真菌β

Mar 14, 2023

Communications Biology volume 6、記事番号: 576 (2023) この記事を引用

477 アクセス

6 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ヒトの腸内細菌叢 (HGM) は非常に複雑な微生物のネットワークで構成されており、微生物は宿主と相互作用し、それによって宿主の健康と幸福に影響を与えます。 β-グルカンは、バクテロイデス属およびビフィドバクテリウム属のメンバーを含む特定の腸関連細菌の増殖をサポートする食餌性多糖類として確立されており、後者は有益な細菌またはプロバイオティクス細菌を代表すると考えられています。 しかし、腸内共生生物によるβ-グルカン代謝を支える正確な機構は完全には理解されていません。 我々は、マイコプロテインがβ-グルカンの優れた供給源であり、Bacteroides cellulosilyticus WH2などの特定のバクテロイデス種が一次分解者として消費することを示します。 後者の細菌は、グリコシドヒドロラーゼファミリー 30 および 157 に属する 2 つの細胞外エンド作用酵素を使用して、マイコタンパク質由来の β-グルカンを分解し、それによって増殖培地にオリゴ糖を放出します。 これらの放出されたオリゴ糖は、ビフィズス菌やラクチプランチバチルスなどの他の腸内微生物によって利用され、二次分解者として機能します。 私たちは、交雑給餌アプローチを使用して、両方の種が共培養でどのように成長できるかを追跡しました。

ヒトの腸内細菌叢 (HGM) は微生物の複雑な生態系であり、人間の健康に有益な影響を与えると考えられています。 食事の炭水化物は人体の主なエネルギー源ですが、私たちはこれらのグリカンのほとんどを自分自身で分解する酵素能力を持っていません1。 しかし、HGM は、そのような炭水化物を異化することができる炭水化物活性酵素 (CAZYme) の兵器庫をコードしています1。 HGM によるグリカン発酵の最終代謝産物は、ほとんどがプロピオン酸、酢酸、酪酸などの SCFA であり、人間の宿主にさまざまな有益な効果をもたらします。 腸内微生物群集の組成の不均衡は、腸内細菌叢の異常とも呼ばれ、炎症性腸疾患 (IBD)、結腸直腸がん、肥満、クロストリディオイデス ディフィシル感染症、および潜在的にはその他の幅広い疾患の特徴です2、3、4。

上で述べたように、HGM は約 10 兆個の細菌を表す微生物の複雑なネットワークです5。 それにもかかわらず、この複雑な細菌群集では、バクテロイドタとバシロタの 2 つの門だけが優勢であり、放線菌やヴェルコクロビオタなどのいくつかのマイナーな門の代表によって補完されています。 バクテロイデス属のさまざまなメンバーは、特定のグリカンを代謝し、多糖利用遺伝子座 (単数形: PUL、複数形: PUL) と呼ばれる、同時制御される遺伝子の特定のクラスターを含むことが示されています。 特定の PUL には、特定のグリカンを感知、輸送、分解するために必要な遺伝子が含まれています6、7、8。 たとえば、CAZY データベースによると、バクテロイデス シータイオタオーミクロン (Ba. シータイオタオーミクロン VPI-5482、BT) ゲノムには 96 の異なる PUL が含まれています 9,10。 ovatus ATCC8483 (Bacova)、115 の異なる PUL が含まれています。 一般に、細胞表面関連グリコシドヒドロラーゼ (GH) または多糖リアーゼ (PL) は細胞外多糖分解を開始し、生成したオリゴ糖を増殖培地に放出します 11、12、13、14、15、16、17。

ビフィズス菌属のメンバーは、母乳で育てられた満期産の乳児に特に豊富に存在し、重要な有益な効果を発揮すると考えられています18、19、20、21。 このニッチにおけるこれらの細菌の優位性は、少なくとも部分的には、唯一の炭素源およびエネルギー源として（特定の）母乳オリゴ糖（HMO）を代謝する能力に起因すると考えられます22。 Bi の菌株など、異なるビフィズス菌種には特定の HMO 消費の好みがあります。 ブルベとビ。 ロンガムはラクト-N-テトラオースを内部に取り込んで代謝することが知られています23,24,25,26。 カテヌラタム亜種。 カシワノヘンセは 2-フコシルラクトースを炭素源として使用できます 19,27。 原型株Bi。 breve UCC2003 は、いくつかの HMO およびその他の食餌性ポリ/オリゴ糖を、それ自体で、または腸内細菌叢の他のメンバーを巻き込んだ交差摂食を通じて代謝することが示されています。 このような糖基質の例は、ムチン 29,30、アラビノガラクタン/ガラクタン 31,32 およびシアリルラクトース 20 です。

β-グルカンは、潜在的なプレバイオティクスとして研究されている複合グリカンであり、特に穀物や真菌の細胞壁に豊富に含まれています13、33、34、35、36。 特定のβ-1,3/1,4混合結合を持つ穀物由来のβ-グルカン（図1A）は、特定のバクテロイデス種がこれを感知し、内部移行し、分解する分子機構を理解するために使用されています。ポリマー13、34、35、36。 例えば、Bacova は、細胞表面関連グリコシド加水分解酵素 16 (GH16) およびペリプラズム GH3 を含む PUL を使用して、この混合結合穀物 β-グルカンの分解を触媒します 34,35,36。

A 真菌 (マイコプロテイン)、酵母、ラミナリン、大麦、およびプスツラン β-グルカンの構造。 B プレートリーダーで測定したマイコプロテイン上のバクテロイデス・オヴァトゥス、DSM、WH2、およびBTの増殖。 すべての増殖は 3 つの異なる独立した反復で生成されました (n = 3)。 C プロテオーム分析によって同定された、マイコプロテイン由来のβ-グルカンの使用によりBaccell WH2によって発現されたタンパク質の数。 プロテオミクスは 3 つの異なる独立した複製 (n = 3) で作成されました。 D マイコプロテイン、酵母菌およびプスツランに作用する Baccell WH2 (GUL-1 および GUL-2) および BT の GUL 構造。

さらに、Ba. uniformis ATCC8492 PUL は、酵母および海藻グルカン ラミナリンに存在する関連する β-1,3-グルカンの代謝に関与しており (図 1A)、グリコシド加水分解酵素 16 (GH16) による細胞表面での初期分解を担っています。 ）およびGH158、およびその後に作用するペリプラズムGH313。 さらに、Ba. ユニフォームイス JCM13288 株は、GH16、GH30、GH158、および GH3 をコードする 2 つの PUL を使用し、他の腸内細菌叢のメンバーとオリゴ糖を共有することで、ラミナリン、プスツラン、およびポルフィラン β-グルカンを分解でき、腸内恒常性をサポートしている可能性があります 37。

別のタイプのβ-1,6-グルカンは、苔癬ラサリア・プスチュラータでは直鎖状グルカンとして、また酵母サッカロミセス・セレビシエまたはアーモンドマッシュルーム（アガリクス・ブラゼイ）では直鎖状グルカンとして他の細胞壁成分と架橋結合している。は、表面に位置する GH30_3 とペリプラズム GH317,33 のみを含む PUL を通じて BT によって使用されます。 Quorn® が機能性食品成分として採用している真菌である Fusarium v​​enenatum によって生成されるマイコプロテインに由来するものなど、真菌の β-グルカンの分解についてはほとんど知られていません 38。 この β-グルカンの化学構造は、β-1,6-グルカンの側鎖を運ぶ直鎖状 β-1,3-グルカン主鎖で構成されており、穀物の β-グルカンや酵母の β-グルカン/ラミナリンとは異なります。ここで、コア鎖または側鎖結合のいずれかがそれぞれ異なります 13、34、39 (図 1A)。

現在、Bacteroidota によって引き起こされる健康上の利点を記載した出版物はわずかしかありません (実際、一部の種は日和見病原体と考えられています)40,41。 しかし、特定のバクテロイデス種は、ビフィズス菌（β-グルカンを直接代謝できるかどうかは知られていない）など、微生物叢の他の有益なメンバーによる炭水化物の交差摂食を可能にする主要なグリカン分解者であるというケースが考えられます。 このような代謝相互作用は、BT と Bi の間で発生します。 ロンガムとBaの間。 cellulosilyticus DSMZ14838 (Baccell DSMZ) および Bi。 カラマツのアラビノガラクタンタンパク質 (AGP) を唯一の炭素源として栽培した場合の UCC2003 を作成します 31,42,43。 他の栄養相互作用は、バクテロイデス属とビフィズス菌のさまざまな種の間で確立されています 39,44,45,46,47,48 が、マイコタンパク質 β-グルカンについてはまだ定義されていません。

現在の研究では、Bacova, Ba によるマイコタンパク質と酵母の β-グルカン分解の分子特性評価を実行しました。 cellulosilyticus WH2 (Baccell WH2) および BT、これらのバクテロイデス属の PUL 構造を強調しています。 さらに、一次分解者としてのバクテロイデスと、マイコタンパク質由来の真菌β-グルカンの二次分解者として機能する特定の種のビフィズス菌およびラクチプランチバチルスとの間の相互摂食相互作用を発見しました。

バクテロイデス属の特定のメンバーは、混合結合 (大麦) と酵母 β-グルカンの汎用発酵槽として確立されています 13,34,35,36,37。 これらのバクテロイデス種のゲノムには、この複雑なグリカンを分解するためのさまざまな PUL (ここではグルカン利用遺伝子座または GUL と呼びます) が含まれており、この代謝プロセスにはコードされたグリコシド加水分解酵素が使用されます。 真菌由来の β-グルカンを使用するバクテロイデス種の能力を評価するために、フザリウム ベネナタムのマイコタンパク質からこの多糖を抽出し (「材料と方法」を参照)、最も顕著な腸関連バクテロイデス種 23 種の増殖能力をスクリーニングしました。このグリカンおよび酵母由来のβ-グルカンについても同様です（表S1）。 使用される（嫌気的）条件下では、Ｂａ． キシラニソルベンズ、Ba. 腸管、バコバ、Ba。 フラジリス、Ba. ファインゴルディー、Ba. バルガタス、Ba. ユニフォームミス、BT (部分増殖)、ディスゴノモナス ガデイ、D. モッシー、および Baccell の 2 つの株 (Baccell WH2 および Baccell DSMZ) は、マイコタンパク質由来の β-グルカンを代謝することが示されました。 さらに、Ba. バルガタス、Ba. ユニフォームイス、バコバ、BT、ディスゴノモナス ガデイ、D. モッシー、および両方の Baccell 株は酵母の β-グルカンを利用できました。 バコバは、大麦由来のβ-グルカンでも生育することが以前に示されており 34,35 、この種がさまざまな供給源や化学構造からの β-グルカンを発酵させる幅広い能力を示しています（図 1A）。 図 1B は、マイコプロテイン由来の β-グルカン上の Baccell WH2、Baccell DSMZ、BT および Bacova の増殖プロファイルを示します (図 1B)。 これらの増殖実験に加えて、マイコタンパク質由来のβ-グルカン上でのさまざまなビフィズス菌株の増殖を評価したところ、これらの株にはこの複雑な炭素源を使用する能力が欠如していることが明らかに示されました（図S1A）。

特定のβ-グルカン上での選択されたバクテロイデス株​​の増殖をさらに特徴付けるために、炭素源としてグルコース（参照として機能）またはマイコタンパク質由来の真菌β-グルカン上で増殖させた場合のBaccell WH2についてプロテオミクス分析を実行しました。 我々は、この細菌がこれらの炭素源のいずれかで増殖したときに生成されたプロテオーム データを比較し、複合ポリマー上で菌株が増殖したときに発現増加を示すタンパク質を特定しました。 図1Cに示すように、この分析により、2つの割り当てられたGUL（ここではGUL-1およびGUL-2と名付けられ、それぞれ遺伝子座タグBcellWH2_01929-BcellWH2_01932およびBcellWH2_02537-BcellWH2_02542を表す、図1Dを参照）によってコードされるすべてのタンパク質が増加した値を示すことが明らかになった。 Baccell WH2 がマイコタンパク質由来の真菌の β-グルカン代謝で増殖した場合の発現 (グルコースでの増殖と比較した場合)。 GUL-1 は 2 つの GH3 酵素 (BcellWH2_01926 および BcellWH2_01927) と GH157 メンバー (BcellWH2_01931) をコードすると予測され、一方、遺伝子座タグ BcellWH2_01928 および BcellWH2_01929 によってコードされるタンパク質は、(多糖) 基質に関与すると予測される SusC/D 様ペアを表します。細菌細胞表面での結合と認識 (図 1D)。 さらに、BcellWH2_01932 は、GUL-1 の転写制御を制御するハイブリッド 2 コンポーネント システム (HTCS) センシング システムを表すと予測されます。 GUL-2は、GH30_3 (BcellWH2_02537、CAZYデータベースによる予測エンド-β-1,6-グルカナーゼ)、GH2 (BcellWH2_02541)、および機能が不明なタンパク質(BcellWH2_02538)をコードします。 これらのタンパク質に加えて、BcellWH2_02539 および BcellWH2_02540 は、GUL2 の予測された SusC/D ペアを表します (図 1D)。 プロテオミクスデータを確認するために、Baccell WH2を中間指数関数的に増殖させ、上記のGULで同定された選択されたSusC / Dペアに対してRT-qPCRを実行しました（図S1B）。 さらに、我々は、これらの2つの株がpustulan17、34、35からのβ-グルカンで増殖した場合に、差次的発現パターンに基づいて同定されたSusC / Dペアに対してBTおよびBacovaを使用してこのアプローチも使用しました17、34、35（図S1B）。 RT-qPCRに基づいて差次的発現が観察されたため、遺伝子構造および含有量の点でBaccell WH2のGULとは実質的に異なる、対応するGULも真菌のβ-グルカンでの増殖に関与していると考えられます。 図 1D および S1C は、BT、Bacova および Baccell WH2 の GUL 構造、および GUL 調節、β-グルカン分解および関連するオリゴ糖摂取に関連する予測された機能を示しています。 BT と Baccell WH2 は、Bacova と比較すると、真菌の β-グルカン利用に異なる GUL 構造を採用しています (図 1D)。Bacova は、発現プロファイルに基づくと、真菌と大麦の β-グルカンに同じ GUL を使用しているようです。 S1BとS1C。

上で述べたように、BT、Baccell WH2、および Bacova は真菌の β-グルカンを代謝できます。 真菌のβ-グルカンまたはプスツランのいずれかを含む培地で増殖したBTに対して行われたqPCRに基づくと、この細菌はこれら2つの炭素源のいずれかに同じGULを採用しているようです17（BT3309〜BT3314、図1DおよびS1B）。 バコバが大麦または真菌のβ-グルカンのいずれかを補充された培地で増殖しているときに得られたqPCRデータによると（図S1B）、この細菌はこれらの炭素源のいずれかに対して同じGULを使用することが示されました。これは、私たちが発見したものとは対照的です。 Baccell WH2。この細菌は、真菌または大麦の β-グルカンを分解するために異なる GUL を使用しているようです (図 1D および S1C)。

Baccell WH2 の GUL-1 および GUL-2 によってコードされる特定のタンパク質、およびそれらに存在する対応する遺伝子が、真菌の β-グルカン上で増殖するときに発現の増加を誘発するという我々の観察に続き、我々は、この代謝プロセスにおけるそれらの関与を確認したいと考えました。 この目的のために、我々は、GUL1/GUL2から推定上のGH157、GH30_3、およびGH3（Baccell WH2_01926）活性を表す酵素を組換え発現させ、この複雑な食事性炭素源の分解メカニズムを完全に分析しました。 この目的のために、我々は発現したタンパク質を真菌のβ-グルカンとインキュベートし、HPLCクロマトグラフィーによって分解生成物の可能性を明らかにしました。 より具体的には、図２Ａは、真菌β−グルカンに作用するＢｃｅｌｌＷＨ２＿０１９３１およびＢｃｅｌｌＷＨ２＿０２５３７（それぞれ予測されるＧＨ１５７およびＧＨ３０＿３活性を表す）のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

すべての HPLC 実験は 3 つの異なる独立した反復で行われました (n = 3)。 BcellWH2_01931 (GH157) とマイコプロテイン β-グルカンの時間経過。 B 直鎖状 β-1,3-グルカンを含む BcellWH2_01931 (GH157) の時間経過。 C マイコタンパク質 β-グルカンに対する BcellWH2_02537 (GH30_3) の時間経過。 D 膿疱症を伴う BcellWH2_02537 (GH30_3) の時間経過。 E 線状β-1,3-グルカンに対する BcellWH2_01931 (GH157) と BcellWH2_02537 (GH30_3) の時間経過。 F マイコタンパク質 β-グルカンに関する BT3312 (GH30_3) の HPLC。 G マイコタンパク質 β-グルカンに関する BT3314 (GH3) の HPLC。

図 2A および 2B に示したデータは、BcellWH2_01931 が真菌の β-グルカン (図 2A) およびユーグレナ グラシアリス由来の直鎖状 β-1,3-グルカン (図 2B) に作用し、最初に五糖類と三糖類を放出することを確認しました。より長いインキュベーション (16 時間) により二糖類とグルコースに変換されます。 しかし、酵素をプスツランとインキュベートした場合には活性は見つかりませんでした。 表 1 に、いずれかの基質に作用するこのタンパク質の速度論的パラメータ (kcat/Km) を示します。

これらの酵素が真菌のβ-グルカン代謝に関与しているという予測を検証するために、LipoP50によるタンパク質の位置分析を行ったところ、BcellWH2_01931 (GH157) および BcellWH2_02537 (GH30_3) が Baccell WH2 の細胞表面に位置していることが示されました。 さらに、CAZY データベースによれば、GH157 酵素はエンド-β-1,3-グルカナーゼとして作用すると予想され、一方で GH30_3 酵素はエンド-β-1,6-グルカナーゼ活性を有すると予想されました。このCAZYファミリーの他のメンバー17。 GH157 と同様に、組換え発現および精製された GH30_3 を真菌の β-グルカン、直鎖状 β-1,3-グルカンおよびプスツラン (直鎖状 β-1,6-グルカン) とインキュベートし、その後 HPLC 分析しました。 図 2C および 2D は、このインキュベーション実験に関連するクロマトグラフィーの結果を示しており、真菌の β-グルカン (図 2C) およびプスツラン (図 2D) に対する β-1,6-グルカナーゼ活性が確認されています。 さらに、GH30_3 は直鎖状 β-1,3-グルカンに対して活性を示さなかった。 表 1 は、真菌の β-グルカンおよびプスツランを用いた DNSA アッセイによって測定されたこのタンパク質の触媒パラメーターを示しています。 BcellWH2_02537 は、Fusarium v​​enenatum 由来の β-グルカンの活性パラメーターがプスツランで得られたものと同様 (kcat/Km 2512 ± 28 および 1968 ± 17 mg ml-1 min-1) を示し、この酵素が β-グルカンとの相互作用を必要としないことを示唆しています。 (1,3)-グルカン骨格。 さらに、BcellWH2_02537 は、β-(1,6)-グルコトリオースより大きいオリゴ糖に対してのみ活性を示すことが示されており、これは、BT3312 と同様に、この酵素が活性部位に 3 つのサブサイトを持っていることを示しています (Davies らによって確立された命名法) 51。

最後に、マイコタンパク質由来のβ-グルカンがBaccell WH2によってどのように代謝されるかを完全に理解するために、予測されたGH3およびGH2酵素(それぞれBcellWH2_01926およびBcellWH2_02541によって指定される)を組換え発現させ、両方が生成される異なるオリゴ糖に作用できることを示した。 GH157 および GH30_3 酵素の作用による。 BcellWH2_01926 (GH3) は GH30_3 によって放出された β-1,6-グルコオリゴ糖を分解できましたが、GH2 酵素 (BcellWH2_02541) は β-1,3-グルコオリゴ糖 (グルコビオースおよびグルコトリオース) に作用することが示され、どちらの場合もグルコースを放出します。最終生成物は、これらの酵素のエキソ作用メカニズムを確認します (BcellWH2_01926 および BcellWH2_02541)。 表 1 には、これら 2 つのエキソ-グルコシダーゼの触媒パラメーターも示されています。これは、GH2 酵素の活性が β-1,3-グルコビオースとβ-1,3-グルコトリオースについて類似していることを強調しており、活性部位に 2 つのサブサイトがあることを示唆しています。

BT の場合、GUL アーキテクチャは Baccell WH2 で観察されたものよりも単純です (図 1D)。 前者の細菌については、GH30_3 (BT3312) および GH3 (BT3314) のみがプスツラン β-グルカンに対して活性であることが以前に報告されています17。 Fusarium v​​enenatum 由来の β-グルカンに対する BT3312 の触媒活性を評価するために、この多糖を使用して酵素アッセイを実行し、BcellWH2_02537 と同様の活性レベルを得ました (BT3312 では 2874 ± 35 mg ml-1 min-1、2512 ± 28 mg BcellWH2_02537 の場合は ml−1 min−1）（表 1）。 BT3312 酵素は真菌の β-グルカン側鎖に対して活性であることが示されており、それによって特定の β-1,6-オリゴ糖が放出され、これがエキソグルコシダーゼとして BT3314 によって加水分解されてグルコースを放出することができます (BT3312 については図 2F、 BT3314の場合は図2G）。 Baccell WH2 酵素と同様に、表 1 に、これらの基質に対する BT3312 および BT3314 の触媒パラメーターを示します。

Baccell WH2 がコードする GH157 および GH30_3 酵素と真菌の β-グルカンとの相互作用を詳しく調べるために、Baccell WH2 タンパク質の結晶の取得を試みました。 残念ながら、複数の条件をスクリーニングしたにもかかわらず、適切な結晶を得ることができませんでした。 代わりに、検索プラットフォームとして Phyre2 アルゴリズムを使用して BT3312 について解かれた結晶構造と比較することにより、GH30_3 タンパク質の構造を取得しました 17,52。 図S1Dは、予測された構造が、2つのグルタミン酸（BT3312およびBcellWH2_02537の場合はそれぞれE339およびE347）および酸/塩基（BT3312の場合はE238およびE247）として機能する、保存された保持機構を備えた(β/a)8バレルであることを示しています。およびBcellWH2_02537、それぞれ)。 この図に示されているように、両方のタンパク質は高いレベルの配列類似性 (58.33% 同一) を示し、同じ活性プロファイルを示します (表 1)。 これは、BT331217 について説明したのと同様に、Baccell WH2 の GH30_3 には主要なサブサイトが 3 つしか含まれていないことを示しています。 結合と触媒作用に関与するアミノ酸は両方のタンパク質で保存されています（図S1E）。

Baccell WH2 および BT が真菌の β-グルカン上で増殖したときに培養培地にオリゴ糖を放出し、それによっておそらく交差摂食活動を通じて他の細菌の増殖を可能にするかどうかを調査するために、これらの菌株を中間指数関数まで培養した後、無細胞増殖培地を入手しました。および固定相 (図 3)。 次に、Baccell WH2 または BT によって培地に放出されたオリゴ糖の存在を HPLC によって評価しました (図 3A、B)。 これら 2 つの細菌種がマイコタンパク質を唯一の炭素源として使用する場合 (図 3A)、培地中にオリゴ糖を放出することが示されましたが、これらはそれぞれの場合で異なり (図 3B)、これはそれらの異なる GUL 構造と一致しており、したがって、これら 2 つの種のそれぞれがたどる異なる分解戦略が確認されます。

真菌のβ-グルカンに対するBaccell WH2の増殖培地のHPLCクロマトグラム。 B BT のパネル A と同じ。 C ゲルろ過 (GF) カラム後の Baccell WH2 からの精製オリゴ糖。 D GF カラム後の BT から精製されたオリゴ糖。 E 真菌β-グルカン上で増殖させたBaccell WH2 上清の LC/MS。 F 真菌β-グルカン上で増殖させたBT上清のLC/MS。 すべての HPLC および LC/MS 実験は 3 つの異なる独立した反復で実行されました (n = 3)。

これらのオリゴ糖の性質を調べるために、LC/MS を実行してその質量を測定しました。 図３Ｃは、Ｂａｃｃｅｌｌ ＷＨ２によって放出される精製された主なオリゴ糖のＨＰＬＣプロファイルを示し、図３Ｅは、この細菌が主に七糖を放出することを確認するこのオリゴ糖の関連質量スペクトルを示す。 これらの結果は、真菌の β-グルカンの in vitro 酵素消化と一致しています。なぜなら、この真菌の炭素源を GH30_3 および GH157 と一緒にインキュベートすると、両方の酵素によって生成される生成物がグルコース、1,6-β-グルコビオース 1,3- であったからです。 Baccell WH2によって生成された増殖培地中に存在するβ-グルコテトラオースおよび七糖（図2E）。 図 3F は、増殖培地中で BT によって放出された主なオリゴ糖の質量スペクトルを示しており、HPLC クロマトグラム (図 3D) で示された 1,6-β-グルコビオースに対応する主生成物として二糖類の存在が確認されています。 。

マイコタンパク質β-グルカン上で増殖させた場合、バクテロイデスによる増殖培地へのオリゴ糖の放出を確認した後、この現象により他の腸内共生生物がそのような放出されたオリゴ糖を共摂食できるのではないかと仮説を立てました。

実際、図 4 は、ビフィズス菌株が真菌の β-グルカン上でバクテロイデスと共培養された場合に増殖できることを示しています。 我々は、β-グルカン中で増殖させたBaccell WH2およびBTからの一晩上清を、いくつかの利用可能なビフィズス菌株および乳酸菌株を用いてスクリーニングし、Baccell WH2上清の場合、Bi. Breve UCC2003、Bi。 ロンガム亜種。 ロンガム NCIMB 8809 および Lb. plantarum WCFS1 は炭素源として無傷の β-グルカンを使用できませんが、Baccell WH2 によって放出される七糖を利用できます (図 4A)。 我々は、Bi の前後で増殖培地をテストすることで、これらの菌株が七糖を使用できることを確認しました。 Breve UCC2003、Bi。 ロンガム亜種。 ロンガム NCIMB 8809 および Lb. プランタルム WCFS1 の増殖。 図 4B は、Bi による七糖の使用を確認します。 ロンガム亜種。 ロンガム NCIMB 8809、Bi 付き。 UCC2003 および Lb を取得します。 plantarum WCFS1 は、放出されたオリゴ糖を使用するより控えめな能力も示します。 24時間発酵後、Bi. ロンガム亜種。 Longum NCIMB 8809 は、Baccell WH2 からの上清を使用した場合、最終光学濃度 0.8 に達しました。 ビ。 ブレーベとLb. plantarum はこれらのオリゴ糖を使用できましたが、程度は低く、最終的な光学密度は 0.6 に達しました。

Baccell WH2 からの真菌 β-グルカン上清によるビフィズス菌の増殖。 B ビフィドバクテリウム ロンガム亜種の増殖前後の上清の HPLC 分析。 Baccell WH2 からの上清におけるlongum。 C BT からの真菌 β-グルカン上清によるビフィズス菌の増殖。 D 真菌β-グルカン上で増殖させたBTの無細胞上清上でのビフィドバクテリウム ロンガム亜種ロンガムの増殖前後の上清のHPLC分析。 E 真菌β-グルカン上で増殖させたBTの無細胞上清上でのBi breve UCC2003およびL. plantarumの増殖前後の上清のHPLC分析。 すべての増殖および HPLC 実験は 3 つの異なる独立した反復で行われました (n = 3)。

BT の上清を Bi のスクリーニングのための炭素源として使用した場合。 Breve UCC2003、Bi。 ロンガム亜種。 ロンガム NCIMB 8809 および Lb. plantarum WCFS1 では、培地中に蓄積していた二糖が現在存在せず、この β-1,6-グルコビオースがビフィズス菌株とラクチプランチバチルス株によって増殖を維持するために使用されていることを示しています（図 4C、D）。 HPLCによる増殖培地の分析もBiについて実施した。 UCC2003 および Lb を取得します。 plantarum WCFS1 は、炭素源として β-1,6-グルコビオースを使用する能力を確認しています (図 4E)。

この新たに発見されたバクテロイデス種とビフィズス菌種の間の交差摂食相互作用を確認するために、異なる時点で交差摂食実験を実施し、コロニー形成単位を追跡する両種の共培養と、それぞれの 16 S rRNA ベースの qPCR 定量を確認しました。成長中の種（図5、6）。 この共培養実験では、Baccell WH2 により Bi が使用可能になりました。 ロンガム亜種。 ロンガム NCIMB 8809 および Bi. breve UCC2003 は、生菌数の評価 (Bi.longum subsp.longum については図 5A、Bi. breve については 5C) および co における両方の細菌の割合から明らかなように、両方の菌株を無傷の真菌 β-グルカンで培養すると増殖します。 -培養（Bi.longum亜種longumについては図5B、Bi.breveについては図5D）。 図4に示すように、β-グルカンの存在下でBaccell WH2と共培養した場合のビフィズス菌増殖の観察は、炭素源として無細胞上清を使用した場合の単培養発酵の所見と一致しました。

Baccell WH2 + Bi のコロニー形成ユニット。 ロンガム亜種。 ロンガム。 B Baccell WH2 + Bi のパーセンテージ。 ロンガム亜種。 ロンガム。 C Baccell WH2 + Bi のコロニー形成単位。 ブレーベUCC2003。 D Baccell WH2 + Bi のパーセンテージ。 UCC2003を待ちます。 すべてのクロスフィーディング実験は、3 つの異なる独立した反復で行われました (n = 3)。

BT+Biのユニットを形成するコロニー。 UCC2003を待ちます。 B BT + Bi の割合。 UCC2003を待ちます。 C BT + Bi のコロニー形成単位。 ロンガム亜種。 ロンガム。 D BT + Bi の割合。 ロンガム亜種。 ロンガム。 すべてのクロスフィーディング実験は、3 つの異なる独立した反復で行われました (n = 3)。

同様に、BT は Bi の成長を可能にしました。 UCC2003 と Bi をブレベします。 ロンガム亜種。 図１および２で観察できるように、共培養中のロンガムＮＣＩＭＢ ８８０９。 それぞれ、6Aおよび6C(コロニー形成単位)、および6Bおよび6D(パーセンテージ)を示す。 繰り返しになりますが、バクテロイデスが、腸内でビフィズス菌株との特異的な交差摂食ネットワークを可能にする能力が、前者の細菌が食餌性真菌β-グルカンで増殖する場合に確認されました。

最後に、この研究をヒト腸内微生物叢の他の共生メンバーで拡張するために、Baccell WH2 と BT を一次分解者として、Lactiplantibacillus plantarum WCFS1 を二次分解者として共培養実験を行い、Baccell WH2 と BT の増殖を可能にする能力を確認しました。この共生生物の。 図。 Baccell WH2 の S2A および S2B、および図 BT 用の S2C および S2D は、共培養でもこの能力を示しました。

上でも述べたように、Bi. breve UCC2003 は、β-グルカン上で増殖したときに Baccell WH2 によって放出されるグルコビオースを使用できます。 我々は、ビフィズス菌がこのオリゴ糖を利用できるようにするグリコシド加水分解酵素を同定するために、前者の細菌のゲノムに対してバイオインフォマティクス分析を実施しました。 我々は、基質としてセロビオースに作用することが以前に示されていた GH1 (Bbr_0109) を同定しました 53。 私たちは、このタンパク質が異なる結合を持つ糖オリゴ糖を基質として作用するのではないかと仮説を立てました。 私たちの仮説を証明するために、タンパク質を組換え発現させ、酵素の基質としてβ-1,4、β-1,3、およびβ-1,6-グルコビオースを使用して酵素アッセイを実行しました。 Bbr_0109 は、予想どおり β-1,4 および β-1,6-グルコビオースに対して活性であり、この活性は図 2 および 3 の HPLC によって示されています。 それぞれS3AとS3B。 さらに、この活性を特徴付けることができ、その速度論的パラメーターを表 1 に計算しました。Bi のバイオインフォマティクス分析。 ロンガム亜種。 ロンガムゲノムでは、Bbr_0109 の相同体や、β-グルカン由来のオリゴ糖を交差摂食する能力に関与する他の候補酵素は明らかにされなかった。したがって、この活性に関与する代謝経路を解明するにはさらなる研究が必要である。

前者の細菌をβ-グルカン上で培養した場合に、バクテロイデスがビフィズス菌の増殖を特異的に可能にする能力を確認した後、培地のメタボロミクス分析を実行して、バクテロイデスとビフィズス菌による短鎖脂肪酸（SCFA）/乳酸/コハク酸の産生を評価しました。単一文化と共文化で。 表 2 に、これらの発酵によって検出された酢酸塩、酪酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩のレベルを示します。 Baccell WH2 は、単培養で生産される主な SCFA としてコハク酸 (78 mM) および酢酸 (12 mM) を生産することが示されました。 コントロールとして、Bi. ロンガム亜種。 ロンガム NCIMB 8809 は、完全なマイコタンパク質 β-グルカンを使用できないため、有意な量の SCFA を生成できませんでした。 対照的に、共培養では、亜種の結果として酢酸塩（115 mM）がより高濃度のSCFA（115 mM）であり、続いてコハク酸塩（99 mM）であった。 ロンガムNCIMB 8809が上昇。 最後に、ギ酸塩 (16 mM) と乳酸塩 (21 mM) も、ビフィズス菌がこれらの代謝産物を生成する能力があるため、共培養で生成されました。

β-グルカンは、プレバイオティクス炭水化物として作用し、人間の健康にとって有益な結果がさまざまに報告されていることがこれまでに実証されています54、55、56、57。 最近、デジャンら。 (2020) バクテロイデス株​​が酵母や藻類のラミナリンなどに由来するβ-(1,3)-グルカンを利用する能力を示しました13。 これらの著者らは、バクテロイデス ユニフォミス ATCC 8492 がこれらの β-(1,3)-グルカンの分解に特定の多糖利用遺伝子座を利用していることを示しました。 この遺伝子座は、細胞表面関連グリコシドヒドロラーゼファミリー 158 (GH158) 酵素と GH16 をコードし、多糖の解重合を開始してオリゴ糖を放出します。オリゴ糖は、SusC/D 様ペアによってペリプラズムに取り込まれ、そこで GH3 (β-グルコシダーゼ) ）すべてのオリゴ糖をグルコースモノマーに変換する分解プロセスが続き、その後中枢解糖異化に入ります。 また 2020 年に、Singh et al.37 は、バクテロイデス ユニフォミス JCM 13288 が、前述のバクテロイデス ユニフォミス株と同様の酵素機構で β-(1,3)-グルカンを分解する能力を示しました。 しかし、後者の著者らは、分子のβ-(1,6)-グルカン側鎖を分解してβ-1,6-グルコビオースを放出することができる追加のGH30活性を明らかにした。 さらに、この Ba によってオリゴ糖が放出されることを実証しました。 ユニフォームイス株は、ラミナリンでは増殖しないか、または増殖が不十分な腸内細菌叢の他のメンバーによって使用される可能性があります。

オオムギ β-グルカンの場合、Taむらら 34、35、36 は、Bacova と Baccell WH2 が表面結合 GH16 酵素 (Bovatus_03149 および BcellWH2_04354) を使用して分解プロセスを開始することを示しました。 さらに、同じ著者らは、大麦β-グルカンの代謝を完了するために、Bacova のペリプラズムには 2 つの GH3 酵素 (Bovatus_03146 および Bovatus_03153) が存在し、Baccell WH2 のペリプラズムには 1 つ (BcellWH2_4356) が存在することを示しました。

ここで説明する研究では、Baccell WH2 が食物真菌の β-グルカン (Quorn® 製品に使用されている主成分である Fusarium v​​enenatum 由来の多糖類など) を分解する代替経路を明らかにします。化学構造は直鎖状 β から構成されています。 β-(1,6)-グルカンを側鎖として持つ-(1,3)-グルカン主鎖 (図 1A)。 プロテオミクスによって明らかにされ、トランスクリプトミクスによって確認されたように、この代謝のために、Baccell WH2 は 2 つの GUL を使用してこの複合グリカンを分解します (それぞれ図 1C および S1B)。 これらの GUL 内で、Baccell WH2 は新規の GH157 と GH30_3 をコードしており、どちらも細胞表面に位置し、複合グリカンの分解を開始すると予測されています。 これらのGULは、外膜表面タンパク質によって放出され、SusC/D様ペアによってペリプラズムに組み込まれたグルコオリゴ糖を完全に分解するのに必要な追加のグリコシド加水分解酵素をコードしていることも示された。 これらのペリプラズムタンパク質は、GH ファミリー 3 および 2 に属する典型的な β-グルコシダーゼを表します。最後に、この GUL は未知の機能を持つタンパク質 (BcellWH2_02538) をコードしており、その位置は Baccell WH2 の表面にあると予測されています。 このタンパク質は、表面グリカン結合タンパク質 (SGBP) となるのに最適な位置にあり、細菌細胞表面でのオリゴ糖の結合において SusC/D 様ペアを助けることが示されています 35,36,58。 これらの GUL によってコードされ、真菌の β-グルカンを標的とする 3 つの異なる β-グルコシダーゼ (2 つの GH3 と 1 つの GH2) が存在する理由は、まだ推測の余地があります。 私たちは、Baccell WH2 が真菌源だけでなく、異なる化学構造を持つ数種類の β-グルカンに作用する可能性があると仮定します。 そのため、彼らは異なるβ-グルコシダーゼを使用して、これらのグルコオリゴ糖のさまざまな結合を加水分解します。 しかし、これらのβ-グルコシダーゼの一部が冗長であり、腸内環境によって課せられる高い選択圧力の下で細菌がゲノムからこれらの遺伝子の一部を除去するように進化している可能性を排除することはできません。

最後に、Baccell WH2 と BT が、共生生物のビフィズス菌やラクチプランティバチルス属などの腸内細菌叢の他のメンバーとオリゴ糖を共有できることを示します。 この点において、Baccell WH2 は Bi との相互作用を可能にすることが示されました。 ロンガム亜種。 ロンガム、ビ。 breve UCC2003 および Lactiplantibacillus plantarum WCFS1 (図 5 および S2)。 さらに、BT は Bi との特異的な交差供給を促進することが示されました。 ロンガム亜種。 ロンガム、ビ。 breve UCC2003 と Lactiplantibacillus plantarum WCFS1 (図 6 および S2) により、共培養での両方の細菌の増殖が可能になります。 BT と Baccell WH によって放出されるオリゴ糖は異なるため (つまり、グルコ七糖とグルコビオース)、腸内での特定の相互作用を選択します。 ビ。 breve UCC2003 は、BT によって放出されるグルコビオースを分解するために GH1 (Bbr_0109) をコード化します。 この GH1 はグルコビオースに非常に特異的であり、β-(1,3) グルコビオース、β-(1,4) グルコビオース、β-(1,6) グルコビオースに対して活性を示します (表 1)。 しかし、グルコトリオースやその他のより長いオリゴ糖には作用できないことが、Bi の能力が部分的であることを説明できる可能性があります。 Baccell WH2によって放出された七糖を使用することはできず、その結果、Baccell WH2上清中では増殖できなくなります。 バクテロイデス属とビフィドバクテリウム属のメンバー間の交差摂食におけるこれらの特異的な相互作用は、アラビノガラクタン 31、アラビノキシラン 48 またはイヌリン 59 などの他の多糖類でも示されています。

β-グルカンに関しては、腸内細菌叢のメンバーによる相互摂食相互作用についてはほとんど報告されていません。 上で述べたように、Singh et al.37 は Ba の能力を示しました。 均一な JCM 13288 は、Blautia producta JCM1471、Ruminococcus faecis JCM15917、Bifidobacterium adolescentis JCM 1275 が唯一の炭素源としてラミナリンで増殖する場合にグルコオリゴ糖を共有します。 さらに、Centanni ら 60 は、炭素源として大麦 β-グルカンを使用した Bacteroides ovatus、Subdoligranulum variabile、および Hungatella hathewayi 間の相互作用を示しました。 彼らはBaを示しました。 ovatus は 3-O-β-セロビオシル-d-グルコースと 3-O-β-セロトリオシル-d-グルコースを最終生成物として培地に放出し、これらのオリゴマーは 3-O-β-セロビオシル-d-グルコースを優先して他の 2 つの細菌の増殖を可能にしました。フンガテラ・ハザウェイの場合はセロトリオシル-D-グルコース。 しかし、私たちの知る限り、私たちの研究はバクテロイデス属の異なるメンバー間の詳細な分子相互作用を初めて明らかにしました。 真菌性 β-グルカンを使用する場合は、他のヒトの共生生物 (ビフィドバクテリウムおよびラクチプランチバチルス) を使用します。

最後に、本発明者らは、Baccell および B. ブレーベ UCC2003 が、β-グルカン発酵の結果として単一培養および共培養において異なる SCFA を生成する能力を示した。 Baccell は、β-グルカンでの単一培養で増殖すると、主な代謝産物として酢酸塩とコハク酸塩を生成しますが、B. ブレーベ UCC2003 との共培養では、酢酸塩とコハク酸塩だけでなく、乳酸塩とギ酸塩も生成することが示されており、後者はビフィズス菌発酵によるものです。 。 この生成は、バクテロイデスが主要な SCFA31 として酢酸を生成する他の発酵プロセスに従っています。 ムニョスら。 Baccell を単培養で培養した場合、AGP 発酵では β-グルカン (78 mM、表 2) よりも低いレベルのコハク酸塩 (60 mM) の生成が報告されています。 しかし、AGP または β-グルカン上で培養すると Baccell がそれぞれ 24 mM および 12 mM の酢酸を生成することが示されているため、酢酸生成については逆の効果が観察されます 31。 しかし、β-グルカンの存在下でBaccellをB. ブレーベUCC2003と共培養した場合、SCFA産生はすべての代謝産物でより高いようです（酢酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、ギ酸塩についてそれぞれ115、99、21、および16 mM）。 AGP（酢酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、ギ酸塩についてそれぞれ94、68、6、および6.9mM）の存在下での共培養と比較した場合31。

この研究で提示されたすべてのデータにより、Baccell WH2における真菌β-グルカンの分解および二次分解者としてのビフィズス菌との相互作用の一般的なモデルを得ることができました（図S3C）。

結論として、この論文は、ヒトの腸内バクテロイデス株​​のさまざまなメンバーが食餌性真菌β-グルカンを使用する能力を示しています。 我々は、バクテロイデスがこの複合グリカンを分解するために2つの主要なGULを使用し、新規の酵素活性とそれらのGULで発見されたファミリーを使用し、それらがオリゴ糖とBiを共有していることを示した。 ロンガム亜種。 ロンガムとビ。 使用できる場合は、UCC2003 を選択して保存します。 最後に、Bi にコードされている特定の酵素 (Bbr_0109、GH1) を示しました。 breve UCC2003 は、BT によって放出されたオリゴ糖の分解に関与します。 したがって、この研究は、真菌のβ-グルカン利用遺伝子がバクテロイデスだけでなくグラム陽性菌にも存在するという証拠を提供する。 この研究で特定された多様なβ-グルカン GUL は、適切な栄養介入療法を通じて人間の健康を改善するための人工機能性食品の開発への道を開く可能性があります。

この研究で試験した酵母および大麦のβ-グルカンは、Megazyme (ダブリン、アイルランド) から購入しました。 D-ガラクトースおよびD-グルコースはSigma (英国)から購入しました。 Luria-Bertani (LB) 増殖培地は Formedium (ノーフォーク、英国) から購入し、強化クロストリジウム寒天は Oxoid Ltd. (英国ベイジングストーク) から、Brain Heart Infusion は Sigma (英国) から購入しました。 すべての試薬は分析グレードのものでした。

Fusarium v​​enenatum から細胞壁物質が抽出され、以前に記載された方法 61 に従ってさまざまなグリカン部分が精製されました。 簡単に言うと、細胞壁物質を3% NaOHで75時間アルカリ抽出し、2つの画分を得た：塩基に可溶な画分1と塩基に不溶な画分2。 画分 1 にはマンノプロテインと β-1,6-1,3-グルカンが含まれることが示され、画分にはキチンと結合したこの β-1,6-1,3-グルカンが含まれていました。 画分 1 を氷酢酸で中和し、15,000 × g で 30 分間遠心分離し、上清を 24 時間透析しました。 透析後、混合物は使用前に凍結乾燥されました（図S4A、B）。

ばー。 ovatus ATCC8483 (Bovatus)、Ba。 シータイオタオーミクロン VPI-5482 (BT)、Ba. cellulosilyticus DSMZ14838 (Baccell DSM) および Ba. cellulosilyticus WH2 (Baccell WH2) は、この研究で対象となるすべての炭素源で増殖できるため、上記のように 1% (wt/vol) の炭水化物を含む 3 ml の最小培地 (MM) で直接培養しました 48。

バクテロイデス属 MM + グルコースで前培養し、ペレット化し、洗浄し、炭素源を含まない MM に 2 回再懸濁し、1% (wt/vol) 炭水化物を含む 4 ml の MM に A600 ～ 0.3 になるまで接種しました。 細菌培養物を 3 回採取し (Bovatus、BT、Baccell DSM、および Baccell WH2 については 5 時間のインキュベーション後の対数増殖期中期 [A600、~0.6])、RNA を即時に安定化させるために RNA プロテクト (Qiagen) に置き、保存しました。 -20 °C で RNA を抽出し、RNeasy ミニキット (Qiagen) で精製し、RNA 純度を分光測光法で評価し、1 μg の RNA を逆転写と cDNA の合成に使用しました (SuperScript VILO マスター ミックス、Invitrogen)。特異的プライマーを使用した定量的 PCR (最終容量 20 μl) は、7500 Fast リアルタイム PCR システム (Applied Biosystems) 上の SensiFast SYBR Lo-ROX キット (Bioline) を使用して実行されました (表 S2)。データは 16 S rRNA 転写物に対して正規化されました。レベル、および発現レベルの変化は、グルコースを含むMM培養物のレベルと比較した変化倍数として計算されました。

Baccell WH2を、複合多糖類として1% β-グルカン、単糖対照としてグルコースを用いて、以前と同じ方法で培養しました。 MM+GlcまたはMM+β-グルカン中で増殖させた後、細菌培養物を3回ずつ採取した。 細胞を遠心分離（3,500 g、15分間、4℃）によって収集し、PBS pH 7.4で3回洗浄した。 続いて、細胞ペレットを、5 mM トリス(2-カルボキシエチル) ホスフィンを含む50 mM 重炭酸トリエチルアンモニウム中の8 M 尿素緩衝液に再懸濁した。 超音波ホモジナイザー(Hielscher)を使用した超音波処理により細胞を溶解した。 続いて、タンパク質を、暗所で10 mM ヨードアセトアミドを使用して室温で30分間アルキル化した。 タンパク質濃度は、Bradford タンパク質アッセイ (Thermo Fisher Scientific) を使用して測定しました。 総タンパク質 50 μg を含むタンパク質サンプルを 50 mM 重炭酸トリエチルアンモニウムで 5 倍に希釈し、タンパク質消化を 300 rpm で振盪しながら 37 °C で 18 時間実行しました。タンパク質とトリプシンの比 50:1 を使用しました。 トリプシン消化を停止し、上記のようにペプチドを脱塩した。

ペプチドを 0.1% トリフルオロ酢酸を含む 2% アセトニトリルに溶解し、UltiMate 3000 RSLCnano システム (Thermo Fisher Scientific) に接続された Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質量分析計 (Thermo Fisher Scientific) で各サンプルを個別に分析しました。 ペプチドを Acclaim PepMap 100 C18 LC トラップ カラム (100 μm ID × 20 mm、3 μm、100 Å) に注入し、続いて EASY-Spray nanoLC C18 カラム (75 ID μm × 500 mm、2 μm、100 Å) で分離しました。流量 300 nlmin−1 で。 溶媒Ａは０．１％ギ酸を含む水であり、溶媒Ｂは０．１％ギ酸を含む８０％アセトニトリルであった。 表面を削ったサンプルの分析に使用した勾配は次のとおりです。溶媒 B を 3% に 6 分間維持した後、43 分で 3 ～ 35% B に増加させ、0.5 分で 35 ～ 90% B に増加させ、0.5 分間維持しました。 5.4 分間 90% B、その後 0.1 分間で 3% に減少し、10 分間 3% で平衡化します。 プロテオームサンプルの分析に使用した勾配は次のとおりです。溶媒 B を 3% で 6 分間維持した後、218 分で 3 から 35% B に増加し、0.5 分で 35 ～ 90% B に増加し、90% に維持しました。 B を 5 分間保持し、その後 0.5 分間で 3% に低下させ、10 分間 3% で平衡化します。 Orbitrap Fusion Lumos は、イオントラップと Orbitrap 質量分析装置の両方を同期して使用するために、最近説明された電荷順序並列イオン分析 (CHOPIN) 法の修正バージョンを使用して、陽イオンデータ依存モードで動作しました。 CHOPIN メソッドは、質量分析装置の並列化機能を拡張するために Thermo-Fisher によって開発された「Universal Method」から派生したものです。 プリカーサーイオンスキャン（フルスキャン）は、Orbitrap で 400 ～ 1600 m/z の範囲で、200 m/z で 120,000 の分解能、4 × 105 の自動ゲイン制御 (AGC) ターゲット、およびイオン注入で実行されました。時間は50ミリ秒。 二重荷電前駆体イオンの MS/MS スペクトルは、衝突誘起解離 (CID) フラグメンテーション後に高速スキャン モードを使用してリニア イオン トラップ (IT) で取得しました。 32% の CID 衝突エネルギーが使用され、AGC ターゲットは 2 × 103 に設定され、300 ミリ秒の注入時間が許容されました。 前述したように、電荷状態 3 ～ 7 および強度 <5 × 105 の前駆体イオンも CID/IT による分析の対象としてスケジュールされました。 ただし、荷電状態が 3 ～ 7 で強度が 5 × 105 を超える前駆体イオンは、高エネルギー衝突解離 (HCD) 後に 200 m/z で 30,000 の分解能でオービトラップ (FT) で取得されました。 30% の HCD 衝突エネルギーが使用され、AGC ターゲットは 1 × 104 に設定され、40 ミリ秒の注入時間が許容されました。 フル スキャン間の MS/MS イベントの数は、3 秒の固定デューティ サイクルを維持するためにオンザフライで決定されました。 ± 10 ppm m/z ウィンドウ内のイオンの動的排除は、35 秒の排除期間を使用して実装されました。 エレクトロスプレー電圧 2.0 kV、キャピラリー温度 275 °C を使用し、シースと補助ガス流は使用しませんでした。

すべての MS/MS スペクトルは MaxQuant 1.5.1.739 を使用して分析され、Bacteroides cellulosilyticus MGS:158 のデータベース (4369 エントリを含む) に対して検索されました。 タンパク質配列は、2020 年 5 月 10 日に Uniprot からダウンロードされました。ピーク リストの生成は MaxQuant 内で実行され、検索はデフォルトのパラメーターと組み込みの Andromeda 検索エンジンを使用して実行されました。 酵素特異性は完全にトリプシン処理されたペプチドを考慮するように設定され、2 つの切断ミスが許容されました。 メチオニンの酸化、アスパラギンおよびグルタミンの N 末端アセチル化および脱アミド化は、可変修飾として許可されました。 MaxQuant では、1% 未満のタンパク質およびペプチドの誤検出率が採用されました。 タンパク質に少なくとも 2 つの固有のトリプシンペプチドが含まれている場合、そのタンパク質は確実に同定されます。 類似のペプチドを含み、MS/MS 分析のみに基づいて区別できなかったタンパク質は、節約の原則を満たすようにグループ化されました。 逆ヒットと汚染物質は下流分析の前に除去されました。 イオンクロマトグラムの抽出には Skyline 4.1.0.11796 を使用しました。 遺伝子オントロジーの濃縮は PANTHER42 を使用して実行され、細胞内タンパク質の局在予測は LocateP v243 を使用して実行されました。

Baccell WH2 [BccellWH2_01926 (GH3)、BccellWH2_01931 (GH157)、BaccellWH2_02537 (GH30_3)] に記載されている PUL に関連する遺伝子、および BT [BT3312 (GH30_3) および BT3314 (GH3)] のタンパク質は、それぞれ Baccell WH2 および BT から増幅されました。ゲノム DNA を鋳型として使用し、NheI および XhoI 制限部位を使用して pET28a (Novagen) にクローニングし、N 末端 His6 タグの組み込みによってコードされた産物の産生および精製が容易になりました (表 2S)。 このために、大腸菌TOP10細胞(ThermoFisher Scientific)を使用した。 組換え構築物を配列決定して(Eurofins Genomics)、その遺伝的完全性を検証し、次にそれを使用して大腸菌BL21(DE3)発現細胞(Thermo-Fisher Scientific)を形質転換した。 細胞を、50 mg/ml カナマイシン抗生物質を含むルリア ベルターニ (LB) 培地で対数増殖期中期 (A600nm ～ 0.6) まで培養しました。 0.1 mM イソプロピル β-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG) を細胞に添加し、その後 16 °C で一晩増殖させることによってタンパク質発現を誘導しました。 翌日、細胞を遠心分離 (4000 × g) によって回収し、Talon バッファー (20 mM Tris/HCl pH 8.0 プラス 100 mM NaCl) に再懸濁しました。 再懸濁した細胞を破砕し、4 °Cで20分間遠心分離（16,000 × g）しました。その後、コバルトベースのマトリックスであるTalonTMを使用した固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）によって、得られた無細胞抽出物から組換えタンパク質を精製しました。 このプロセスでは、Cell Free Extract (CFE) を Talon 樹脂を含むカラムにロードし、Talon バッファーで洗浄しました。 １０ｍＭイミダゾールを含むＴａｌｏｎ緩衝液で再度洗浄し、続いて１００ｍＭイミダゾールで組換えタンパク質を溶出した。 精製されたタンパク質は、標準的な透析によって選択したバッファーに交換されました。

特に明記しない限り、すべての酵素アッセイは、150 mM NaClを含む20 mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0中で実施し、3回実施した。 アッセイは、1 μM の各 GH [BccellWH2_01926 (GH3)、BccellWH2_01931 (GH157)、BccellWH2_02537 (GH30_3)、BcellWH2_02541 (GH2)、BT3312 (GH30_3) および BT3314 (GH3)] を使用して 37 °C で行いました。 150μM β-グルカン。 16 時間にわたってアリコートを採取し、サンプルと生成物を TLC およびパルス電流検出 (PAD) を備えた高圧陰イオン交換クロマトグラフィー (HPAEC) によって評価しました。 糖 (単糖および短鎖オリゴ糖) は、Carbopac PA1 ガードおよび分析カラムで、100 mM 水酸化ナトリウムの定組成プログラムで 40 分間、その後 500 mM 酢酸ナトリウムの 100% 直線勾配で 60 分間分離されました。 糖類は、Ag/AgCl pH 参照電極を備えた金作用電極での電気化学的検出用の炭水化物標準クワッド波形を使用して検出されました。

GH30_3 および GH157 の場合、多糖類の加水分解は DNSA (ジニトロサリチル酸) 還元糖アッセイを使用して定量化されました 48。 アッセイは、最終容量 1 ml、最適 pH、37 °C で 10 分間実施しました。 等量（1ml）のDNSA試薬を添加することにより反応を停止させた。 A540 を読み取る前に、80 °C に 20 分間加熱して発色させました。 グルコース (25 ～ 150 μM) を使用して、定量用の標準曲線を作成しました。 ミカエリス・メンテンパラメータを決定するために、適切な濃度の酵素とともに0.025〜3 mg ml-1の範囲で異なる濃度の多糖溶液を10分間使用し、放出された還元末端の数を上記のように定量しました。 値は、線の傾きとして kcat/Km を与える線形回帰を使用してプロットされました。

ＧＨ３およびＧＨ２の場合、酵素アッセイは、グルコース放出定量化のためのＭｅｇａｚｙｍｅ（アイルランド、ダブリン）のカップルアッセイキットによってグルコース放出を測定する３４０ｎｍの波長で分光光度計で測定した。

共培養の前に、Baccell WH2 と BT を脳心臓注入 (BHI、Sigma Aldrich、英国) で増殖させ、PBS で 2 回洗浄しました。 ビフィズス菌株の単培養物を強化クロストリジウム培地 (Oxoid、Basingstoke UK) 上で増殖させ、1% マイコプロテイン β-グルカン 11 を含む最小培地 (MM) に接種するために使用する前に PBS で洗浄しました。 共培養物を、1% マイコプロテイン β-グルカンを含む接種最小培地で増殖させ、実験を 3 回繰り返しました。 増殖中に一定の間隔で0.5 mlのサンプルを採取し、段階希釈して、培養物（Baccell WH2およびBT）1ミリリットルあたりの総CFUを決定するために寒天およびブタヘマチンを含むBHI上、および0.05％システインを含む強化クロストリジウム培地上にプレーティングしました。 (野生型ビフィズス菌株の場合) および 100 μg/ml エリスロマイシンを含む。 Lactiplantibacillus plantarum WCSF4を、バンコマイシン10μg/mlを補充したMRS培地(メルフォード、英国)上で日常的に増殖させた。 バクテロイデス、ビフィドバクテリウム、またはラクチプランチバチルスの各単培養物も、培養中に間隔を置いてミリリットルあたりのCFUを測定するために播種した。

単一培養物および共培養物から採取したアリコートをqPCRで分析し、サンプル中の各細菌の16 S rRNA遺伝子を増幅する培養中の各細菌種の比率を定量しました。 この qPCR では各細菌に特異的なプライマー (1 μM) を使用しました。これを表 2S に示します。

糖類（増殖培地からの混合タイプのオリゴ糖）は、Carbopac PA200 ガードおよび分析カラム上で、100 mM 水酸化ナトリウムの定組成プログラムで 40 分間分離し、その後 60 分間かけて 500 mM 酢酸ナトリウムの 100% 直線勾配で分離しました。 。 糖類は、Ag/AgCl pH 参照電極を備えた金作用電極での電気化学的検出用の炭水化物標準クワッド波形を使用して検出されました。

GH157 (BcellWH2_01931) の 3 次元構造は、AlphaFold2 colab ソフトウェアを使用してモデル化されました。優れたモデルを開発し、ソフトウェアをオープンソース化した AlphaFold チームに感謝します https://colab.research.google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/ main/AlphaFold2.ipynb#scrollTo=UGUBLzB3C6WN)。 Bccell WH2_02537 (GH30_3) モデルは、Phyre2 サーバー 52 を使用して取得されました。 構造は、Pymol (PyMOL Molecular Graphic システム、バージョン 2.0 Schrodinger, LLC) を使用して視覚化されました。

ＨＰＬＣ分析を使用して、Ｂａｃｃｅｌｌ ＷＨ２およびＢｉ（クロスフィード）によるＳＣＦＡ産生を評価した。 ブレーベUCC2003。 固定相 (共培養) からの増殖培地上清を滅菌し (0.45 μM フィルター、Costart Spin-X カラム)、屈折率検出器システムを備えた UltiMate® BioRS Thermo HPLC システム (Thermo Fisher Scientific) に注入しました。 このシステムは、炭水化物発酵の結果として生じる酢酸塩、乳酸塩、酪酸塩の生成を特定し、計算するために使用されました。 濃度は既知の標準に基づいて計算されました。 LW-AGを含む非発酵培地を対照として使用した。 Accucore™ C18 HPLC カラムを使用し、65 °C に維持しました。 溶出は、10 mM H2SO4 溶液を使用し、0.6 ml min-1 の一定流速で 25 分間実行されました。

β-グルカン上で増殖させたBaccell WH2およびBTの上清から生成したオリゴ糖を含むサンプルを緩衝液B（85％アセトニトリル/15％50mMギ酸アンモニウム水溶液、pH4.7）で1:10（v/v）に希釈し、 0.5μlを、ZIC-HILIC（SeQuant、3.5μm、200Å、150×0.3mm、Merck）キャピラリーカラムからの溶出を介して液体クロマトグラフィー質量分析分析によって分析した。 カラムを NanoAcquity HPLC システム (Waters) に接続し、次のような溶出勾配で 35 °C に加熱しました: 100% バッファー B で 5 分間、続いて 25% バッファー B/75% バッファー A (50 mM) への勾配ギ酸アンモニウム水溶液、pH 4.7）を 40 分間かけて溶解します。 流速は50μl min-1であり、注入の間に10カラム容量の緩衝液Bの平衡化を行った。 MS データは、正イオン モード、50 ～ 2000 m/z、キャピラリー電圧と温度設定をそれぞれ 2800 V と 200 °C に設定し、乾燥ガス流量とネブライザー圧力とともに動作する質量分析計の Bruker Impact II QT を使用して収集されました。 6 l min−1 および 0.4 bar。 ＭＳデータは、Ｃｏｍｐａｓｓ ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ）を使用して分析された。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

すべてのプロテオミクス データは PeptideAtlas に保管されています (識別子 PASS04831、炭素源としてのブランク、グルコース、およびマイコプロテイン β-グルカンの生データ)。 この研究中に生成されたすべてのデータは、この公開された論文 (およびその補足情報ファイル) に含まれています。 グラフとチャートの基礎となるすべてのソース データは補足データ 1 にあります。オリジナルの SDS ゲルは図 S5 で入手できます。 ご要望に応じて、さらなる生データも入手可能です。

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JM-M. この研究は、マーロウ・フーズ社から一部資金提供を受けた博士課程の学生制度によって支援されています。この研究はマーロウ・フーズとは独立して実施されており、著者らは研究の結果に対して金銭的またはその他の利害関係を持っていません。 JM-M. ノーサンブリア大学から内部助成金による財政支援を受けました。 Dv-S. は、アイルランド政府の国家開発計画の一環としてアイルランド科学財団 (SFI/12/RC/2273 - P1 および SFI/12/RC/2273 - P2) から財政的支援を受けている APC マイクロバイオーム アイルランドのメンバーです。

ノーサンブリア大学応用科学部微生物酵素学研究室、ニューカッスル・アポン・タイン、NE1 8ST、タイン・アンド・ウィア、イングランド、英国

ペドロ・フェルナンデス＝ジュリア、ゲイリー・W・ブラック、ウィリアム・チャン、ホセ・ムニョス＝ムニョス

School of Microbiology & APC Microbiome Ireland、University College Cork、コーク、アイルランド

ドゥウェ・ヴァン・シンデレン

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ホセ・ムニョス・ムニョスへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 主な編集者: Tobias Goris。 査読ファイルが利用可能です。

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受信日: 2022 年 12 月 19 日

受理日: 2023 年 5 月 23 日

公開日: 2023 年 5 月 30 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04970-4

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