モノリスの使用

Jun 14, 2023

図1：CIMac PrimaS モノリス クロマトグラフィー カラムを使用した IVT 反応の分析からのクロマトグラム。

インビトロ転写 (IVT) は、メッセンジャー RNA (mRNA) 生成における重要なステップです。 2022年3月のウェビナーで、ロック・セキルニク氏（ザルトリウスの一部であるBIA SeparationsのmRNAおよびプラスミドDNA（pDNA）アプリケーションのプロセス開発責任者）は、IVT中に使用される試薬の濃度を最適化することが、産生されるmRNAの量を最大化するのに役立つと説明しました。 医薬品開発者は、リアルタイムで IVT を測定できる分析方法を強く求めています。 セキルニク氏は、CIMac PrimaS モノリス クロマトグラフィー カラムを使用して、ヌクレオシド三リン酸 (NTP)、キャッピング試薬、プラスミドの濃度モニタリングを含む IVT のアットライン分析がどのように可能になるかを示しました。

プレゼンテーションセキルニク氏は、SARS-CoV-2に対するmRNAワクチンに含まれるような4,000ヌクレオチドのmRNA分子は約1.3MDaであり、標準的なIgG抗体より約10倍大きいと指摘した。 メッセンジャー RNA も負電荷を帯びており、高塩濃度にさらされると疎水性になります。 タンパク質の翻訳を可能にするには、5' キャップとポリアデニル化 (ポリ A) テールが必要です。 ポリ A テールは、転写に使用される DNA テンプレートにコード化することも、IVT 後に酵素的に付加することもできます。 同様に、IVT中またはIVT後に5'キャップを追加できます。

このような特性を考慮すると、医薬品開発者は、mRNA 収量とキャッピング効率をリアルタイムで測定できる分析方法を必要としています。 高速液体クロマトグラフィー (HPLC) はこのような評価に役立ちますが、分析者は、適切な結合化学反応、mRNA に対して十分に大きな表面積、および迅速な分析機能を提供する分離媒体を選択する必要があります。 多孔質粒子を含むビーズベースの媒体では、拡散により物質移動が制限されるため、長い分析時間が必要となり、アットライン評価の可能性が制限されます。 また、ビーズは向流を生成し、回復力を低下させるせん断応力を生成します。

CIMac PrimaS モノリスカラムは、ポリメタクリレート固定相を介した対流物質輸送に依存しています。 分離は、陰イオン交換および水素結合の多峰性相互作用に基づいています。 カラムを通る層流により、せん断応力が最小限に抑えられます。 多孔質粒子と比較して、マイクロチャネルは mRNA 結合にはるかに大きな表面積を提供します。 チャネルには行き止まりの細孔がないため、その結合能力と分解能は流量が変化しても同じままです。

この機能により、分析者はサンプルを迅速に処理して、分解能を低下させることなくリアルタイムで IVT を評価できるようになります。 セキルニク氏は、1 つのアッセイで mRNA、pDNA、キャッピング試薬、および個別の NTP を分離して定量できることに注目しました (図 1)。 結果は 3 分以内に生成されます。

このような機能により、5' キャッピング効率を含む mRNA 生成動態のモニタリングと制御が可能になります。 セキルニク氏は、キャップのない mRNA を選択的に分解するエキソヌクレアーゼを使用すれば、サンプルの mRNA 濃度を分析し、酵素処理し、再分析して未消化の分子を定量できると説明しました。 処理前後の濃度値を比較すると、IVT 反応のキャッピング効率が明らかになります。 分析者は、それに応じて供給計画と試薬濃度を調整して、mRNA キャッピングと収量を最適化できます。

セキルニク氏は、フェドバッチ IVT プロセスからのデータを使用してその可能性を実証しました。 ザルトリウスは、グアノシン三リン酸 (GTP) とアンチリバース キャップ アナログ (ARCA) を 1:4 の比率で使用して IVT を開始しました。 プロセス開始後 1 時間では、キャッピング効率は高かった (80%) が、収率は低かった。 次にチームは、GTP:ARCA 比を維持しながら、反応全体を通して NTP レベルを調整するための供給戦略を使用しました。 このような変更により、キャッピング効率 (80%) や製品品質を低下させることなく、収量が 6 倍 (11.7 mg/mL) 増加しました。

このようなワークフローを使用すると、アナリストはキャッピング効率と収量の両方に関する情報を迅速に取得できます。 Sartorius PATfix ソフトウェアには、プロセス監視を容易にする分析シーケンスとツールがプリロードされています。 同社は、mRNA 製造およびプロセス分析のための複数のツールを提供する他の結合化学を備えたモノリス カラムも提供しています。

質問と回答 CIMac PrimaS カラムは、四次ポンプを備えた HPLC システムで使用できますか? CIMac 分析カラムは HPLC システムで使用できます。 四次ポンプが好ましい。

カラムは mRNA のポリアデニル化を特徴付けることができますか?CIMac Oligo dT カラムを使用して、ポリアデニル化 mRNA 含有量を定量できます。

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