YiaC と CobB は大腸菌のリジンラクチル化を制御します

Jun 18, 2023

Nature Communications volume 13、記事番号: 6628 (2022) この記事を引用

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リジンラクチル化 (Kla) は、ヒト細胞における転写の調節に関与していることが最近報告されました。しかし、原核生物における Kla の特徴、調節機構、機能的影響は依然として不明です。今回我々は、代謝調節においてYiaCがリシンラクチラーゼとして機能し、CobBがリシンデラクチラーゼとして機能することを報告する。我々は、YiaCがKlaの付加を触媒し、CobBがこのPTMをインビトロおよび細胞内の両方で消去することを実証する。さらに、YdiFがKlaにラクチル基を与えるラクチル補酵素Aの形成を触媒できることを示す。定量的プロテオーム解析により、大腸菌（E. coli）において CobB が標的とする 446 個の内在性 Kla 部位と YiaC が標的とする 79 個の候補がさらに明らかになりました。さらに、Kla が代謝酵素の機能に影響を与える可能性があることを示します。興味深いことに、我々は、CobB が K382la を調節し、解糖と細菌の増殖を促進することによって PykF の活性を特異的に調節できることを実証しました。我々の研究は、Klaの調節酵素と機能的ネットワークを同定し、大腸菌における解糖調節においてCobBによって触媒されるKla媒介分子機構を明らかにした。

翻訳後修飾 (PTM) はタンパク質機能の制御における重要な要素であり、真核生物の多様な細胞機能と疾患の進行の調節に重要な役割を果たしています 1,2。さらに、PTM が原核生物でも重要な機能を果たしているという証拠が増えています。たとえば、リジンアセチル化 (Kac) は、細菌の毒性 3、走化性 4、タンパク質の安定性 5、6 を制御します。我々は最近、リジン 2-ヒドロキシイソブチリル化（Khib）が細菌の代謝、転写、抗生物質耐性の制御に関与していることを発見しました7、8、9、10。しかし、原核生物における PTM の機能と制御機構の理解は依然として限られています。

リシンラクチル化（Kla）は、マクロファージの極性化と状態を制御するヒトヒストン上の新たに同定されたタイプのPTMとして最近報告されました11、12、13、14。さらなる研究では、ヒストン上の Kla が、多能性幹細胞の分化中および非小細胞肺がんの細胞代謝再プログラミングに影響を与える可能性があり 15,16、発がんを促進し、遺伝子転写の制御を介して神経興奮と関連していることが示されました 17,18。さらに、非ヒストンタンパク質 HMGB1 上の Kla は、多微生物敗血症におけるエキソソーム放出を促進することが示されています 19。データによると、Kla はヒト、マウス、イネ、ボトリチス・シネレアなどの真核生物で報告されています 11、18、20、21。しかし、Klaが原核生物に存在するかどうか、そしてこれらの未発見のKla修飾がどのような役割を果たしているのかは依然として不明である。

PTM の時間および空間に伴う動的な変化は、さまざまな細胞プロセスにおけるタンパク質の機能を調節する重要な生物学的事象であると考えられています。可逆的な PTM は通常、PTM を特異的に追加または除去する 2 種類の酵素によって制御されます。たとえば、リジンアセチルトランスフェラーゼ (KAT) およびリジンデアセチラーゼ (KDAC) は、さまざまなアシル化または脱アシル化を触媒することが広く報告されています 1,22,23,24。 Kla の場合、P300 は潜在的なラクチラーゼとして機能し、クラス I ヒストンデアセチラーゼ (HDAC1 ～ 3) はデラクチラーゼとして機能します 11,25。しかし、原核生物における Kla の調節酵素はまだ不明です。

今回、我々は大腸菌（E. coli）MG1655のKlaプロテオームをプロファイリングし、Klaのライターとイレーザーを同定し、細菌の解糖と増殖に対するKla媒介の影響を示した。我々は、GCN5関連N-アセチルトランスフェラーゼ（GNAT）ファミリータンパク質およびCobBを過剰発現する株をスクリーニングすることにより、ラクチラーゼとしてYiaCを、デラクチラーゼとしてCobBを同定した。さらに、YiaC と CobB は、in vitro と細胞内の両方で、それぞれリジンラクチル化の付加と除去を触媒できることを明らかにしました。次に、細胞培養アミノ酸による安定同位体標識（SILAC）ベースの定量的プロテオミクスアプローチを実行することにより、YiaC によって調節される可能性のある 79 個の内在性 Kla 部位と、CobB によって標的とされる 446 個の Kla 候補を同定しました。私たちは、大腸菌 MG1655 の 478 個のタンパク質上に合計 1,047 個の Kla 部位を同定し、ラクチル化タンパク質が主に代謝に関連していることを示しました。さらに、CobB が PykF K382la を消去して解糖を促進し、大腸菌の増殖を促進できることを実証しました。要約すると、この研究は細菌における Kla の調節酵素系を同定し、Kla の内因性基質タンパク質をプロファイルし、Kla を介した解糖調節の分子機構を説明します。

Kla は元々、真核細胞のヒストンマーカーとして同定されました 11、12、13、14。しかし、新規 PTM が原核生物に存在するかどうかは不明のままでした。この目標を達成するために、大腸菌の全細胞溶解物に対して汎 Kla 抗体を使用したウェスタンブロットアッセイを実行しました。補足図1aに示すように、多数のリジン乳化タンパク質が検出され、原核生物におけるKlaの存在が確認されました。

ライターとイレーザーによって調節される可逆的な PTM は、さまざまな細胞プロセスにおけるタンパク質の機能を調節します。したがって、原核生物における Kla の機能と調節機構を理解するには、Kla の調節酵素を同定することが不可欠です。これまでの研究では、アセチルトランスフェラーゼ (KAT) と脱アセチラーゼが、アセチル化、サクシニル化、クロトニル化などのさまざまなリジンアシル化を制御できることが示されています 24、26、27、28、29、30。したがって、我々は、一部の KAT と脱アセチラーゼが Kla の付加と除去を触媒する可能性があると合理的に仮説を立てました。

GNAT は、大腸菌内でリジンアセチラーゼとして機能する唯一のタンパク質ファミリーです 31,32。我々の最近の研究では、GNAT を過剰発現する大腸菌 BL21 (λDE3) 株をスクリーニングすることにより、TmcA がリジン 2-ヒドロキシイソブチリルトランスフェラーゼとして機能することが示されました9。ここでは、18 の GNAT 過剰発現大腸菌 BL21 (λDE3) 株 (pGNAT) を使用して、全細胞溶解物を汎 Kla 抗体で免疫ブロットすることによりラクチラーゼ候補をスクリーニングしました。空のpET28aベクターを保有する大腸菌と比較して、YiaCを過剰発現させるだけでKlaレベルの広範かつ明らかな増加が引き起こされることがわかり（図1a、補足図1b、c）、YiaCがリジンラクチラーゼ候補として同定されました。 Klaに対する触媒活性を確認するために、大腸菌MG1655 yiaC+およびΔyiaCのKlaレベルをさらに検出しました。イムノブロットの結果は、ΔyiaC 株の Kla レベルが大幅に減少していることを示しました (図 1b)。総合すると、我々の結果は、YiaC が Kla の生成を触媒するラクチラーゼの候補であることを示唆しています。

a YiaC の過剰発現により、大腸菌の Kla レベルが増加しました。大腸菌BL21（λDE3）を、対照として空のベクター（pET28a）を用いて、そしてGNAT過剰発現株（pGNAT）としてベクターGNAT遺伝子-pET28aを用いて移入し、全細胞溶解物のKlaレベルをイムノブロッティングにより分析した。 b YiaC の欠損により大腸菌の Kla が減少しました。大腸菌 MG1655 ΔyiaC の Kla レベルを、yiaC+ を対照として免疫ブロット法によって分析しました。 c CobB の過剰発現により、大腸菌の Kla レベルが減少しました。イムノブロッティングにより、コントロールとして pET28a を導入し、pCobB 株として cobB-pET28a を導入した大腸菌 BL21 (λDE3) の Kla レベルを分析しました。 d CobB の欠損により大腸菌の Kla が増加しました。大腸菌MG1655 ΔcobBのKlaレベルを、cobB+を対照として免疫ブロット法により分析した。すべてのイムノブロットでは 3 回の生物学的反復が行われ、同様の結果が得られました。そして、すべての株を LB 培地で 37 °C で培養しました。

大腸菌のデラクチラーゼを探索するために、CobB を過剰発現する大腸菌 BL21 (λDE3) 株 (pCobB) の Kla レベルを分析しました。CobB は、アセチル化、サクシニル化、およびアセチル化を除去するための大腸菌における主な既知の脱アシラーゼです。 2-ヒドロキシイソブチリル化8,33,34,35。空の pET28a ベクターを保持する大腸菌と比較して、pCobB 株は Kla レベルの大幅な減少を引き起こしました (図 1c)。その後、大腸菌 MG1655 ΔcobB では cobB+ と比較して Kla レベルがわずかに増加していることがわかりました（図 1d）。これらの結果は、CobB が内在性デラクチラーゼとして機能することを示しました。

アセチル-CoA またはアセチル-リン酸は、原核生物におけるアセチル化のためのアセチル基供与体として機能することが知られています 36。しかし、大腸菌にリン酸ラクチルが存在するという証拠はありません。ラクチル-CoA については、以前の研究で、新鮮な大腸菌タンパク質抽出物が乳酸を触媒してラクチル-CoA にすることができることが示唆されています 37,38。それを確認するために、対照として全細胞溶解物中のラクチル CoA を検出しました。予想通り、低レベルのラクチル-CoAが検出され（補足図2e）、ラクチル-CoAが大腸菌に存在することが示されました。次に、乳酸を新鮮な全細胞溶解物とインキュベートしたところ、乳酸が効果的にラクチルCoAに変換できることがわかりました（補足図2e）。

ラクチル CoA の形成をさらに理解するために、我々はラクチル CoA の潜在的な合成酵素または転移酵素を調査しました。まず、大腸菌におけるラクチルCoA合成酵素の候補として、アセチルCoA合成酵素(Acs)とプロピオン酸CoA合成酵素(PrpE)を選択した。 Acs または PrpE が乳酸塩からラクチル CoA への触媒作用を及ぼすことができるかどうかを調べるために、精製した Acs を酢酸塩または乳酸塩と、PrpE をプロピオン酸塩または乳酸塩とそれぞれインキュベートしました。しかし、AcsもPrpEも乳酸からのラクチルCoAの形成を触媒できないことが観察されました（補足図2c、d、f、g）。最近、Megasphaera elsdenii、Clostridium propionicum、Megasphaera sp.を含む異なる種に由来する 5 つの CoA トランスフェラーゼが存在することが報告されました。 DISK 18、クロストリジウムラクタティフェルメンタンス An75 およびファーミクテス属細菌 CAG:466 は、乳酸をラクチル CoA に変換できます 39,40。 BLAST検索の後、大腸菌の酢酸CoAトランスフェラーゼ（Ydif）は、特にモチーフEXGXXGおよびGXGGFにおいて、5つのトランスフェラーゼと高い配列保存性を持っていることがわかりました（補足図2a、b）。したがって、精製YdiFを酢酸塩または乳酸塩とインキュベートしました。興味深いことに、YdiFがin vitroで酢酸塩または乳酸塩からのアセチルCoAまたはラクチルCoAの変換を触媒できることがわかり（図2a、b）、YdifがラクチルCoAトランスフェラーゼ活性を有することが示唆されました。その細胞内触媒活性を確認するために、YdiF を過剰発現する大腸菌 BL21 (λDE3) 株 (pYdiF) の Kac および Kla レベルをさらに分析しました。空のpET28aベクターを保有する大腸菌と比較して、pYdiF株がKacおよびKlaレベルの有意な増加を引き起こすことがわかりました（図2c）。まとめると、我々の結果は、ラクチルCoAが大腸菌に存在すること、そしてYdiFが乳酸塩からラクチルCoAを変換するためのラクチルCoAトランスフェラーゼとして機能できることを実証している。

YdiF によってアセチル CoA (Ac-CoA) が生成されます。 − YdiF: アセトアセテートとアセトアセチル CoA (Acac-CoA) のインキュベーション、+ YdiF: アセテートとアセトアセチル CoA (Acac-CoA) の YdiF とのインキュベーション。 n = 3 生物学的繰り返し。 bは、YdiFによってラクチルCoA（la-CoA）を生成するために実行されます。 − YdiF: アセトアセチル CoA (Acac-CoA) と乳酸のインキュベーション、+ YdiF: YdiF とアセトアセチル CoA (Acac-CoA) と乳酸のインキュベーション。 n = 3 生物学的繰り返し。 c YdiF の過剰発現により、アセチル CoA およびラクチル CoA の形成が増加しました。イムノブロッティングにより、対照としてpET28aを導入し、pYdiF株としてydiF-pET28aを導入した大腸菌BL21(λDE3)のKacおよびKlaを分析した。 d ラクチル-CoA、アセチル-CoA、およびスクシニル-CoAとの組換えYiaCの親和性のITC分析、3つの生物学的反復、同様の結果。 e YiaC はアセチル化を触媒しましたが、スクシニル化は触媒しませんでした。イムノブロッティングにより、対照としてpET28aを導入し、pYiaC株としてyiaC-pET28aを導入した大腸菌BL21(λDE3)のKacおよびKsuccを分析した。 f Klaペプチド（AETAEK(la)YGDEQVK）およびKacペプチド（AETAEK(ac)YGDEQVK）と組換えCobBの親和性のITC分析、3回の生物学的反復、同様の結果。 g CobB は in vitro でペプチドの脱ラクチル化を触媒しました。合成ペプチド (AETAEK(la)YGDEQVK、AETAEK(ac)YGDEQVK) を CobB 反応の基質として使用し、CobB のリジン脱ラクチル化および脱アセチル化活性の LC-MS 検出を 3 回生物学的に繰り返し、同様の結果が得られました。 h YiaC は in vitro でのペプチドのラクチル化を触媒しました。合成ペプチド (TICHDKAFVR) を YiaC 反応の基質として使用し、YiaC のリジンラクチル化およびアセチル化活性の LC-MS 検出を 3 回の生物学的反復で行い、同様の結果が得られました。 i ラクチル化に関する YiaC および脱ラクチル化に関する CobB の速度論的パラメーター (kcat、Km、および kcat/Km)、n = 3 の生物学的繰り返し。データは、3 つの独立したアッセイ、両側スチューデント t 検定からの平均値 ± SEM です。 P値は図に示されています。すべてのイムノブロットでは 3 回の生物学的反復が行われ、同様の結果が得られました。すべての株を LB 培地で 37 °C で培養しました。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

以前の研究では、リジンアシラーゼは通常、関連するアシル-CoAと結合して触媒機能を開始するが、デアシラーゼはPTM8の除去を触媒するために対応する修飾リジンを認識する必要があることが示されている。したがって、等温滴定熱量測定 (ITC) アッセイを実行して、YiaC とラクチル CoA の結合、および CobB とラクチル化ペプチドの結合を検出しました。 YiaC は既知のリジンアセチラーゼであり、CobB は脱アセチラーゼ 32,33 であるため、アセチル CoA とアセチル化ペプチドを対照として別々に使用しました。予想通り、YiaC とラクチル CoA (KD = 6.83 μM) の間には強い結合があり、これはアセチル CoA (KD = 5.57 μM) と同様でした。代わりに、YiaC とスクシニル CoA の間に結合はありませんでした (図 2d、補足データ 1)。次に、YiaCの過剰発現は報告されているようにKacを上方制御する可能性がありますが、pET28aベクターで形質転換された大腸菌と比較してサクシニル化の変化は引き起こさないことがわかりました（図2e）。これはITCの結果と一致していました。これらの結果は、YiaC が Kla の付加を触媒できることを裏付ける証拠をさらに提供します。また、CobB とラクチル化ペプチド (AETAEK(la)YGDEQVK、GpmA 由来) およびアセチル化ペプチド (AETAEK(ac)YGDEQVK、GpmA 由来) との結合も検出しました。 ITCの結果は、CobBがアセチル化ペプチド（KD = 0.508μM）と同様に、ラクチル化ペプチド（KD = 0.371μM）と結合できることを示しました（図2f、補足データ1）。

YiaC および CobB の酵素活性を特徴付けるために、合成ペプチドを使用して in vitro での酵素反応アッセイをさらに実行しました。液体クロマトグラフィー MS (LC-MS) を使用して反応ペプチドの Kla と Kac をモニタリングし、MS/MS スペクトルを使用してその正確性を検証しました。 CobB をラクチル化またはアセチル化ペプチド (AETAEK(la または ac)YGDEQVK、GpmA 製) とインキュベートすることにより、CobB が NAD+ (ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド) の存在下でラクチルペプチドの加水分解を効率的に触媒することがわかりました。対照的に、NAD + なしの反応では脱ラクチル化ペプチドは検出されず、脱アセチル化と同様の NAD 依存性脱ラクチル化機構が示唆されました (図 2g)。その後、脱ラクチル化反応がニコチンアミド（NAM）（クラスIII HDAC阻害剤）によって阻害される可能性があり、NAMは脱ラクチル化よりも脱アセチル化に対してより効果的であることを発見しました（図2g）。これらの結果は、NAD 依存性 CobB が in vitro でリジン脱ラクチル化を触媒し、NAM によって効率的に阻害できることを示しました。さらに、YiaCをラクチルCoAまたはアセチルCoAを提示するペプチド（TICHDKAFVR）とインキュベートすることにより、YiaCがin vitroでラクチル化を触媒できることがわかりました。アセチル化と比較して、YiaC はラクチル化に対してより効率的である可能性があります (図 2h)。

YiaC および CobB の酵素反応速度論を決定するために、次にマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型 (MALDI-TOF) MS アッセイを使用して、YiaC および CobB の酵素反応速度論パラメーター (kcat、Km、および kcat/Km) を計算しました。ラクチル化には YiaC、脱ラクチル化には CobB。速度論的測定（図2i、補足図3、補足データ2）により、YiaCのラクチラーゼ活性が確認されました（kcat = 0.97±0.03s−1、Km = 26.6±1.1μM、kcat /Km = 3.6×104s−1） .M−1) はアセチラーゼよりも効果的です (kcat = 0.23 ± 0.04 s−1、Km = 28.7 ± 1.2 μM、kcat /Km = 8.0 × 103 s−1.M−1)。 CobB のデラクチラーゼ活性 (kcat = 0.99 ± 0.04 s−1、Km = 25.4 ± 1.5 μM、kcat /Km = 3.9 × 104 s−1.M−1) は、デアセチラーゼ活性 (kcat = 0.97 ± 0.02 s) と類似しています。 −1、Km = 18.7 ± 1.0 μM、kcat /Km = 5.2 × 104 s−1.M−1)。これらの結果は、ラクチル化については YiaC、脱ラクチル化については CobB の酵素反応速度論の特徴を示しています。

YiaCおよびCobBによって調節される内在性Kla基質を理解するために、SILACとアフィニティーエンリッチメントを組み合わせて定量的プロテオミクスを実行し、大腸菌のラクチロームに対するYiaCまたはCobB遺伝子の欠失の影響を分析しました（図3a）。 E. coli MG1655 yiaC+ 株と ΔyiaC 株を比較し、247 タンパク質の 451 Kla 部位を定量しました (補足データ 3)。検出された存在量を対応するタンパク質の発現に対して正規化し（補足図4a）、大腸菌ΔyiaCの79個の有意に下方制御されたKla部位（1.5倍以上の減少）を定量しました（図3b）。これらの下方制御された Kla は、潜在的に機能的な YiaC 標的基質である可能性があります。さらに、大腸菌 MG1655 cobB+ 株とΔcobB 株を比較して、375 タンパク質の 818 Kla 部位を定量しました (補足データ 4)。対応するタンパク質の量で正規化した結果（補足図4b）、結果は、cobB+株と比較してΔcobB株ではKla部位の半分以上が有意に上方制御されていた（1.5倍以上の増加）ことを示しました（図3c）。。合計 446 個の上方制御された Kla 部位が CobB 標的基質の候補でした。 YiaCとCobBによって標的化された候補を比較することにより、YiaCによってラクチル化されたタンパク質の63％がCobBの基質でもあることがわかりました（補足図4c）が、25のタンパク質上の29のKla部位のみがこれら2つの酵素によって顕著に共調節されていました（補足図4c）。 4d)、これは、YiaC と CobB から構成される Kla 調節システムが唯一のものではなく、他の細胞内調節酵素が存在する可能性があることを示しています。さらに、YiaC および CobB によって調節される可能性のある Kla ペプチドの配列特性を分析しました。図３ｄに示すように、酸性グルタミン酸塩およびアスパラギン酸塩、ならびに疎水性バリンが、ＹｉａＣ標的化Ｋｌａペプチドに位置するＫｌａを明らかに取り囲んでいた。さらに、酸性グルタミン酸、疎水性アラニン、および塩基性リジンが、CobB 標的 Kla ペプチドに位置する Kla を囲んでいました（図 3e）。配列特徴の違いは、YiaC と CobB が異なる特徴的なアミノ酸配列で Kla を触媒する傾向があることを示しました。これは、少数の一般的な規制対象サイトのみが特定された理由もある程度説明できます。 YiaC および CobB 制御の生物学的重要性を理解するために、YiaC または CobB が標的とする Kla タンパク質候補のジーンオントロジー (GO) 解析をさらに実行しました。 YiaCまたはCobBのKla候補はどちらも主に代謝と生合成、特に解糖に関連しており、主にリボソームとサイトゾルで多様性結合活性を持って存在することがわかりました（図3f、g）。これは、YiaCおよびCobBによって調節されるKlaを示唆しています。代謝と生合成に影響を与える可能性があります。

a SILAC 定量化の実験ワークフローの概略図。 b 大腸菌 MG1655 yiaC+ 対 ΔyiaC における Kla ペプチドの比を示す散布図 (タンパク質存在量によって正規化)。 c 大腸菌 MG1655 cobB+ 対 ΔcobB の Kla ペプチドの比を示す散布図 (タンパク質存在量によって正規化)。 d 配列モチーフのロゴは、YiaC 調節 Kla 部位の代表的な配列を示します。 e 配列モチーフのロゴは、CobB 調節 Kla 部位の代表的な配列を示します。 f YiaC によって標的化された Kla タンパク質候補の GO 分析。 g CobB によって標的化された Kla タンパク質候補の GO 分析。 p 値カットオフ = 0.05 および q 値カットオフ = 0.2 がカットオフ基準として選択されました。 Benjamini および Hochberg 補正を使用して P 値を調整しました。

原核生物における Kla の生物学的特徴は依然として不明瞭であったため、補足データ 3、4 にリストされている 2 つの定量化されたラクチロームデータを組み合わせて、野生型大腸菌 MG1655 で同定されたすべての Kla データを大腸菌のラクチロームとして選択しました。我々は、478個のタンパク質において合計1047個のKla部位を同定した（図4a、補足データ5）。タンパク質中の Kla の頻度を分析したところ、ほとんどの同定されたタンパク質 (約 57%) には 1 ～ 2 個の Kla 部位があり、タンパク質の 11% には 5 つ以上の Kla 部位があることがわかりました。興味深いことに、Kla部位が豊富な多くのタンパク質は代謝酵素および生合成酵素であり（図4b）、これはKlaが細菌の代謝および生合成に機能的影響を及ぼしている可能性があることを示しています。 Klaペプチドの配列特性を分析すると、酸性グルタミン酸と塩基性リジンが高い信頼性でKlaに囲まれていることがわかりました（補足図5a）。さらに、このラクチロームのGO分析により、ラクチル化タンパク質は主に代謝、翻訳、リボソーム構築、生合成に関連しており、主に多様な結合活性を持つリボソームで発生することが示されました（補足図5b）。基質に対する Kla の確率を分析するために、野生型大腸菌 MG1655 で同定された Kla の強度を対応するタンパク質の強度で割った値を使用しました。タンパク質上で高頻度の Kla 部位として比率 > 0.001 を定義しました (補足データ 6)。したがって、240のタンパク質上の合計323のKla部位が高頻度で発生すると定義されました（補足図5c、d）。 GO 分析により、高頻度 Kla を持つこれらのタンパク質も主にさまざまな代謝経路に関連していることが示されました（補足図 5e）。注目すべきことに、経路におけるラクチル化タンパク質のさらなる分析により、解糖、トリカルボン酸回路（TCA）、および脂肪酸生合成におけるほとんどすべての酵素がラクチル化されていることが明らかになりました。さらに、これらの酵素のほとんどは、CobB または YiaC 制御の候補としても同定されました (図 4c)。また、CobB は YiaC よりも広い調節範囲を持ち、同じタンパク質を共同で調節したり、独自の特異的な調節タンパク質を持ったりすることができることも示されました。

a Kla タンパク質と大腸菌の部位の統計分析。 b Kla の頻度はタンパク質上に発生します。 c 大腸菌の中心炭素代謝および脂肪酸生合成ネットワークにおけるラクチル化酵素。

YiaC および CobB によって調節される Kla の機能を調べるために、我々は in vitro 実験を実施しました。 Klaネットワーク（図3b、c）に従って、YiaCおよびCobBをそれぞれの候補タンパク質とインキュベートする一連のインビトロ反応をさらに実行しました。次に、候補タンパク質の Kla レベルをイムノブロッティングによって検出しました。 YiaCはクエン酸シンターゼ（GltA）とニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（PncB）を効果的に乳化できるが（図5a、b）、CobBはピルビン酸キナーゼI（PykF）、2,3-ビスホスホグリセリン酸依存性ホスホグリセリン酸ムターゼ（GpmA）を明らかに脱ラクチル化できることがわかりました。 in vitro でのリンゴ酸デヒドロゲナーゼ (Mdh) (図 5c–e)。したがって、YiaC と CobB はさまざまな代謝酵素と生合成酵素の Kla レベルを調節できることがわかります。特に、CobBはインビトロで解糖酵素を広く脱ラクチル化することができ、これは図3gに示すGO分析の結果と一致しています。

a、b YiaC は、in vitro で GltA および PncB の Kla を特異的に触媒できます。組換え GltA または PncB をラクチル CoA (1 mM) の存在下で YiaC と 25 °C で 10 時間インキュベートし、イムノブロッティングを実行しました。 c–e CobBは、in vitroでGpmA、Mdh、およびPykFのKlaを特異的に消去できます。組換え GpmA、Mdh、または PykF を CobB と 25 °C で 10 時間インキュベートし、イムノブロッティングを実行しました。 f 同定された酵素の Kla 部位のリスト。 g-i 酵素およびその変異体（K から Q および K から R）の活性の検出（データは 3 つの独立したアッセイ、両側スチューデント t 検定からの平均値 ± SEM）。すべてのイムノブロットでは 3 回の生物学的反復が行われ、同様の結果が得られました。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

Klaが酵素活性に影響を与えることができるかどうかを判断するため。まず、補足データ3および4からYiaCおよびCobBによって調節されるこれらのタンパク質のKla部位を確認し（図5f）、次に、Klaの電気的特性が中性であるため、ラクチル化KをQ（グルタミン）に置き換えました。 K の正電荷は R の正電荷と類似しているため、未修飾の K をグルタミンの R (アルギニン) に置き換えました。 in vitro での酵素活性アッセイを組み合わせると、Kla 変異体 PncBK381Q、GpmAK106Q、および PykFK382Q をシミュレートする酵素活性が野生型タンパク質と比較して大幅に減少しました。未修飾の変異体PncBK381R、GpmAK106R、およびPykFK382Rの酵素活性は増加しました（図5g-i）。これらの結果は、YiaC と CobB が Kla を媒介して代謝酵素の活性に影響を与える可能性があることを示唆しています。

特に代謝経路と合成経路は細菌の増殖に影響を与えます42、43、44。したがって、我々は、Kla によって引き起こされる PncB、GpmA、および PykF 活性の変化が細菌の増殖に影響を与える可能性があると合理的に予測しました。この仮説を確認するために、まず YiaC 関連プロテオームから 3 種類の Kla ペプチドを合成し、ペプチド PncB K381la (TICHDK(la)) を含む CobB 関連プロテオームから 3 種類の Kla ペプチドを合成して、同定された Kla ペプチドの信頼性を確認しました。 AFVR)、GpmA K106la (AETAEK(la)YGDEQVK)、および PykK382la (LDAPLIVVATQGGK(la)SAR)。図6a、bおよび補足図6に示すように、合成KlaペプチドのMS/MSスペクトル全体は、細胞内修飾ペプチドとほぼ完全に重複しています。したがって、Kla ペプチドの信頼性が確認されました。次に、大腸菌 MG1655 を過剰発現する PykF、PykFK382Q、および PykFK382R 株 (pPykF、pPykFK382Q、および pPykFK382R 株) を個別に構築し、pPncB、pPncBK381Q、pPncBK381R、pGpmA、pGpmAK106Q、および pGpmAK1 を構築しました。 06R株。次に、溶原性ブロス(LB)培地で培養した後、増殖曲線を検出した。 pPncB、pGpmA、およびそれらの変異株は成長に差がないことがわかりました（補足図7a、b）。ただし、PykFグループでは、同じ過剰発現レベルの3つの株の中で、pPykFK382R株の増殖が最も速く、pPykFK382Q株の増殖が最も遅かった（図6c、d）。さらに、細胞内 PykF 活性も検出されました。増殖曲線と一致して、pPykFK382R株は3つの株の中で最も高い活性を示し、pPykFK382Qは最も低い活性を示しました（図6e）。報告されているように、PykF は解糖における重要な律速酵素であり、代謝フラックスを制御し、細菌の細胞分裂に影響を与えます 45。これらの結果は、PykF K382la が PykF 活性を低下させることによって細菌の増殖を遅らせることを示しています。この観察をさらに確認するために、グルコース解糖によって生成されるホスホエノールピルビン酸が PykF46,47 の触媒作用の下でピルビン酸を生成できることを考慮して、PykF に通常の代謝機能を実行させるために 1% グルコースを含む M9 最小培地を選択し、1% ピルビン酸を含む M9 最小培地を選択しました。 PykF の機能をブロックします。次に、LB と同様に 1% グルコースを含む M9 最少培地中でこれら 3 株の増殖曲線と細胞内 PykF 活性を測定しました。 pPykFK382R株は最も速く増殖し、最も高いPykF活性を示し、pPykFK382Q株は最も遅く増殖し、最も低いPykF活性を示した(図6f、g)。逆に、PykF の影響をブロックするために、1% ピルビン酸を含む M9 最少培地で培養したこれら 3 株の増殖曲線と細胞内 PykF 活性を測定しました。 3つの株の増殖に差がないことがわかりました（図6h）。これらの結果は、PykF K382la が PykF 活性を低下させることによって細菌の増殖に影響を与えることを示しています。

a ΔcobB のプロテオームからのペプチド (LDAPLIVVATQGGK(la)SAR、PYKF) の MS/MS スペクトル。 b 合成ペプチドの MS/MS スペクトル (LDAPLIVVATQGGK(la)SAR)。 c Hisタグ抗体を用いた免疫ブロッティングによる、過剰発現株に対する組換えPykFの同じ発現の選択。 d 96ウェルプレートを使用し、37℃のLB培地で培養したPykF過剰発現大腸菌株（pPykF、pPykFK382Q、およびpPykFK382R）の測定増殖曲線。ｅｄ．に関連する株のＰｙｋＦの細胞内活性の測定。 f 96ウェルプレートを使用し、1％グルコースを含むM9培地で37℃で培養したpPykF、pPykFK382Q、およびpPykFK382R株の測定増殖曲線。ｇｆ．に関連する菌株のＰｙｋＦの細胞内活性の測定。 h 96ウェルプレートを使用し、1％ピルビン酸を含むM9培地で37℃で培養したpPykF、pPykFK382Q、およびpPykFK382R株の測定増殖曲線。 i CobB は、in vitro で PykF K382la の脱ラクチル化を触媒しました。合成 PykF K382la ペプチド (LDAPLIVVATQGGK(1a)SAR) を CobB 反応の基質として使用し、CobB のリジン脱ラクチル化活性を LC-MS で検出しました。 j、k in vitroでK382laを消去することによるCobB制御PykF活性。 PYKFをCobBとインキュベートしてK382laを減少させ(j)、脱ラクチル化後、PykFの活性を検出した(k)。 l 96ウェルプレートを使用し、1％グルコースを含むM9培地で37℃で培養した大腸菌MG1655 cobB+およびΔcobB株の測定増殖曲線。ｍｌに関連する菌株のＰｙｋＦの細胞内活性の測定。 n 96 ウェルプレートを使用し、1% ピルビン酸を含む M9 培地で 37 °C で培養した大腸菌 MG1655 cobB+ および ΔcobB 株の測定増殖曲線。 o PykF-FBP システムの MD シミュレーション結果の 3D 解析。 PykF K382la-FBP システムの 3D 解析 MD シミュレーション結果。 PykF 活性と増殖曲線の測定では、n = 3 の生物学的複製、データは平均値 ± SEM、両側スチューデント t 検定、P 値は図に示されており、NS は有意ではないことを意味します。 OD600、600 nm での光学密度。免疫ブロットでは 3 回の生物学的反復が行われ、同様の結果が得られました。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

ラクチロームは、CobBが細胞内でPykF K382laを脱ラクチル化したことを示した（図5f）。この結果を確認するために、PykF K382laペプチド（LDAPLIVVATQGGK(la)SAR）をCobBとインキュベートし、LC-MS/MSで生成物を検出しました。結果は、CobBがin vitroでPykF K382laの脱ラクチル化を効果的に触媒できることを示しました（図6i））。したがって、PykFをCobBとインキュベートしてPykF K382laを消去し（図6j）、その後活性を検出しました。結果は、PykF K382laを消去するCobBがインビトロでPykF活性を増強することを示した(図6k)。細胞内アッセイでは、1% グルコースまたは 1% ピルビン酸を含む M9 最少培地で培養した cobB + および ΔcobB 株の増殖曲線と細胞内 PykF 活性を測定しました。さらに、本発明者らは、１％グルコースを含むＭ９最少培地において、ｃｏｂＢ＋株がΔｃｏｂＢ株よりも速く増殖することを発見した（図６ｌ）。さらに、cobB + の細胞内PykF活性はΔcobB株よりも高かった(図6m)。予想通り、cobB + 株とΔcobB 株の増殖に差はありませんでした（図6n）。まとめると、これらの結果は、CobB がインビトロおよび細胞内で PykF K382la を消去することによって PykF 活性を調節し、細菌の増殖に影響を与えることができることを示しています。

以前の研究では、フルクトース 1,6-二リン酸 (FBP) が PykF と結合して PykF をアロステリックに活性化することができ、K382 が PykF48、49、50 の重要な部位関連アロステリック制御であることが示されています。したがって、K382laによるPykF活性の低下は、アロステリック活性化への影響によるものである可能性があると推測されました。これを確認するために、PykF-FBP および PykF K382la-FBP に対して 100 ns の分子動力学 (MD) シミュレーションをそれぞれ 3 回実行しました。 2 つのシステム複合体の動的安定性を観察するために、出発構造から二乗平均平方根偏差 (RMSD) を監視しました。これら 2 つのシステム複合体の平均 RMSD はわずかに変動することがわかり (補足図 8a)、両方のシステムが安定していることを示唆しています。結合への影響をより深く理解するために、PykF-FBP システムと PykF K382la-FBP システムの両方で、K382 側鎖の窒素原子と FBP の中心炭素原子の間の平均距離をそれぞれ 45 ns から 100 ns で測定しました (補足図8b)。 PykF-FBP系ではK382とFBP間の3倍の平均距離は非常に安定しているが、PykF K382la-FBP系ではK382laとFBPの平均距離が大きく変動することがわかった。この結果は、PykF K382laがFBPとPykFの間の結合に影響を与える可能性があることを示しています。微細構造の変化を観察するために、2 つのシミュレーションプロセスで GROMACS を使用して、それぞれ初期構造と安定構造 (0 ns と 55 ns) を選択しました。 PykF-FBP系の場合、初期構造におけるK382とFBPの距離は9.4Åであり、安定構造における距離はわずか8.4Åであることがわかります（図6o）。 PykF K382la-FBPシステムの場合、初期構造におけるK382laとFBPの距離は10.7Åですが、安定構造における距離は15.8Åです（図6p）。したがって、これらの結果は、PykF K382laがFBPとPykFの間の結合を妨げ、PykFのアロステリック活性化をさらに弱め、最終的にPykFの活性を低下させることを示唆した。

乳酸は、以前は代謝廃棄物と考えられていましたが、現在では哺乳類における重要な代謝産物として認識されています。乳酸は、3 炭素化合物 51 を提供し、細胞微小環境を調節して腫瘍の発生と免疫応答を調節することにより、主要な循環炭水化物燃料として機能します 52,53。リジンのラクチル化の発見は乳酸による機能制御の地平を開き、ヒストン上の Kla は真核生物の転写を制御する重要なマーカーとして機能しました 11、15、17。これらすべての証拠は、Kla の重要性を示しています。細菌の場合、乳酸塩は最初に普遍的な二次代謝産物として特定され、細菌発酵が乳酸塩の工業生産の主な方法となっています54。乳酸は細菌代謝の重要な炭素源として機能し 55、微生物の乳酸利用はストレス耐性、細胞壁リモデリング、病原性因子を調節する可能性があります 56。さらに、宿主微生物の代謝産物は、多くの生理学的プロセスや疾患の発症に影響を与える重要な因子であり57、乳酸塩は微小環境を乱して免疫応答を引き起こす可能性があります56,58。 Klaが原核生物に存在するかどうか、またKlaがどのような生物学的機能を発揮するのかはまだ不明である。したがって、細菌における Kla の特徴、機能、および調節機構を調査する必要があります。

私たちの研究は、Kla が細菌タンパク質に広く分布していることを示しています。重要なのは、CobBがデラクチラーゼとして機能し、YiaCがラクチラーゼとして機能する一対のKla触媒酵素を同定したことです（図7）。熱力学的結合定数と酵素反応速度論により、CobB と YiaC の触媒能力を特徴付け、さらに CobB による脱ラクチル化の制御機構が NAD に依存し、YiaC によるラクチル化が La-CoA に依存することを証明しました。 Klaの生成については、大腸菌におけるKlaの供与体としてラクチルCoAの存在を検出し、新鮮な全細胞溶解物が乳酸塩のラクチルCoAへの変換に対して触媒活性を示すことを発見した（補足図2e）。さらに、大腸菌でラクチルCoAを生成するトランスフェラーゼとしてYdiFを同定しました（図2a-c）。

YiaC と CobB は大腸菌の Kla を調節し、PykF 活性を調節することで細菌の増殖に影響を与えます。

内因性調節ネットワークを理解するために、定量的プロテオミクスを実行し、YiaC によって調節される 79 個の Kla 候補部位と CobB によって標的化される 446 個の Kla 候補部位を同定しました。 YiaC と P300 は異なるタンパク質ファミリーに属しており、後者はヒト細胞内でラクチラーゼ活性を持ち 11、CobB はデラクチラーゼであり、真核生物でデラクチラーゼとして機能する HDAC1-3 とも異なります 25。したがって、この発見は、真核生物には他の潜在的なラクチラーゼおよびデラクチラーゼが存在する可能性があることを示しています。さらに、YiaC はリジンおよび N 末端アセチラーゼとして以前に報告されており 59,60、CobB はリジンアセチラーゼ、サクシニラおよび 2-ヒドロキシイソブチリルトランスフェラーゼとして報告されています 8,33,34。したがって、私たちは、調節および機能の多様性におけるアシル化調節酵素の理解を広げました。リジンのアシル化は、アシル-CoA および対応する有機酸の代謝に用量依存しており 61,62、代謝の変化により調節酵素が動員されてアシル化レベルを調節する可能性があります。乳酸はグルコース発酵下で大腸菌内に蓄積し 63、乳酸レベルの増加により YiaC と CobB が動員されて Kla のバランスが維持される可能性があります。

ここでは、細菌のリジンラクチロームの包括的な分析を報告します。合計 1,047 個の Kla 部位が大腸菌の 478 個のタンパク質で同定されました。この修飾は広く行われていますが、主に代謝酵素が豊富です。図4cに示すように、解糖系とTCAのほとんどすべての酵素がラクチル化されています。注目すべきことに、これらの酵素はCobBの標的となる候補としても同定されており、CobBがKlaを消去して代謝酵素の活性を調節している可能性があることが示唆されている。実際、我々の結果は、CobB と YiaC が Kla を媒介してそれらの基質に影響を与えることができることを示しています。例えば、CobB は GpmA の K106la および PykF の K382la を下方制御して対応する酵素の活性を高め、YiaC は PncB の K381la を上方制御して PncB の活性を低下させます。重要なことに、我々は、CobB が PykF の K382la を消去して解糖と細菌の増殖を促進することを実証しました。私たちの研究は、Kla が真核生物における Kla の転写調節とは異なり、細菌の代謝に対して広範な調節効果を持っていることを明らかにしています 11,15。細菌における嫌気性解糖の最終生成物 (図 7)55 として、乳酸は触媒作用を受けて、Kla11 の生成に必要な基質であるラクチル CoA を生成します。したがって、代謝産物は細胞内代謝酵素の Kla レベルに効果的に影響を与える可能性があります。逆に、私たちの研究は、CobBを介したKlaが代謝酵素の活性を調節し、さらに解糖に影響を与えることを明らかにし、代謝とPTMのバランスを調節する代謝-PTM-代謝シグナル伝達カスケードを示唆しています。

要約すると、我々は当初、YiaCがリジンアクチラーゼであり、CobBがデラクチラーゼとして機能する原核生物のKla制御システムを同定した。続いて、我々は YiaC および CobB の内因性候補をプロファイリングし、原核生物における YiaC および CobB によって調節される Kla の多様な機能を調査するための枠組みを提供しました。さらに、478 個のタンパク質に 1047 個の Kla 部位を含む大腸菌のラクチロームの特性についても説明しました。重要なことに、我々は、CobB が K382la を消去し、解糖と細菌の増殖を促進することによって PykF の活性を増加させることができることを実証しました。私たちの研究は、Kla の調節システムと分子ネットワークを提示し、細菌の代謝調節のための Kla を介した機構についての新たな洞察を提供します。

大腸菌 MG1655 細胞と大腸菌 MG1655 ΔcobB 細胞は以前の研究から得られました8、大腸菌 BL21 (λDE3) は TIANGEN から、大腸菌 MG1655 ΔyiaC から、そして GNAT ファミリー遺伝子を過剰発現する大腸菌 BL21 (λDE3) 株は私たちの以前の研究9から得られました。すべての抗アシリシン抗体は PTM Biolabs Inc から購入しました。すべての合成ペプチドは SciLight Biotechnology, LLC によって生成されました。抗体 (すべて 1:1000 に希釈) およびその他の試薬は補足データ 7 にリストされています。

この方法は、以前に説明したように実行されました9。詳細には、大腸菌でタンパク質を発現するプラスミドを構築しました。 pEASY®-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit (TRANS) を使用して、pET28a-cisY、pET28a-pncB、pET28a-gpmA、pET28a-mdh、pET28a-pykF、および pBR322-pykF-His タグのプラスミドを構築しました。突然変異については、Fast Mutagenesis System (TRANS) を使用して点突然変異遺伝子を含むベクターを構築しました。 PCRに使用されるすべてのプライマーは補足データ7にリストされています。pET28aの構築されたベクターを、過剰発現株のために大腸菌BL21（λDE3）に形質転換しました。構築した pBR322 ベクターを大腸菌 MG1655 に形質転換し、アンピシリン (Amp、50 μg ml-1) を含む LB 培地中で 37 ℃、220 rpm で振盪したフラスコで培養しました。一晩中。

遺伝子 pET28a ベクターで形質転換された構築された大腸菌 BL21 (λDE3) を、カナマイシン (Kana、50 μg ml-1) を含む LB 培地中で、振盪フラスコ内で 16 °C で、600 nm での光学密度が 0.6 ～ 0.8 になるまで培養しました。。次に、0.05 mM IPTG を使用して 16 °C で一晩細胞を誘導し、続いてイムノブロッティングまたはタンパク質精製のために全細胞溶解物を収集しました。タンパク質は、溶解バッファー (20 mM Tris-HCl、pH 8.0、10 mM MgCl2、1 mg ml-1 リゾチーム、50 U ml-1 ヌクレアーゼ) によって培養細胞から収集されました。次に、タンパク質を HisPur Ni-NTA 樹脂と混合し、洗浄バッファー (20 mM Na3PO4、300 mM NaCl、25 mM イミダゾール、pH 7.4) で洗浄し、過剰発現したタンパク質を溶出バッファー (20 mM Na3PO4、300 mM NaCl、 250 mM イミダゾール、PH 7.4)。溶出液を収集し、保存緩衝液（１００ｍＭＨＥＰＥＳ、１０ｍＭＭｇＣｌ２、７．７ｍＭＫＣｌ、ｐＨ７．０）中でＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−０．５遠心濾過装置を使用して濃縮した。

以前に説明したようにラクチル-CoAを合成しました8。具体的には、乳酸とチオフェノールを含むジメチルホルムアミド混合溶液にジシクロヘキシルカルボジイミドを加えて４℃で撹拌し、冷水を加えて反応を停止した。溶液をエーテルで抽出し、飽和食塩水で３回洗浄し、エーテル抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチルとヘキサンの２０：１混合液で溶出）で精製した。シリカ薄層クロマトグラフィー（酢酸エチルとヘキサンの１：４混合物によって溶出）。精製物を０．１Ｍ重炭酸ナトリウムに溶解し、次いでＣｏＡのナトリウム塩を含む重炭酸ナトリウム緩衝液に０℃で加えた。一晩放置した後、ＨＣｌによりｐＨ７．０まで反応を停止させた。最終生成物から水を30℃で蒸発させ、エーテルと酢酸エチルで抽出した。

この方法は、以前に説明したように実行されました64。詳細には、最終濃度０．３μＭの精製ＡｃｓまたはＰｒｐＥを反応緩衝液［５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１０ｍＭＭｇＣｌ２、２．５ｍＭＡＴＰ、０．５ｍＭＨＳＣｏＡ、３ｍＭホスホエノールピルビン酸、０．１ｍＭＮＡＤＨ、１Ｕピルビン酸キナーゼ］に添加した。、1.5 U 乳酸デヒドロゲナーゼ、5 U ミオキナーゼ、10 mM DTT、および 0.2 mM 有機酸基質 (酢酸塩、乳酸塩およびプロピオン酸塩)、PH 7.5]、25 °C で 30 分間。等量の10% (v/v) トリフルオロ酢酸を加えて反応を停止し、C18 ZipTipsで洗浄した後、アクチル-CoAの生成物をLC-MS/MSで分析しました。各反応を生物学的に 3 回繰り返しました。

この方法は以前に説明されています37。詳細には、大腸菌 MG1655 を振盪フラスコ内で LB 培地中で 37 °C で一晩培養し、遠心分離によって細胞を回収し、その後ライセートバッファー [50 mM NaH2PO4、50 mM NaH2PO4 および 5 mM MgCl2、PH 7.0] を加えて細胞を破壊しました。氷上で超音波により上清を高速遠心分離により全タンパク質溶解物として抽出した。次いで、BCAによりタンパク質濃度を測定し、タンパク質濃度を2 mg/mlに調整した。反応系として全タンパク質ライセートに5 mM ATP、2 mM HSCoA、10 mM DTT、0.5 mM 乳酸を加え、等量の10％（v/ v) トリフルオロ酢酸と遠心分離、上清を C18 ZipTips で洗浄し、ラクチル CoA の生成物を LC-MS/MS で分析しました。各反応を生物学的に 3 回繰り返しました。

YdiF CoA トランスフェラーゼ活性のアッセイは、以下のようにわずかに変更を加えて、以前に記載したように 40 実施しました。酵素反応は、1 mM アセトアセチルCoAおよび10 mM L-乳酸塩または酢酸塩を35℃で20分間反応させ、7.5μgの精製YdiFを添加することによって初期化した。反応混合物の総量は50μLであった。開始前に、混合物を指定の反応温度で 5 分間プレインキュベートしました。等量の10% (v/v) トリフルオロ酢酸を加えて遠心分離することによって反応を停止させ、上清をC18 ZipTipsで洗浄し、ラクチル-CoAの生成物をLC-MS/MSで分析した。各反応を生物学的に 3 回繰り返しました。

水に溶解したサンプルは、前述の設定を使用して、ポジティブ ESI モードの Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific) 質量分析計によって分析されました 65,66。詳細には、サンプルを ACQUITY UPLC BEH C18 カラム (2.1*100 mm、1.7 μm) で分離し、15 分間の HPLC 勾配を次のように設定しました: 98% 緩衝液 A (5 mM を含む水で 0.2 mL/min) の流量酢酸アンモニウム）および 2% 緩衝液 B（5 mM 酢酸アンモニウムを含む水中の 95 % アセトニトリル）で 0 分間、98 ～ 70% 緩衝液 A で 8 分間、70 ～ 2% 緩衝液 A で 1 分間、2% 緩衝液 A で 3 分間分、2 ～ 98% バッファー A で 1 分間、98% バッファー A で 2 分間。 MS 分析には Orbitrap Exploris 480 (Thermo Fisher Scientific) を使用しました。スプレー電圧は 3.5 kV、ファンネル RF レベルは 40、イオントランスファーチューブの温度は 320 °C に設定されました。データは Xcalibur (v.4.0.27.19) によって収集されました。オービトラップ質量分析装置は、分解能 120,000 の MS1 検出器として使用されました。正規化された AGC ターゲットと最大注入時間は、MS1 の 70%/標準に設定されました。 MS2 検出器は 15,000 の分解能で使用されました。目標質量設定は、ラクチル CoA: 840.1436、アセチル CoA: 810.1330、プロピオン酸 CoA: 824.1487 です。 MS2 分離ウィンドウは 2 Da、質量許容差は 10 ppm で、前駆体の断片化には正規化された HCD (高エネルギー衝突誘起解離) 衝突エネルギー 25 % が使用されました。アシル-CoA の相対強度は、Xcalibur (v.4.0.27.19) によって分析されました。

この方法は以前に説明しました8。詳細には、MicroCal PEAQ-ITC滴定熱量計(Malvern Instruments)を37℃で使用して、50μMのYiaC(またはCobB)を含む反応セルを500μMの異なるアセチル-CoA(またはアクチル化ペプチド)で滴定した。最初の注入量は、500μM アクチル-CoA (またはアセチル化ペプチド) 0.5 μl であり、その後の 18 回の注入量は 2.0 μl でした。結合等温線は、Origin 8.0 ソフトウェア (OriginLab) を使用してフィッティングされました。各グループには 3 つの生物学的反復がありました。

CobB 反応は以前に記載されています8。詳細には、1 μM CobB を含むラクチル化またはアセチル化ペプチド (50 μM) を CobB 反応バッファー [50 mM Tris-HCl、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl2、1 mM DTT、および 1 mM NAD+ (pH)] 中でインキュベートしました。 8.5)] 10 mM NAM の有無にかかわらず、37 °C で 2 時間。 YiaC 反応では、未修飾ペプチド (50 μM) と 5 μM YiaC を YiaC 反応バッファー [100 mM HEPES、100 mM MgCl2、10 mM KCl、および 0.1 mM ラクチル-CoA またはアセチル-CoA (PH = 7)] 中でインキュベートしました。 37℃で2時間。等量の 10% (v/v) トリフルオロ酢酸で反応を停止した後、サンプルを 18,000 × g で 10 分間遠心して酵素を分離しました。サンプルは、28 分間の HPLC 勾配 [5 ～ 50% HPLC 緩衝液 B (アセトニトリル中 0.1% ギ酸) の直線勾配で 3 分間、その後 100% 緩衝液 B まで 20 分間、100% 緩衝液 B を 5 分間保持する] によって分離しました。分]。

この方法は以前に説明しました8。 CobB を、CobB 反応バッファー中で修飾ペプチド (AETAEK(la)YGDEQVK または AETAEK(ac)YGDEQVK、GpmA 製) とともに 37 °C で 2 分間インキュベートしました。一方、YiaC を未修飾ペプチド (TICHDKAFVK、PncB 製) とともに YiaC 反応バッファー中でインキュベートしました。ペプチドの濃度は5、10、16、32、60、および285μMであり、反応時間は1、5、15、および30分であった。等量の 10% (v/v) トリフルオロ酢酸を加えて反応を停止し、C18 ZipTips で洗浄した後、生成物を遅延イオンを備えた反射陽イオンモードを備えた Autoflex III TOF/TOF 質量分析計 (Bruker Daltonics) で分析しました。抽出。 2,5-ジヒドロキシ安息香酸 (DHB) と混合した 0.1 μl サンプルを MS で分析しました。加速電圧は２０ｋＶとした。 MS データは、スペクトル処理とピーク検出のために FlexAnalysis ソフトウェアを使用して分析されました。酵素動態は、Prism GraphPad 8.0 ソフトウェアによって分析されました。

前述のように8、大腸菌 MG1655、大腸菌 MG1655 ΔyiaC および ΔcobB は、0.2% グルコースおよび L-リジン (100 mg ml-1) または 13C6-リジン (100 mg ml-1) を含む M9 最少培地で 37 °C で培養されました。１）図３Ａに示す。細胞を指数関数期中期に採取し、氷上でＰＢＳ中で超音波処理した。 4℃で20分間遠心分離（20,000 g）した後、上清を収集しました。等量の大腸菌 MG1655 および MG1655 ΔyiaC (または ΔcobB) 由来のタンパク質を混合し、トリクロロ酢酸で沈殿させ、トリプシンで一晩消化して沈殿を 100 mM NH4HCO3 に溶解しました (トリプシン:タンパク質比、1:50)。消化産物を 10 mM DTT とともに 37 °C で 1 時間インキュベートし、続いて 20 mM ヨードアセトアミドを用いて暗所、室温で 45 分間アルキル化しました。過剰なヨードアセトアミドを 20 mM システインでブロックし、最後の消化を 1:100 の比率で 4 時間実行しました。生成物をSepPak C18カートリッジ(Waters)により脱塩し、乾燥させた。

トリプシンペプチドをNETN緩衝液（50 mM Tris-HCl pH 8.0、100 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5% Nonidet P-40）に再溶解し、抗ラクチルリシン抗体結合プロテインAアガロースビーズ（PTM Biolabs）とともに4℃でインキュベートしました。 ℃で一晩、穏やかに回転させます。インキュベートしたビーズをNETN緩衝液で3回、ETN緩衝液(50mM Tris-HCl pH 8.0、100mM NaClおよび1mM EDTA)で2回、そして水で3回洗浄した。結合ペプチドを 1% トリフルオロ酢酸で 3 回溶出しました。最後に、ナノ HPLC-MS/MS 分析の前に、溶出液を乾燥させ、C18 ZipTips (Millipore Corp) で洗浄しました。

濃縮されたペプチドを HPLC-MS/MS によって分析しました。サンプルを 0.1% ギ酸で再構成し、ナノ LC システム (EASY-nLC 1200、Thermo Fisher Scientific) に注入しました。ペプチドは、内径 75 μm、長さ 25 cm の C18 カラム (3 μm、Dr. Maisch GmbH、Ammerbuch、ドイツ) により流速 300 nL/分で分離されました。勾配溶出は、2～45% HPLC 緩衝液 B (80% アセトニトリル中 0.1% ギ酸) で 90 分間実行し、その後 100% 緩衝液 B に 15 分間移行し、100% 緩衝液 B で 5 分間保持しました。 MS 分析には、FAIMS Pro インターフェイスを備えた Orbitrap Eclipse Tribrid 質量分析計 (Thermo Fisher Scientific) を使用しました。スプレー電圧は 2.1 kV、ファンネル RF レベルは 40、イオン移送管温度は 320 °C に設定されました。質量分析は、最も強力な前駆体のデータ依存取得 (DDA) モードで実行され、データは Xcalibur (v.4.0.27.19) によって収集されました。 -40V/-60V/-80V FAIMS CV（補償電圧）の組み合わせは、1 秒サイクルの間 DDA モードを実行するように設定され、3 秒の大きなサイクルを構築しました。オービトラップ質量分析装置は、分解能 60,000、スキャン範囲 350 ～ 1600 m/z の MS1 検出器として使用されました。正規化された AGC ターゲットと最大注入時間は、MS1 では 100% /20 ミリ秒、MS2 では 200% /30 ミリ秒に設定されました。オービトラップ質量分析装置は、分解能 17,500 の MS2 検出器として使用されました。 MS2 では +2 ～ +5 の電荷を持つ前駆体イオンが分離され、動的排除時間は 50 秒に設定されました。 MS2 分離ウィンドウは 1.6 Da で、前駆体の断片化には正規化された HCD (高エネルギー衝突誘起解離) 衝突エネルギー 30% が使用されました。

データベースの検索とフィルター条件は、前述のように実行されました8。詳細には、生データは UniProt 大腸菌 K12 タンパク質データベース (Proteome ID: UP000474145) を使用して MaxQuant (v.1.5.5.1) によって検索され、ペプチドの全体的な誤検出率は 1% 未満でした。ペプチド配列の検索はトリプシン特異性として設定され、最大ペプチド長の場合は 2 回の欠落切断、最小ペプチド長の場合は 7 回の切断が失敗しました。 Cys 上のカルバミドメチル化は固定修飾として指定されました。リジンのラクチル化、メチオニンの酸化、ペプチド N 末端のアセチル化は可変修飾として固定されました。質量許容差は、前駆体イオンの場合は ±10 ppm、MS/MS の場合は ±0.02 Da に設定されました。スコア < 40 および局在確率 < 0.75 の乳チル化ペプチドはさらに除外されました。すべての Kla ペプチド比を、対応するタンパク質レベルの比によって正規化しました。

R/Bioconductor パッケージ「clusterProfiler」(バージョン:4.0) を通じて分析された 3 つのカテゴリー BP (生物学的プロセス)、CC (細胞コンポーネント)、および MF (分子機能) 経路濃縮における GO (遺伝子オントロジー) 機能。 p 値カットオフ = 0.05 および q 値カットオフ = 0.2 がカットオフ基準として選択されました。統計的有意性は、両側不対フィッシャーの直接確率検定を使用して計算されました。 Benjamini および Hochberg 補正を使用して P 値を調整しました。

精製した組換え YiaC (15 μM) および候補基質タンパク質 (GltA、PncB、20 μM) を YiaC 反応バッファー中 25 °C で 10 時間インキュベートしました。精製した組換え CobB (15 μM) および候補基質 (GpmA、Mdh、PykF、20 μM) を CobB 反応バッファー中で 25 °C で 10 時間インキュベートしました。反応生成物は、抗ラクチル化を用いたウエスタンブロッティングによって分析されました。

精製された PncB、PncBK381Q、および PncBK381R の活性を記載どおりに測定しました 68。詳細には、精製タンパク質を反応緩衝液[50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、2.5 mM ジチオスレイトール、1 mM ATP、25 gのウシ血清アルブミン、1 mM ニコチン酸および1 mM 5-ホスホリボシル-1]に添加した。 -ピロリン酸 (pH 7.5)] 37 °C で 2 時間。反応をHPLC-MS/MSで測定し、ニコチン酸の生成を検出した。分離は、ACQUITY UPLC BEH C18 カラム (100 × 2.1 mm、1.7 μm) を備えた Vanquish UHPLC システム (Thermo Fisher Scientific) で実行されました。移動相 A は 0.1% ギ酸水溶液でした。移動相 B はメタノール中の 0.1% ギ酸でした。勾配溶出 (0.0 分、0% B; 2 分、15% B; 4 分、100% B; 5 分、0% B) を流速 0.2 ml/分および一定のカラム温度 20℃で実行しました。 ℃。注入量は2μlであった。ニコチン酸の検出は、ESI プローブで操作される Orbitrap Exploris 480 分光計 (Thermo Fisher Scientific、ブレーメン、ドイツ) で実行されました。データは次のパラメータの下で取得されました: シースガス ((N2)、35 Arb; 補助ガス (N2)、10 Arb; スプレー電圧、3500 V (ポジティブモード); およびトランスファーチューブ温度、320 °C。SIM はデータ取得のために申請しました。

精製された GpmA、GpmAK106Q および GpmAK106R の活性を記載どおりに測定しました 69。詳細には、精製した組換え GpmA、GpmAK106Q、または GpmAK106R を反応バッファー [100 mM Tris-HCl、100 mM KCl、5 mM MgCl2、1 mM ADP、および 0.2 mM NADH (PH 7.0)] 中で 0.5 U エノラーゼ、0.5 U ピルビン酸キナーゼ、0.1 U Ldh、および 2 mM 3-ホスホグリセリン酸を 30 °C で 1 時間処理し、GpmA を含まないサンプルをブランクとして使用しました。 NADHの酸化は、340 nmの自己蛍光によりGpmA活性として測定されました。

精製された PykF、PykFK382Q および PykFK382R の活性を記載どおりに測定しました 70。詳細には、精製した組換え PykF、PykFK382Q、および PykFK382R を反応バッファー [50 mM Tris-HCl、200 mM KCl、15 mM MgCl2、25% グリセロール、175 μM NADH、5 mM ホスホエノールピルビン酸、5 mM ADP、および 5 mM フルクトース 1,6-二リン酸 (PH 8.0)] を 1 U 乳酸デヒドロゲナーゼとともに 32 °C で 10 分間処理し、PykF を含まないサンプルをブランクとして使用しました。 NADH の酸化は、340 nm の自己蛍光により PykF 活性として測定されました。

５ｍｌの培地中の大腸菌を回収した。アッセイは、ピルビン酸キナーゼ活性アッセイキット (Sigma-Aldrich、MAK072) を使用して、製造元のプロトコールに従って実施されました。

前述のように8、菌株をLB培地で一晩培養し、その後LBまたはM9培地（1%グルコースまたは1%ピルビン酸を含む）で1:1000に希釈し、96ウェルプレートを用いて37℃でインキュベートし、各菌株を添加しました。 3つの井戸へ。開始時の600nmにおける吸光度をブランクとして設定し、分光光度計を使用して1時間ごとに測定した。すべての成長動的曲線は、Origin 8.0 を使用して描画されました。

2 つのシステム PykF/PykF K382la-FBP を使用して 100 ns の分子動力学 (MD) シミュレーションを 3 回実行しました。システムの初期座標は、PDB ID 1PKY の X 線結晶構造から取得されました。すべての MD シミュレーションは GROMACS 2019.6 を使用して実行されました (デフォルト値をパラメータとして設定)。 Gromos 54A7 力場を備えたソフトウェアパッケージは PykF を記述するために適用され、Gromos 54A8 力場は PykF K382la に使用されました。 Gromos 54A7 および Gromos 54A8 は Vienna-PTM からダウンロードされました。リガンド FBP 力場は、Automated Topology Builder (ATB) (バージョン 3.0) データベース (https://atb.uq.edu.au/molecule.py?molid=1134439#panel-md) から取得しました。複雑なシステムは、SPC 水モデルを備えた立方体ボックス内の MD シミュレーションによって解析されました。システムを中和するために、塩化物イオンとナトリウムイオンがシミュレーションボックスにランダムに追加されました。 MD シミュレーション中、長距離クーロン相互作用は粒子メッシュ Ewald (PME) 法を使用して処理されました。システム全体のエネルギー最小化は、最急降下法により 50,000 歩実行されました。続いて、システムの安定性を維持するために、500 ps の NVT (一定の粒子数、体積、および温度と結合したベレンセン温度) および 500 ps の NPT (一定の粒子数、圧力、および温度と結合したパリネロ – ラーマン圧力) が実行されました。 (300K、1バール)。すべての熱力学特性を安定させた後、分子システムは 2 fs の時間間隔で 100 ns にわたってシミュレートされ、すべてのモデルの座標は 2 ps ごとに保存されました。二乗平均平方根偏差 (RMSD) と、K382 側鎖の窒素原子と FBP の中心炭素原子の間の距離は、GROMACS 2019.6 内の分析ツールを使用して評価されました。すべての視覚化は、PyMOL および Xmgrace 2.3.7 ソフトウェアを通じて行われます。 2 つの MD シミュレーションシステム (PykF-FBP および PykF K382la-FBP) に関連するコードファイル、入力パラメータファイル、初期および最終構成ファイルは、MD シミュレーションソースデータとして提供されます。

論文の結論を評価するために必要なすべてのデータは、論文および/または補足資料に記載されています。この論文に関連する追加データは著者に要求される場合があります。 MS プロテオミクスデータは、データセット識別子 PXD030345 および PXD030346 で、iProX パートナーリポジトリを介して ProteomeXchange コンソーシアム (http://proteomecentral.proteomexchange.org) に寄託されています。リガンド FBP 力場は、Automated Topology Builder (ATB) (バージョン 3.0) データベース (https://atb.uq.edu.au/molecule.py?molid=1134439#panel-md) から取得しました。以下の結晶構造を PDB ID 1PKY の解析に使用しました。 2 つの MD シミュレーションシステム (PykF-FBP および PykF K382la-FBP) に関連するコードファイル、入力パラメータファイル、初期および最終構成ファイルは、MD シミュレーションソースデータとして提供されます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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この研究は、中国国家自然科学財団 (KZ への番号 22074103、KZ への 21874100、KZ への 22274114、HD への 32101023、GZ への 21904097、および XB への 22004091)、広東省自然科学財団 (No. HD への 2022A1515011810）、中国ポスドク科学財団（HD への番号 2021M702067）、天津市科学技術委員会（KZ への番号 19JCZDJC35000 および ST への 19JCQNJC08900）、広東省教育省の革新的チーム補助金（番号 2021KCXTD） 005からエル）。

Hanyang Dong、Jianji Zhang の著者も同様に貢献しました。

省と省が共催医療エピジェネティクス連携イノベーションセンター、免疫微小環境および疾患重点研究室（教育省）、天津医科大学基礎医科学部生化学・分子生物学科、天津医療エピジェネティクス重点研究室、300070、天津、中国

Hanyang Dong、Jianji Zhang、Hui Zhang、Yue Han、Chen Chen、Xiaoxia Tan、Siyu Wang、Xue Bai、Guijin Zhai、Shanshan Tian、Tao Zhang & Kai Zhang

広東省感染症および分子免疫病理学重点研究所、汕頭大学医科大学腫瘍病理学研究所、515041、汕頭、広東省、中国

Hanyang Dong、Enmin Li、Liyan Xu

南開大学生命科学部、300071、天津、中国

コンコン・ルー

Jingjie PTM Biolab (Hangzhou) Co. Ltd、杭州、310018、浙江省、中国

チェン・ジョンイー

高癌発生率に対する分子生物学の主要研究室潮山沿岸地域、汕頭大学医科大学生化学および分子生物学部、515041、汕頭、広東省、中国

李恩民

天津網膜機能および疾患の主要研究室、眼科研究所および検眼学部、天津医科大学眼科病院、天津医科大学、300070、天津、中国

カイ・チャン

天津主要消化器病研究所、消化器科および肝臓科、医科大学総合病院、天津医科大学、300070、天津、中国

カイ・チャン

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KZ と LX が実験を監督しました。 HD と KZ は実験を計画し、データを分析し、原稿を書きました。 HDとJZは細胞培養、酵素アッセイ、メタボロミクス調査、分子生物学的解析を実施した。 HD、JZ、CL、HZ、および XB は、プロテオーム調査と質量分析分析を実行しました。 GZ と CC はタンパク質の機能を調査するための試薬を準備しました。 HD、JZ、YH、XT、SW、ST、ZC、TZ、EL、LX、KZ がデータ収集、分析、解釈を実行しました。著者全員が結果について議論し、原稿についてコメントしました。

Liyan Xu または Kai Zhang との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Dong, H.、Zhang, J.、Zhang, H. 他。 YiaC と CobB は大腸菌におけるリジンのラクチル化を制御します。 Nat Commun 13、6628 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-34399-y

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受信日: 2022 年 1 月 13 日

受理日: 2022 年 10 月 20 日

公開日: 2022 年 11 月 4 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34399-y

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