な増加を示しました（補足図S6a-d）。 創傷治癒の肉眼的観察（図5b、d）によれば、移植後5日目と7日目の新上皮の長さは、無治療対照群と比較して、同種異系ドライシート治療群で有意な延長を示しました。 （補足図S6e–h）。

乾燥シートに含まれる成長因子の保存安定性を調べるため、同時に作製した乾燥シートを用いて保存温度と保存期間を検討した。 乾燥したシートを冷蔵温度 (4 °C) および室温 (23 °C) で 1 日間、および 1、2、または 4 週間保管しました。 次に、各乾燥シートを培地に 24 時間浸漬して溶出液を調製し、測定まで -30 °C で保存しました。 VEGFおよびHGFの濃度は温度や保存期間によって大きな変動は見られませんでしたが、FGF-2およびHMGB1の濃度は室温で4週間の保存期間中に徐々に減少しました（図7）。 これらの結果は、冷蔵保存が乾燥シートに適しており、少なくとも 4 週間は安定であることを示しています。

乾燥シートの保存安定性の調査。 同時に調製した乾燥シートを冷蔵温度 (4 °C) および室温 (23 °C) で 1 日、1 週間、2 週間、または 4 週間保存した後、各乾燥シートを 200 μL CTS に浸して溶出液を調製しました。 10% FBS を含む AIM-V を正常酸素圧条件 (37 °C、5% CO2、20% O2) で 24 時間処理し、測定まで -30 °C で保存しました。 溶出サンプルの上清中のVEGF、HGF、FGF-2、およびHMGB1の濃度をELISAにより測定した。 1D: 保管期間は 1 日です。 1W：保存期間1週間。 2W：保存期間2週間。 4W：保存期間4週間。 値は平均値 ± SD (*P < 0.05 対 1D 4 ℃、**P < 0.01 対 1D 4 ℃、†P < 0.05 対 1D 23 ℃、††P < 0.01 対 1D 23 ℃、ダネット検定、n = グループあたり 4 人)。

細胞シート移植療法では、最も重要なエフェクターは生細胞であり、それらが生み出す因子によって治療効果が得られると理論化されています。 この理論によれば、これまでの研究では、細胞シートが、創傷治癒を促進する、VEGF、HGF、トランスフォーミング成長因子-β1、単球走化性タンパク質1などのさまざまな成長因子やサイトカインを産生することが示されています7,9。 したがって、生存不能な乾燥シートは継続的に成長因子を分泌せず、限られた範囲でしか創傷治癒を促進できないことが一般に受け入れられています。 驚くべきことに、私たちのデータは、自家細胞または同種異系細胞を使用した乾燥シートが、生シートよりも効果が著しく低いわけではなく、無治療の対照群と比較して創傷治癒を大幅に促進することを示しました（図5）。 これは、乾燥シートと FT シートの違いを考慮すると、乾燥シートから放出された生理活性物質によって引き起こされた可能性があります。

私たちは、VEGF、HGF、FGF-2、HMGB1などの成長因子やサイトカインが、生きたシートと同様に乾燥シートの細胞にも同量保存されており、これらの物質が細胞から溶液中に容易に放出されることを発見しました（図3a、b)。 注目すべきことに、細胞質のFGF-2と核のHMGB1は生きたシートから分泌されず、乾燥したシートから放出されました（図3b）。 線維芽細胞増殖アッセイのインビトロ試験により、乾燥シート溶出液が生きたシート溶出液よりも強い生物活性を示すことを確認しました（図4a）。 さらに、溶出液は線維芽細胞を刺激し、VEGFおよびHGFの産生を促進しました（図4b〜d）。これは、乾燥シートから放出された物質が直接的および間接的に創傷治癒と血管新生を促進することを示唆しています。

高レベルの FGF-2 が乾燥シートから培地中に放出され、生物活性に関与しました。 FGF-2 は強力な成長因子であり、創傷治癒と血管新生の促進に重要です 16。 FGF-2 は線維芽細胞で高度に発現していますが、分泌シグナルペプチドが欠如しているため、その細胞外分泌は一般に非効率的です。 したがって、主な FGF-2 放出は損傷した細胞または死んだ細胞から行われます 17、18、19、20。 間葉系間質細胞（MSC）移植療法に関する以前の研究では、損傷した移植MSCから放出される高レベルのFGF-2が血管新生と神経新生を刺激することが示されました20。 その後、細胞シートから分泌されるエフェクターとしてのFGF-2に関する報告はない。 この研究では、乾燥シート溶出液が線維芽細胞の増殖活性を促進し、これがFGF-2中和抗体によって顕著に抑制されたことを実証しました（図4f）。 これらの発見は、乾燥シートからの FGF-2 の放出が創傷治癒と血管新生の促進に重要な役割を果たすことを示唆しています。

糖尿病マウス皮膚創傷モデルを用いた in vivo 実験では、13 日目の乾燥シート群と対照群の間で創傷閉鎖に差がなかったことが示されました。しかし、5 日目の肉眼観察による創傷閉鎖率には有意な差が見られました。 、治療後 7、および 9 日目 (図 5)。 治療後5日目と7日目に、組織学的に、ドライシートグループで上皮化が大幅に増加し（補足図S6e–h）、治療後3日目の創傷端の微小血管の数とケラチノサイトの成長には有意な差がありました。 （補足図S6a〜d）。 これらの発見は、成長因子が移植後の初期段階で乾燥シートから放出され、それらが線維芽細胞と、ケラチノサイトや血管内皮細胞を含む創傷周囲細胞の両方を直接的および間接的に刺激し、それが創傷治癒を促進した可能性があることを示している。 ECMを含むシート状構造体が外的要因から傷を保護しているように見えることを観察しましたが（図6）、シート構造体内での細胞増殖は確認できませんでした。 この研究で使用した細胞シートの特性と考えられる作用機序を図8にまとめます。

各細胞シートの創傷治癒効果のメカニズムの模式図。 リビングシートは創傷に貼付した後に生着することで最も大きな治療効果が得られると考えられていました。 リビングシートが生きている間は、大量の成長因子が分泌され続けるパラクリン効果により、創傷治癒が促進されました。 乾燥したシートを傷に移植すると、さまざまな成長因子が一時的に放出され、血管新生や傷周囲の細胞の活性化を刺激すると考えられています。 さらに、すべての細胞シートには ECM が保持されており、これが創傷を保護することで創傷治癒を促進した可能性があります。 このような作用機序の違いにより、創傷治癒促進の順位は、リビングシート＞ドライシート＞FTシートとなった。 ECM:細胞外マトリックス。

乾燥シート溶出液を過剰量のFGF-2中和抗体で処理すると、細胞増殖はコントロールと同程度に抑制された。 しかし、乾燥シート溶出液に対する細胞増殖応答は、rFGF-2単独に対する細胞増殖応答よりも有意に高かった(図4f)。 この結果は、FGF-2 以外の物質も細胞増殖に影響を与える可能性があることを示しています。 さらなる研究が必要であるが、総称してアラーミンとして知られ、防御因子として作用し 21,22、創傷治癒の促進に関与する HMGB1 などの核物質も乾燥シートから放出されることを示唆している。複数の要因が協調して作用して、創傷治癒を促進する可能性があります。

私たちの以前の研究では、マウス皮膚潰瘍モデルに移植された生体シートは、自家および同種の両方で、ルシフェラーゼ発現線維芽細胞の in vivo イメージングの 9 日目までに消失しました。 同様に、創傷治癒過程の組織学的観察により、上皮化中は同種異系乾燥シートが表皮層の下に位置していたが、9日目の上皮化完了後の組織標本には乾燥シートが残っていなかったことが示された（図6）。 乾燥シートは自然に分解され、浸潤した白血球によって吸収されたことが示唆された。 ヒトへの同種移植を想定したマウス潰瘍モデルにヒト由来表皮細胞シートを用いた以前の研究では、シートが創傷治癒過程で生体外に排泄されることが確認された27。 このことから、線維芽細胞由来ドライシートは分解・吸収されるため、体表だけでなく内臓にも使用できることが示唆されました。 以前、我々は動物モデルにおける術後の気管支瘻および膵臓瘻に対する多層線維芽細胞シートの有効性も実証した28,29。 さらに、乾燥シートは、組織修復を促進し、さまざまな術後の合併症を防ぐための生物学的コーティング材料としても使用できます。

ここで、冷蔵ドライシートに保持された生理活性物質は少なくとも１ヶ月は安定であり、室温で保存しても一部の生理活性物質は保持されていることを確認した（図７）。 今回のマウス実験では室温で7日以内に保存したドライシートを使用しましたが、ドライシート治療群は無治療群に比べて有意な創傷治癒促進効果を示しました。 in vitro での保存安定性試験により、FGF-2 の量が保存温度に影響を受けることが判明したため、保存温度を厳密に管理することでより高い治療効果が期待できると考えられます。

ドライシートは、ある程度の剛性を保ちながらシート状の構造を維持するため、細胞シート移植治療に必要なサポートなしで使用でき、取り扱いが容易であるという利点があります（補足図S1）。 いくつかの乾燥羊膜シートが皮膚潰瘍の治療にすでに使用されています30。 線維芽細胞由来ドライシートは、材​​料入手の安定性やドナーによる感染症に対する安全性の点で利点がある。 当社のドライシートは単一素材から量産できるため、安定供給と均一な品質が得られます。

制限として、我々の以前の研究5、6、7に従って、この研究で使用したすべての細胞シートは、低酸素プレコンディショニングの処理が線維芽細胞の分泌能力を高めるのに効果的であるため、低酸素プレコンディショニングされた多層線維芽細胞細胞シートから製造されました。 この研究の前に、私たちは乾燥シートが生きたシートによって分泌されるのと同じ成長因子を通じて創傷治癒効果をもたらすのではないかという仮説を立てました。 しかし、従来の細胞シートの作用機序とは異なり、生シートでは分泌されない乾燥シートからのFGF-2の放出が創傷治癒に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。 したがって、乾燥シートに保持された成長因子に対する低酸素プレコンディショニングの影響については、今後調査する必要があります。

結論として、これは、皮膚潰瘍に対する同種異系ドライシートの創傷治癒能力が自家ドライシートに匹敵することを実証した最初の研究である。 重要なことは、乾燥シートが細胞から FGF-2 などの生理活性物質を保持および放出して、創傷治癒を促進することを発見したことです。 ドライシートは冷蔵・常温保存が容易で、迅速かつ安定供給が可能です。 したがって、同種異系ドライシートは、皮膚潰瘍を治療するための有用なツールとなる。

この研究におけるすべての実験は、関連するガイドラインと規制に従って実行されました。 すべての動物手順は ARRIVE ガイドラインに従って実施され、山口大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました (承認番号 31-093)。

雄の C57BL/6N および C3H/He マウス (6 週齢) を日本 SLC (静岡県) から購入しました。 動物は、温度 (22 ± 2 °C)、湿度 (70 ± 20%)、光 (12 時間の明暗サイクル) が制御された部屋で飼育され、餌と水は自由に摂取できました。

コラゲナーゼ (富士フイルム和光純薬株式会社、大阪、日本) を使用してマウスの尾皮膚から線維芽細胞を単離し、10% ウシ胎児血清を含む CTS™ AIM-V™ 培地 (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) で培養しました。 FBS; サーモフィッシャーサイエンティフィック)。 CTS™ AIM-V™ および HFDM-1 (+) からなる 2 mL 培地を使用して、初代線維芽細胞を通常の 24 ウェル プレート (4.2 × 105 細胞/ウェル) に播種しました (細胞科学研究所、仙台、日本) 5% FBS を添加し、正常酸素条件 (37 °C、5% CO2、20% O2) で 2 日間インキュベートした後、低酸素条件 (33 °C、5% CO2、2% O2) で 1 日間インキュベートしました。低酸素プレコンディショニングの治療5、6、7。 インキュベーション後、多層線維芽細胞シートを 2 mL リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 2 回リンスし、500 μL のディスパーゼ溶液 (10 PU/mL、富士フィルム和光) とともに正常酸素条件下で 30 分間インキュベートしました。 ＰＢＳで２回洗浄した後、多層の線維芽細胞シートを培養プレートから静かに剥がした。 これらのシートを本研究におけるリビングシートとして使用した。

風乾はバイオクリーンベンチ（CCV-1300E、株式会社日立製作所、東京）内で行い、ガスバーナーの種火が中央で作動し、クリーンな運転が維持できました。 1000 μL ワイドボアチップを使用してリビングシートをシリコン台座に移し、しわを避けるために広げました。 できるだけ水分を取り除いた後、３０分間放置した。 乾燥させた細胞シートをピンセットでシリコンから剥がし、1.5mLマイクロチューブに移した。 移植実験では、乾燥シートを室温 (23 °C) で保管し、調製後 1 週間以内に使用しました。 保存安定性の実験では、乾燥したシートを乾燥剤とともに冷蔵温度 (4 °C) または室温 (23 °C) で保存しました。

リビングシートを含む 24 ウェル培養プレートを密閉可能なビニール袋に移し、ディープフリーザー (-80 °C) に 60 分間置き、続いてインキュベーター (37 °C) で 90 分間解凍しました。 凍結融解を３回繰り返して細胞膜を破壊し、２ｍＬのＰＢＳで２回洗浄してＦＴシートを得た。 FT シートは 3 回目の冷凍サイクル (-80 °C) 後、使用するまで保管されました。

1000μLワイドボアチップを用いて8枚の生体シートをプラスチックプレート上に転写し、バイオクリーンベンチに設置された天秤XS104（メトラー・トレド社）を用いて重量変化を毎分測定した。 3 つの独立した実験が実行され、乾燥速度が計算されました。 バイオクリーンベンチ内の環境条件は、HYGROPALM-HP32 (Rotronic、Bassersdorf、スイス) と INFURIDER ハンディ風速計 (AP-816B、AOPUTTRIVER) を使用して測定されました。

乾燥したシート 50 枚の総重量を測定し、シートを 2 mL のメタノールに 2 時間浸漬しました。 メタノール中の水の量は、カールフィッシャー法 (日本試験研究所、大垣、日本) を使用して測定されました。 カールフィッシャー法は２回実施した。

未固定の細胞シートをDAPI（同仁堂、熊本、日本）で染色した。 画像は、BZ-X710 顕微鏡 (Keyence、大阪、日本) を使用して取得されました。

個々のリビングシートを 5、10、15、30、45、または 60 分間風乾し、すぐに 500 μL の PBS に室温で 30 分間浸漬しました。 各細胞シートの上清中のLDHは、LDH細胞毒性検出キット（同仁堂）を用いて、500μLの細胞溶解緩衝液に浸漬した生細胞シートをポジティブコントロール、PBSをネガティブコントロールとして測定した。

30 分間乾燥させて得られたリビングシートとドライシートを、10% FBS を含む 2 mL CTS™ AIM-V™ を含む別の 12 ウェルプレートに移し、正常酸素条件下で 24 時間培養しました。 細胞シートは位相差光学顕微鏡を用いて観察した。 再培養した細胞シートの細胞代謝活性を次のように分析しました。培養上清を除去した後、10% [2-(2-メトキシ-4-ニトロフェニル)- を含む 10% FBS を含む 1 mL CTS™ AIM-V™ [3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H-テトラゾリウム、モノナトリウム塩] (WST-8) 試薬 (Cell Count Reagent SF、ナカライテスク株式会社、京都、日本) をそれぞれに添加しました。ウェルに入れ、正常酸素条件下で３時間インキュベートした。 上清の吸光度を450nm（基準波長：630nm）で測定した。

詳細なプロトコルは以前に説明されています7。 簡単に説明すると、細胞シートを CellShifter (CellSeed Inc.、東京、日本) に転写して組織切片を調製しました。 単離した皮膚組織または細胞シートを 10% ホルマリン中性緩衝液で固定し、パラフィンに包埋しました。 厚さ 3 マイクロメートルの切片をスライドにマウントし、ヘマトキシリン エオシン (HE) またはアザンで染色しました。 免疫染色は、抗コラーゲン I (1:200、ab34710、Abcam、ケンブリッジ、英国)、抗 FGF-2 (1:30、ab208687、Abcam)、および抗 HMGB-1 (1:200、ab34710、Abcam、ケンブリッジ、英国) に対するウサギ一次抗体を使用して実行されました。 400、ab79823、アブカム）、ウサギ抗CD31抗体（1：200、ab28364、アブカム）、およびDyLight550結合ヤギ抗ウサギIgG（H&L）の二次抗体（1：200、ab96884、アブカム）。 DAPI を使用して細胞核を染色しました。 すべての組織学的画像は、BZ-X710 顕微鏡によって取得され、BZ-X アナライザー (Keyence) を使用して分析されました。 すべての組織学的分析は病理学者によって行われました。

細胞シートを蓋を密閉した状態で 1.5 mL マイクロチューブに浸漬しました。 細胞シート内のサイトカインレベルを測定するために、各細胞シートを 200 μL の Cell Lysis Buffer 2 (R&D Systems, Inc.、米国ミネソタ州ミネアポリス) に室温で 30 分間浸漬しました。 細胞シートから放出されたサイトカインレベルを測定するために、各細胞シートを 10% FBS を含む 200 µL CTS™ AIM-V™ に正常酸素圧条件 (37 °C) で 24 時間浸漬しました。 インキュベーション後、サンプルを 2460 xg、4 °C で 5 分間遠心分離し、上清を収集し、測定まで -30 °C で保存しました。 上清中の VEGF、HGF、FGF-2、および HMGB1 の濃度は、それぞれ Quantikine Immunoassay Kits (R&D Systems) および HMGB1 ELISA Kit Exp (SHINO-TEST CORPORATION、神奈川県、日本) を使用して、製造業者の指示に従って測定しました。

溶出液サンプルは、正常酸素圧条件下で、FBSを含まない200μLのDMEM（Thermo Fisher Scientific）に各細胞シートを24時間浸漬することによって調製しました。 遠心分離（2460×g、4℃、5分間）後、上清を回収した。 線維芽細胞を、10% FBSを含む100μLのDMEM中に8000細胞/ウェルで96ウェルプレートに播種し、続いて100μLの溶出サンプルまたはFBSを含まないDMEMを添加した。 線維芽細胞を含まない溶出液サンプルとして、10% FBSを含むDMEMで2倍に希釈した各溶出液サンプルを用いた。 正常酸素圧条件下で48時間インキュベートした後、VEGFおよびHGFの測定のために培養上清を収集し、続いて細胞増殖アッセイを行った。 10% WST-8 試薬 (Cell Count Reagent SF) を含む 5% FBS を含む DMEM (100 μL) を各ウェルに添加し、正常酸素条件下で 1 時間インキュベートしました。 上清の吸光度を450 nmで測定した。 DMEM中で培養した線維芽細胞を対照として細胞増殖率を計算した。 培養上清中のＶＥＧＦおよびＨＧＦの濃度をＥＬＩＳＡにより測定し、次式により産生率を算出した：［（溶出液サンプルと培養した線維芽細胞の上清）−（線維芽細胞を除いた溶出液サンプルの上清）］／（上清） DMEMで培養した線維芽細胞の結果）。 3 つの独立した実験を 3 回繰り返して実行しました。

乾燥シート溶出サンプルは、上記の細胞増殖分析と同じ手順で調製されました。 rFGF-2（0または5ng/mL、富士フイルム和光）を含むDMEMも調製した。 これらのサンプルを、抗 FGF-2 中和抗体 (30.3 μg/mL、#05-117、クローン bFM-1、Merck Millipore、ダルムシュタット、ドイツ)、またはコントロール抗体 (マウス) とともに 37 °C で 60 分間インキュベートしました。 IgG1 アイソタイプ コントロール、クローン 11711、30.3 μg/mL、MBA002、R&D Systems)。 線維芽細胞を96ウェルプレートに1% FBSを含むDMEM 100μL中、ウェルあたり8000細胞で播種し、続いて抗体を含む溶出液サンプル、またはrFGF-2（0または5ng/ng/ml）を含むDMEMのいずれかを100μL加えた。 mL) と抗体。 正常酸素条件下で 48 時間インキュベートした後、培養上清を吸引し、細胞増殖アッセイを実行しました。 10％細胞数試薬SFを含む0.5％FBSを含むDMEM（100μL）を各ウェルに添加し、正常酸素条件下で2時間インキュベートした。 上清の吸光度を450 nmで測定した。 細胞増殖率は、対照抗体を用いて0 ng/mL rFGF-2中で培養した線維芽細胞を対照として計算した。 3 つの独立した実験を 3 回繰り返して実行しました。

雄の C57BL/6N マウスに、55 mg/kg のストレプトゾトシン (STZ; FUJIFILM Wako) を 24 時間ごとに 5 日間連続して腹腔内投与しました。 STZ投与後9日目および10日目の血糖値が300 mg/dL以上のマウスを糖尿病マウスとして分類した。 STZの最後の投与から14日目に、糖尿病マウスに皮膚潰瘍を作製した。 雄の C57BL/6N マウスを 2% イソフルランの吸入で麻酔し、生検パンチを使用して背側皮膚に全層 6 mm の皮膚欠損を作成しました (グループあたり n = 6)。 リビングシートとFTシートは1000μLのワイドボアチップを使用して皮膚欠損上に転写され、乾燥シートはピンセットを使用して処理されました。 各細胞シートは、雄 C57BL/6N マウス (自家) および雄 C3H/He マウス (同種) から調製されました。 すべての傷はADAPTIC（#2012; Acelity、テキサス州サンアントニオ、米国）およびDerma-aid®（ALCARE、東京、日本）で覆われ、最初の24時間はSilkytex包帯（#11893; ALCARE）で固定されました。 初日は、すべての傷をエアウォールふわり（# MA-E050-FT; Kyowa、大阪、日本）で覆い、Silkytex 包帯 9 を使用して固定しました。 各創傷は、0、1、3、5、7、9、11、および 13 日目にデジタル カメラを使用して写真撮影されました。各写真は直径 10.5 mm の測定値で正規化され、各創傷を手動で追跡して創傷面積を測定しました。 ImageJ ソフトウェア (NIH、ベセスダ、メリーランド州、米国) を使用したエッジ。 創傷閉鎖率は次のように計算されました: [X 日目] (%) = {1 − (創傷面積 [X 日目] / 創傷面積 [0 日目])} × 100。 乾燥したシートは室温 (23 °C) で保管されました。 ) を調製し、調製後 1 週間以内にこの実験に使用しました。

結果は、別段の指示がない限り、平均値 ± 標準偏差として表示されます。 統計的差異は、一元配置分散分析に続いて、グループ間の多重比較については Tukey-Kramer 検定、または対照グループに対する複数グループの比較については Dunnett 検定のいずれかによって評価されました。 2 つのグループ間の統計的比較のために、スチューデントの t 検定を実行しました。 データは、Statcel (Microsoft Excel 用アドイン ソフトウェア、OMS Ltd.、日本) で統計的に分析されました。 統計的有意性は P < 0.05 に設定されました。

現在の研究中に生成および分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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技術支援をしていただいた弘中ゆかり氏と池本賢三氏に感謝いたします。 この研究は、JSPS 科学研究費補助金 (C) (MY への 21K08845、RS への 22K08960) および AMED の助成番号 JP21lm0203008 (KH へ) の支援を受けました。

山口大学大学院医学系研究科外科学・臨床科学教室

Yutaro Matsuno, Masashi Yanagihara, Koji Ueno, Toshiro Saito, Hiroshi Kurazumi, Ryo Suzuki, Shunsaku Katsura & Kimikazu Hamano

山口大学大学院医学系研究科分子病理学分野

Atsunori Oga

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YM、MY、TS、KU、RS、SK、KH は実験の構想と設計に貢献しました。 YM、MY、HK、RS が実験を行いました。 YM、MY、KU、RS、AO、KH がデータを分析しました。 YM 氏、MY 氏、HK 氏、RS 氏がそれぞれ試薬、材料、分析ツールを提供してくれました。 YM、MY、RS、SK、AO、KHが原稿を書きました。 著者全員が結果について議論し、原稿を承認しました。

Correspondence to Masashi Yanagihara.

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

松野 裕也、柳原 正樹、上野 和也 他乾燥保存された多層線維芽細胞シートは、創傷治癒を促進する再生医療のための新しい管理可能なツールです。 Sci Rep 12、12519 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-16345-6

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受信日: 2022 年 3 月 9 日

受理日: 2022 年 7 月 8 日

公開日: 2022 年 7 月 22 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16345-6

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