フラビン

Jun 13, 2023

Nature Communications volume 13、記事番号: 4896 (2022) この記事を引用

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エポキシドの開環反応は、生物学的プロセスと合成用途の両方において一般的かつ重要であり、エポキシド加水分解酵素による非酸化還元的方法で、または酸化還元酵素による還元的に触媒されます。今回我々は、ベンゾフルオレンコアを持つ非定型アングサイクリンのファミリーであるフルオスタチン（FST）が、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NADH）の存在下で非酵素触媒のエポキシド開環反応を起こすことができることを報告する。 FST C の 2,3-エポキシド環は、推定上のエノール中間体を介して還元的に開くか、分子酸素を酸化剤として使用する過酸化中間体を介して酸化的に開くことが示されています。これらの反応により、C-2 に単一のヒドロキシル基、2,3-ビシナルジオール、収縮した 5 員環 A 環、または拡張した 7 員環 A 環を有する、異なる酸化還元状態を持つ複数の生成物が生成されます。同様の反応は、天然物と、芳香族部分に結合したカルボニル基に隣接するエポキシドを有する他の有機化合物の両方でも起こります。私たちの発見は、既知のフラビン化学のレパートリーを拡張し、有機合成に新しくて有用なツールを提供する可能性があります。

エポキシドは、有機合成および生合成における重要な構成要素です1,2。オキシラン 3 員環と分極した酸素-炭素結合の大きな歪みにより、エポキシドは適切な触媒の制御下で容易に位置選択的および立体選択的開環を受けることができます 3,4。エポキシドの開環は一般に、立体化学の反転を伴う求核付加によって進行します。ただし、図1a5に示すように、位置選択性は、反応が酸性条件下で行われるかアルカリ性条件下で行われるかに影響されます。したがって、トランス立体化学を有する 1,2-二官能化系を生成するために、エポキシドと反応する多くの求核試薬が開発されてきました6。エポキシドの開環は、エポキシド加水分解酵素 (EH) や酸化還元酵素 (OR) などの酵素によっても触媒されます (図 1b)7。 EH はエポキシドのトランスビシナルジオールへの加水分解を触媒します 8,9。 OR は、エポキシドのアルコールへの立体選択的還元を触媒します (図 1b)10,11。

a 塩基性または酸性条件下での求核剤 (Nuc) の付加を伴う非酵素的エポキシド開環反応。 b エポキシド加水分解酵素 (EH) および酸化還元酵素 (OR) による酵素的エポキシド開環反応。 c この研究で報告されているように、加水分解酵素Alp1Uによって酵素的に触媒されるか、またはFADおよびNADHによって非酵素的に媒介される、フルオスタチンCのエポキシド開環反応（1）。

エポキシドは、生合成経路のさまざまな天然物や反応中間体に見られる重要な構造要素でもあります1。特に、フルオスタチン（FST、例えば 1）12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、キナマイシン 23、ロマイビチシン 24、25、およびネネスタチン 26、27、28 は、非定型のファミリーを構成します。ベンゾフルオレンコアを持つアングサイクリン（補足図1）。キナマイシンとロマイビティシンのベンゾフルオレンコアはさらにジアゾ基で修飾されており、これらの化合物に強力な抗腫瘍活性を与え、かなりの注目を集めています 29,30。非定型アングサイクリンは、多くの場合、アシル化、エポキシ化、グリコシル化、二量体化などのさらなる修飾を受ける可能性のある高度に酸素化された A 環を特徴とし、顕著な構造多様性をもたらします 18、21、27、31、32。 α/β ヒドロキシラーゼ Alp1U および Lom6 は、キナマイシンおよびロマイビチシンの生合成中に立体選択的エポキシド加水分解反応を触媒することが最近報告されました 23。 Alp1U は、FST C (1) のエポキシドを加水分解して、2 つの立体異性 FST C1 (2) および C2 (3) を生成することも示されています (図 1c)18,33。

南シナ海由来の Micromonospora rosaria SCSIO N160 の FST 経路に由来する α/β-ヒドロラーゼ FlsH は、アシル FST の脱アシル化を触媒することが示されています 18。ただし、FST との相同性にもかかわらず、FST のエポキシドの加水分解を触媒することはできません。アルプ1U18。 FST B12、ピラゾロフルオスタチン A-C16、FST R17 などの天然に単離された FST (補足図 1) は、対応するエポキシド前駆体に由来すると提案されています。しかし、FlsH の活性を考慮すると、エポキシドがどのように切断されるのか、また、存在する場合どの酵素が関与するのかは完全には明らかではありません。

この研究では、FST C (1) の 2,3-エポキシド環が、フラビンアデニンジヌクレオチド (FAD、4) および FADH2 (5) または C4a-反応性フラビン種として機能するヒドロペルオキシフラビン (FADOOH、6) (図 1c)。したがって、エポキシドの開環反応は還元的に進行し、C-2 (7 および 8) に単一のヒドロキシル基を有する生成物に互変異性化されるか、またはさらに 6 によって修飾されて、 C-2 および C-3 (3 および 9) にビシナルジオール。分子状酸素の存在下では、エポキシドの開環反応は酸化的に進行し、過酸化中間体が生成します。この中間体は、NADH によってさらに 3 と 9 に還元されたり、環の再配置を経て、縮合した 5-員員 A 環 (10) または架橋拡張された 7 員員 A 環 (11)。結果として、この非酵素的エポキシド切断反応は、自然界で観察されるいくつかの異なる FST 誘導体の形成の原因となる可能性があります。追加の実験では、芳香族部分に結合したカルボニル基に隣接するエポキシドを有する天然物と他の有機化合物の両方でも同様の反応が起こることが示されている。したがって、この非酵素触媒による開環反応は、有機合成における有用なツールとして期待されています。

α/β ヒドロキシラーゼ Alp1U は、FST C (1) のエポキシドを加水分解して FST C1 (2) および FST C2 (3) を生成することが以前に示されました (図 2a、トレース i-ii)18,33。対照的に、Alp1U ホモログ FlsH は 1 のエポキシド環の加水分解を触媒できません (図 2a、トレース iii)18。考えられる説明は、FlsH がエポキシドの加水分解を触媒するためにタンパク質パートナーまたは外因性補因子を必要とする可能性があるということです。これらの仮説を検証するために、大腸菌由来の Fre を含むいくつかのフラビン還元酵素 34 を選択し、FlsH の推定上のタンパク質パートナーとしての能力を調べました。 NADHの存在下でFST C(1)をFlsHおよびFreとインキュベートすると、複数の生成物が得られることが判明した(図2a、トレースvi)。しかし、さらなる実験では、FlsHの非存在下でも同じ一連の生成物の形成が観察されることが示され（図2a、トレースvii）、Fre単独でもFST Cの同じ分解を媒介できることが示唆されました（1）。さらに、FlsO2（プレジャドマイシンオキシダーゼ）35、TiaM（チアクミシンハロゲナーゼ）36、37、およびXiaK（シアマイシンN-ヒドロキシラーゼ）38を含む他のいくつかのフラボ酵素と1をインキュベートしても、同じ結果が得られました（補足図2）。これらのフラボ酵素の活性がすべて NADH による FAD の還元に依存していることを考えると、還元されたフラビンのみが FST C (1) 消費の実際の触媒として機能することが提案されました。実際、酵素の非存在下で FST C (1) を FAD および NADH とインキュベートすると、同様の生成物が観察されました。そのため、FAD と NADH は両方とも十分であり (図 2a、トレース viii および xii)、必要です (図 2a、トレース viii および xii)。トレース ix-xi) は、FST C の非酵素的分解を促進します (1)。

FST C が関与する反応の HPLC 分析 (1)。 (i) 1標準; (ii) 1 + Alp1U; (iii) 1 + FlsH; (iv) 1 + FlsH + Fre; (v) 1 + FlsH + NADH; (vi) 1 + FlsH + Fre + NADH; (vii) 1 + Fre + NADH; (viii) 1 + FAD + NADH; (ix) 1 + 周波数。 (x) 1 + NADH; (xi) 1 + FAD; (xii) 1 + FAD + NADH。 HPLC は、逆相 C18 カラム (i ～ xi) または極性カラム (xii) を使用して実行されました。反応は、5μM酵素(Alp1U、FlsHまたはFre)、100μM FADおよび10mM NADHを含む50mM PBS緩衝液(pH7.0)中で30℃で30分間実行した。 b 7 および 10 の X 線結晶構造。 c (1R,2S,3R)-9 の B3LYP/TZVP PCM/MeCN // ωB97X/TZVP PCM/MeCN スペクトルと比較した 9 の実験 ECD スペクトル (黒線) （レッドライン）。バーは、最もエネルギーの低い溶液配座異性体の回転強度の値を表します。

反応生成物（3および7〜11）は、FST C（1）とFADおよびNADHとのスケールアップ反応から単離され、図1cに示すように構造的に特徴付けられました。最初の生成物は FST C2 (3) (補足図 3 および表 1) であることが確認されました。これも Alp1U 触媒による加水分解反応の生成物です 33。 2番目の反応生成物7（補足図4および表2）は、Streptomyces sp.から天然に単離されたFSTであるFST Bと同じ平面構造を有することが確立されました。 TA-339112 および Streptomyces Acta 1383 株では 13、ただし、FST B の絶対配置は決定されていません 12。 7 の（1R、2R、3S）絶対配置は、溶液TDDFT-ECD方法論（補足図5）によって確立され、単結晶X線分析によって確認されました（図2b、CCDC 2036399;補足表3）。 3番目の製品8（補足図6および表2）は、7と同じ平面構造を有すると判断され、8の（1R、2R、3R）絶対配置は、実験と計算によるECDスペクトルの比較によって割り当てられました。 (1R,2R,3R) 立体異性体 (補足図 7)39。 FST B の 2 つの立体異性体を区別するために、7 と 8 をそれぞれ FST B1 と FST B2 と名付けました (図 1)。生成物９（ＦＳＴＣ３と称される、図１）は、逆相Ｃ１８カラムを用いたＨＰＬＣ分析において３と同じ保持時間で単離された。極性 HPLC カラムを使用したアッセイの分析により、これら 2 つの種の分離が可能になりました (図 2a、トレース xii)。最後に、9はHRESIMSおよびNMRデータによって3の立体異性体であることが確認され（補足図8および表4）、9の（1R、2S、3S）絶対配置はTDDFT-ECD方法論によって確立されました（図2c）、補足図9）。

2 つの追加の生成物 10 および 11 も同定され、構造的に特徴付けられました (図 1c、図 2a、トレース vi ～ viii および xii)。 FST C4（図1）と呼ばれる生成物10は、NMR分光分析により収縮した5員A環を有することが判明し（補足図10および表5）、(1R,2R)絶対配列を有することが決定された。単結晶 X 線分析による構成 (図 2b; 補足表 6; CCDC 2129081)。 FST C5（図1）と呼ばれる生成物11は、架橋され拡張した7員環A環を有することが構造的に解明された（補足図11および表5）。 (1R,2R,3R) 絶対配置の 11 への割り当ては 1 からの起源に基づいていますが、それ以外は暫定的なままです。これは、その不安定性のために決定的な実験的特徴付けが不可能であったためです。現在、9-11 が自然発生源から分離されたという報告はありません。

非酵素的エポキシド開環反応の機構を調べるために、FST C (1)、FAD、および NADH を、酸化重水素 (2H2O) で調製した PBS 緩衝液 (pH 7.0) 中で共インキュベートしました。 7 と 8 の両方への単一の重陽子の組み込みは、両方の還元生成物の m/z 326.7 ([M ‒ H]‒) で + 1 Da シフトした分子イオンピークの存在によって示されました (補足図 12)。対照的に、3、9、10、または 11 の分子量の変化は観察されませんでした (補足図 12)。続いて、７−２Ｈおよび８−２Ｈをスケールアップした反応から単離し、１Ｈおよび１３ＣＮＭＲによって分析した（補足図１３、１４および表２）。 7-2Hと7の1H NMRスペクトルを比較すると、7の3-Hプロトンシグナルが7-2Hでは消失し、一方で7の3-Meダブレットが7-2Hでは一重項に崩壊していることが明らかになりました（図3a） )、7-2H の C-3 に 2H が位置します。この帰属を裏付けるように、7で観察されたH-2プロトンとH-3プロトンの間のCOSY相関は7-2Hには存在しませんでした（補足図4、13）。同様に、8-2HのH-2とH-3の間にCOSY相関が存在しないとともに、3-Meについてもシングレットが観察されました（図3a、補足図13、14）。さらに、7-2H および 8-2H の 13C NMR スペクトルは両方とも、C-3 からのシグナルの広がりと強度の減少を示し、C-3 での 2H-13C カップリングも観察されました (補足図 13、14)40。これらの観察は、1 から 7 と 8 の両方への還元中に、単一の溶媒ヒドロンが C-3 に組み込まれることを示しています。

生成物および中間体への 2H または 18O の取り込み、および潜在的な相互変換の NMR 分析。７および８のＣ−３における２Ｈ２Ｏからの重水素の取り込みは、１ＨＮＭＲ分光分析から推測された。 3-18O および 9-18O の O18 標識は、HRMS 分析によって裏付けられました。割り当てられた 12 と 14 の構造が示されていますが、提案されている 13 の構造は、安定性が低いため推測の域を出ません。 b さまざまな条件下での反応の HPLC 分析。 (i) 1標準; (ii) 1 + FAD + NADH (空気中); (iii) 1 + FAD + NADH (18O2 未満); (iv) 1 + FAD + NADH (N2 下); (v) 7 を 50 mM ホウ砂/NaOH 緩衝液 (pH 10) 中で 30 °C で 12 時間洗浄します。 (vi) 100 μM 1 + 10 μM FAD + 2 mM NADH (30 °C で 30 分間); (vii-ix) (vi) から収集した 13 を (vii) H2O とインキュベートする。 (viii) FAD; (ix) FAD + NADH; (viii) および (ix) の反応は、50 mM PBS 緩衝液 (pH 7.0) 中で 30 ℃、30 分間 O2 中で実行されました。 (x) H2O 中に 14。 (xi) 14 + FAD; (xii) 14 + NADH; (xiii) 14 + FAD + NADH。 (x-xiii) の反応は 30 °C で 30 分間実行されました。 (xiv-xvii) の反応には、1 および NADH とさまざまなフラビン補因子とのインキュベーションが含まれます。(xiv) FAD。 (xv) FMN; (xvi) リボフラビン； (xvii) イソアロキサジン、30 °C、30 分間。 (xviii) 1, F420、グルコース 6-リン酸および FGD を含む反応液を 30 °C で 10 時間インキュベートしました。 HPLC分析は、極性カラム(トレースivおよびx～xviii)または逆相C18カラム(トレースvi～ix)を使用し、304nmでのUV検出により実行した。

FST C（1）を18O2下でNADHおよびFADとインキュベートした場合（図3b、トレースi〜iii）、反応生成物のLC-MS分析により、酸化生成物の分子量が+2 Da増加し、3が得られたことが明らかになりました。 -18O、9-18O、10-18O、および11-18O（図3a;補足図15）。これらのデータは、1 から 3、9、10、および 11 への変換には、O2 から 1 つの酸素原子の取り込みが含まれることを示しています。さらに、反応バッファーを O2 で飽和させた後、FST C (1) を FAD および NADH とインキュベートすると、3/9 および 10/11 対 7/8 の相対生産量は O2 依存性でした。前者（3、9〜11）と後者（7、8）。対照的に、反応バッファーを N2 で飽和させると、主要な生成物として 7 および 8 が得られました (図 3b、トレース iii および iv)。反応（1→3/9）中の 18O 取り込みの正確な位置を特定するために、1、FAD、および NADH を 18O2 飽和 PBS 緩衝液（pH 7.0）中でインキュベートすることによりスケールアップ反応を実行しました。 2 つの生成物 3-18O ([M ‒ H]‒ m/z 343.0718) および 9-18O ([M ‒ H]‒ m/z 343.0722) (図 3a;補足図 16) が分離されました。 NMR分析により、18O標識が9-18OのC-3に組み込まれていることが示されました（補足図17）。具体的には、9 とその 18O 同位体ログ 9-18O の 13C NMR データの比較により、9 のそれと比較して後者のδC-3 の 3.8 Hz の高磁場シフトが実証され (補足図 18 および表 4)、18O 標識が裏付けられます。 C-3 (すなわち、9-18O)41,42。

次に、pH 範囲 3 ～ 10 の緩衝液中で反応を実行することにより、1 の FAD/NADH 依存性分解の pH 依存性を調査しました。 100 μM 1 を 100 μM FAD および 10 mM NADH と 30 °C で 2 時間インキュベートした後、pH 範囲 5 ～ 7 の緩衝液を使用すると、1 はより効率的にエポキシド開環生成物に変換されました。ただし、pH 9〜10のよりアルカリ性の条件下では反応の効率が低下しました（補足図19）。 FST B1 (7) は pH 3 ～ 7 でかなり安定でした。ただし、より高いpHではすぐに8に変換され（補足図20）、そこで酸化も受けて、以前に報告された天然産物FST A（12）が得られました（図3b、トレースv;補足図20および表1）。 12. FST B2 (8) も pH 3 ～ 6 で安定であり、よりアルカリ性の緩衝液では容易に 7 および 12 に変換されました (補足図 20)。対照的に、FST C (1) は、FAD または NADH が単独で存在する場合でも、pH 3〜10 で非常に安定でした (補足図 21)。これは、1 のエポキシドの分解には FAD と NADH の両方の存在が必要であることを再度示しています。

100μM 1と100μM FADおよび10mM NADHの時間経過分析により、より長いインキュベーション後に消失する中間種13の一時的な形成が実証されました（補足図22）。固定初期濃度 1 (100 μM) も、さまざまな濃度の FAD (1、10、および 100 μM) および NADH (2、5、および 10 mM) とともに 30 °C で 30 分間インキュベートしました (補足図 22)。）。一過性中間体の寿命は、FADのレベルが低下すると大幅に延長されました（図3b、トレースvi）。これにより、中間体１３の収集が可能となり、その後直ちにＨＰＬＣに再注入することにより、７および１２への変換が実証された（図３ｂ、トレースｖｉｉ）。単離された中間体 13 を O2 下で FAD と直ちにインキュベートすると、7 および 12 の生成が再び観察されました (図 3b、トレース viii)。しかし、NADH もインキュベーションに含まれる場合、代わりに 3 が主要な生成物として、12 が副次的な生成物として観察され、7 は観察されなくなりました (図 3b、トレース ix)。中間体 13 の UV 吸光度スペクトルは 1、3、7 の UV 吸光度スペクトルと非常に類似しており、中間体の LC-MS 分析では [M – H] – イオンの m/z 325.7 が示されました（補足図 23）。。これらの測定に基づいて、中間体はエノール 13 (図 3b) であると暫定的に提案されています。これは本質的に 7 と 8 の互変異性体であり、したがってこれら 2 つの生成物と同じ酸化状態を持ちます。

中間体の構造が 13 であることを確認するために中間体を単離する試みが何度か行われましたが、主生成物として 7 だけが得られ、別の副次化合物 14 も得られました。これは、中間体の安定性が低く、7 への変換が容易であることと一致しています。（図3b、トレースvii、補足図24）。それにもかかわらず、14は特徴づけることができ、したがってヒドロペルオキシフルオスタチンと呼ばれるC-3過酸化物として同定された（図3a、補足図25および表5）。しかし、14 の回収率が低いため、C-3 の絶対配置を完全に特徴付けるのに十分なスペクトルの収集が妨げられました。ヒドロペルオキシフルオスタチン (14) は、FAD の存在下でも水中で安定でした (図 3b、トレース x および xi)。 14 と NADH 単独の同時インキュベーションにより複数の生成物 3、9、10、および 11 が得られましたが、NADH に FAD を含めても生成物プロファイルは変化しませんでした (図 3b、トレース xii および xiii; 補足図 26)。 14 から 3 と 9 の両方への変換が観察されたことを考慮すると、化合物 14 は (1S,2S,3R) と (1S,2S,3S) 立体異性体の混合物である可能性があります。 13 を単離すると少量の 14 が得られたという事実は、14 が 13 から得られるものではなく、13 と共溶出する別の中間体であることを示唆しています。さらに、3/9 は 13 と 14 の両方から生成される可能性がありますが、7/8 は 13 から生成されるだけです。 10/11 は 13 から生成されましたが、10/11 はもっぱら 14 から生成されました (図 3a)。

他のフラビン関連補因子を考慮した場合、FADの代わりにFMNおよびリボフラビンも、NADHの存在下で1の分解を効率的に媒介することが判明した（図3b、トレースxiv-xvi）。イソアロキサジンと NADH も、効率はかなり低いものの、1 から 3 の形成を促進することができました (図 3b、トレース xvii)。グルコース 6-リン酸および F420 依存性グルコース 6-リン酸デヒドロゲナーゼ (FGD) から構築された還元系の存在下で補因子 F420 を使用すると、生成物 3、9 ～ 11 のみが観察されました 43、44、45 が、特に生成は観察されませんでした。還元種 7 および 8 の反応が観察されました (図 3b、トレース xviii)。還元型 5-デアザフラビンは一般に分子状酸素と非常にゆっくり反応すると報告されているため、F420 および NADH の存在下での酸素取り込みの観察は予想外でした 46,47。それにもかかわらず、図3bに示すフラビン補因子適合性の結果（トレースxiv〜xviii）は再現性があることが判明しました（補足図27）。 NADPH も NADH と同様の効果的な補因子であることが判明し、エポキシド開環反応をサポートします (補足図 19)。

この反応の一般性を調査するために、一連の FST 誘導体 15 ～ 21 (図 4) がオキシラン反応物質として考えられるものとしてテストされました。 FST F (15) は Alp1U18,33 に対して不活性ですが、FAD および NADH の存在下では効率的に 1-O-メチル-FST C2 (22)、1-O-メチル-FST B1 (23)、 1-O-メチル-FST C3（24）および1-O-メチル-FST B2（25）（図4および補足図28）。これらは、NMRおよびECD分光分析によって構造的に特徴付けられました（補足表7、図８および図２９〜３２）、ならびに単結晶Ｘ線回折分析（例えば、２３、ＣＣＤＣＣ２０３６４００、補足表３）。

FST 誘導体 15 ～ 20 は、FAD/NADH で処理するとエポキシド開環反応を起こし、3、7、8、および 9 に関連する複数の生成物を生成する可能性があります。FST Q (21) は FAD/NADH と反応しませんでした。エポキシド 28 ～ 35 は、FAD/NADH に対して活性を示さなかった。オーキアスロール H (36) またはメナジオン 2,3-エポキシド (37) を FAD/NADH で処理すると、複数の生成物が得られました。エポキシド 42 ～ 46 は FAD/NADH と反応しないことが判明しました。オキシドレダクターゼ Rs105 は、リシリリド生合成中に 43 の還元的エポキシド開環反応を触媒して 44 を生成し、カルコン α,β-エポキシド (46) が RlsO5 の基質となって単一の生成物 47 を生成することが判明しました。

同様に、7-O-メチル-FST C (16)、6-O-メチル-FST C (17)、FST D (18)、FST S (19)、およびジフルオスタチン H (DiFST H、20) も影響を受ける可能性があります。 FAD / NADHで処理するとエポキシド開環反応が起こり、3、7、8、および9に関連する複数の生成物のセットが生成されます（図4、補足図33〜37）。 16 および 17 の主要生成物は、1D および 2D NMR および ECD 分光分析によって、それぞれ FST M (26)17 および 6-O-メチル-FST B1 (27) として構造的に特徴付けられました (図 4、補足表)。図９および図３８、３９）。 18-20 との反応による他の生成物の構造は、LC-MS 分析に基づいて推定されました。特に、C-4カルボニルではなくC-4ヒドロキシルという点で16とは異なるFST Q（21）は、FAD / NADHと反応しませんでした（補足図40）。これは、C-4カルボニルの重要な役割を強調しています。この化学では。

エポキシド 28 ～ 37 (図 4) も、推定上のオキシラン基質としてテストされました。 28 ～ 35 では活性は観察されませんでした (補足図 41 ～ 46)16,40。対照的に、オーキアスロール H (36)48 を FAD / NADH で処理すると、複数の生成物が得られ (補足図 47)、そのうちの 1 つはオーキアスロール F の構造類似体である 38 であることが判明しました (図 5; 補足図 47)。 .48および表10）49、36および38の実験および計算されたECDスペクトルと比較して（補足図49）。メナジオン 2,3-エポキシド (37) との反応により、3-ヒドロキシ-3-メチル-2,3-ジヒドロナフタレン-1,4-ジオン (39)、2 を含む 3 つの生成物 (補足表 11 および図 50 ～ 53) が得られました。 -ヒドロキシ-3-メチル-1,4-ナフトキノン（40、フチオコール、X線回折により特性評価、CCDC 2036401;補足表12）、および3-メチルナフタレン-1,4-ジオン（41）。

反応は還元経路と酸化経路を介して進行し、NADH と O2 の存在に応じて、異なる酸化還元状態の複数の生成物が生成されます。還元反応における主要な変換 (黄色の背景) には、フラビン N5-C4' 付加物 (49) が関与してエノール中間体 13 が生成され、これは互変異性化を受けて 7 (メジャー) または 8 (マイナー) を生成し、酸化が関与すると提案されています。 3 (メジャー) または 9 (マイナー) を生成します。 7 はさらに自動酸化されて 12 になる可能性があります。一方、酸化的開環にはフラビン C4a-O-O-C3' 付加物 (50) が関与し、過酸化中間体 14 (灰色の背景) が得られ、これは 3 と 9 に還元される可能性があります。 NADH によるものであり、さらに再配置されて 10 と 11 が生成されます。

FAD/NADH と反応してエポキシド開環反応を起こすことができるすべての化合物に共通する 2 つの構造的特徴には、(i) エポキシドに隣接するカルボニルの存在、および (ii) カルボニル/NADH に隣接する芳香族部分の存在が含まれます。エポキシドペア（図4）。 21 および 28 ～ 31 ではエポキシド環に隣接するカルボニル基が存在しないことが、観察された反応性の欠如の原因である可能性があります。 36 および 37 は FAD/NADH の存在下で開環反応を起こしましたが、32 ～ 35 については、これらの化合物にエポキシド/カルボニルペアが存在しているにもかかわらず、反応は観察されませんでした。これは、エポキシドの開環にはカルボニル/エポキシド対の芳香族系への共役も必要であることを意味します。

市販の化合物ビタミン K1 2,3-エポキシド (42) も、エポキシド/カルボニルのペアと隣接する芳香環の両方を特徴とする推定基質としてテストされました。ただし、42をFAD / NADHとインキュベートしても、そのTLC保持プロファイルまたは反応がないことを意味する分光学的特性のいずれにも変化は生じませんでした（補足図54）。最近の研究では、フラボ酵素 Rs105 がヒドリド媒介還元的エポキシド開環反応を触媒し、リシリリド生合成中に 43 を 44 に変換することが実証されました (図 4)。反応は、1 から 7 への変換と非常によく似た方法で進行しました。しかし、43 から 44 の生成は厳密に RslO5 依存性であることが確認され、43 は FMN および NADH11 の存在下では反応しませんでした。考えられる説明は、42と43の両方でエポキシドの隣に長い側鎖が存在するため、フラビンの接近と配向の両方が妨げられ、それによって開環に適した相互作用が妨げられる可能性があるということです（補足図55）。さらに 2 つの市販化合物であるトランス-1,3-ジフェニル-2,3-エポキシプロパン-1-オン (45) およびカルコン α,β-エポキシド (46) は、FAD/NADH と反応しないことが判明しました。ただし、46はRlsO5によって基質として受け入れられ、45は受け入れられず、単一の生成物47が得られました（補足表13および図56、57）。これは、Rs105が2つのエナンチオマーのうちの1つだけに特異的であることを示しています。 47への重水素の取り込みは、緩衝2H2O中でのRslO5反応からは観察されなかったが、Bacillus megaterium DSM 2894由来のグルコースデヒドロゲナーゼ(BmGDH)と組み合わせたアッセイでRslO5反応を実施して(S)-[4-を提供する]場合には実際に観察された。 2H]NADH50、またはサーモプラズマ・アシドフィラムATCC 25905（TaGDH）由来のグルコースデヒドロゲナーゼを使用して、それぞれ（R）-[4-2H]NADH51を提供し、重水素供与体としてd-[1-2H]グルコースを使用します（補足図58））52．以前の研究では、RslO5-H172N変異体はFMN結合に欠陥があり、天然基質4311に対して不活性であることが実証されており、RslO5触媒反応におけるFMNの重要な役割が示唆されている。総合すると、NADH に由来する FMNH2 の水素化物は、RslO5 触媒によるエポキシド開環反応に有効な求核試薬であると考えられます。対照的に、上記のように生成された（S）-[4-2H]NADHまたは（R）-[4-2H]NADHのいずれかと1およびFADの反応では、7への重水素の取り込みは観察されませんでした（補足図58、59））。したがって、FAD/NADHの存在下での1から7への非酵素的還元は、C-3水素の最終的な起源に関してRs105触媒作用とは異なります。

エポキシド開環反応は一般的であり、生物学的プロセスと合成用途の両方において重要です 1,2。非酵素的エポキシド開環反応は通常、求核付加を介してレドックス中性で進行し、エポキシドの性質と反応条件に応じて好ましい位置選択性と立体選択性が決まり、一般にトランスビシナルジオールを含む生成物が得られます3,4。同様の化学反応は、同様にトランスビシナルジオール生成物を生成するα/β-エポキシドヒドロラーゼ間でも見られます53。例えば、加水分解酵素 AlpU は、FST C (1) エポキシドのエポキシド加水分解を触媒して 2 および 3 を生成し、それぞれがトランスビシナルジオールを示します (図 1)33。対照的に、フラボ酵素 Rs105 はリシリリドの還元的エポキシド開環を触媒し、それによってモノヒドロキシル化生成物を生成することが最近報告されました 11。したがって、Rs105の化学は、以前に報告された加水分解反応の化学とは明らかに異なり、代わりに還元フラビンによるエポキシドの水素化を表し、これは同位体標識基質を使用した結果から明らかです（補足図58）。

この研究では、FAD/NADH が適切に活性化されたエポキシドの開環を誘導し、異なる酸化還元状態を持つさまざまな生成物を生成することが示されています。嫌気的条件下では、エポキシド開環は、FAD/NADHの存在下で、Rs105触媒の機構とは無関係である可能性のある機構を介して還元的に進行する。しかしながら、得られるモノヒドロキシル化種は、分子状酸素による酸化に非常に敏感であり、その結果キノン（例えば、12）および隣接アルコールが生成する反応は、FADの存在によっても促進される可能性がある。好気的条件下では、エポキシド環の開環は、NADH によって還元されて再びビシナルジオールを生成することができるα-ケトペルオキシ化種の形成を通じて進行すると考えられます。あるいは、ペルオキシ化中間体はさらなる転位を受けて、縮環酸化生成物（例えば、5員環種10）および環拡大酸化生成物（例えば、7員環種11）の両方をもたらす可能性がある。

蓄積された実験証拠に基づいて、FAD/NADH により可能となる非酵素的エポキシド開環反応の推定メカニズムが提案されています (図 5)。観察されたエポキシド開環反応にはFADと過剰のNADHの両方が必要であるため、NADHが還元剤として提案され、FADは酸化還元触媒として機能します。反応が好気的に行われる場合、O2 が酸化剤として作用すると考えられています。 NADH だけでは反応を開始できないことを考えると、還元型フラビンが 1 の還元に直接関与する種であると提案されています。 7 は、還元型フラビン種 (例: N5-H) からの水素化物転移を介して直接形成される可能性があります。 FADH2) を 1 の C3 に変換し、それによってエポキシド環が開きます。これは、RslO5 触媒によるエポキシド還元反応に似ています (図 4)。この場合、生成物 7 の H-3 が溶媒に由来するという観察は、還元フラビンの N5-H が溶媒と容易に交換されることによって説明できます。これは、観察された中間体 13 への互変異性化の前に、7 が直接の還元生成物であることを意味します。しかし、0.5 μM 1 と 10 μM FAD および 2 mM NADH を使用した経時的アッセイでは、13 が最初に蓄積し、続いて 7 および 8 に変換されることが示されました。対照的に、同様の条件下での 7 のインキュベーションでは、13 の有意な蓄積は観察されませんでした (補足図 60)。これらの結果は、7 や 8 ではなく 13 が最初の還元生成物であり、したがって FAD/NADH の存在下での 1 の非酵素的還元は、Rs105 触媒で提案されているように C-3 への直接の水素化物転移を介して進行しないことを意味します。

別のメカニズムには、芳香環に結合した隣接するカルボニルによるオキシランの活性化が含まれ、還元を受けて不安定な中間体が生成されます。以前に単離された FST Q (21)17 は反応に対して不活性であるため、この中間体は 7-デメチル-FST Q (48) (図 4) である可能性は低く、これは 1 の直接 C-4 カルボニル還元の生成物です。 FAD / NADH反応システム（補足図40）。代わりに、FST C の還元中の中間体 (1) は 13 などのエノール種であると仮説が立てられ、これは 13 が容易に互変異性化して 7 と 8 を生成するという観察と一致します。このメカニズムはまた、位置での重水素の取り込みとも一致します。反応が2H2O中で行われる場合、7および8のH-3。化合物 13 はまた、O2、FAD、および NADH の存在に敏感な方法で自動酸化を受けやすく、3 および 9 を生成すると予想されます。

13 の形成は、1 への還元型フラビンの求核性 N-5 の付加によって進行する可能性があります。このモデルは、求核性 N-5 を欠いているが、依然として水素化物供与体として機能することができる54。 FADH2 の 1 への求核付加は、C-3 または C-4 のいずれかで起こります。 1 の C-3 に立体的にかさ高い CH3 基が存在することを考えると、C-4 が求核攻撃の可能性が高い部位であると考えられます。これは、エポキシドに隣接するカルボニルの要件、したがって 16 の異なる反応性と一致します。 (C-4 カルボニル) 対 21 (C-4 ヒドロキシル)。 FADH2 の N-5 が非共有電子対を持ち、1 の C-4 が三方晶系カルボニル炭素であることを考慮すると、酸化還元反応は n→π* 相互作用を介して起こると考えられます。具体的には、求核性 N-5 は、非共有電子対 (n) 電子密度をブルギ-デュニッツ軌道に沿った三方晶系カルベン中心 (空の π* 軌道) に供与します 55。これらの軌道の混合は熱力学的に有利であり、共有結合付加体 49 (図 5)56 が生成されます。続く 49 のフラビン部分の N-1 脱プロトン化により、N5-C4' 結合が切断され、酸化されたフラビンが放出され、それによって 1 の Δ3,4 二重結合を持つエノール中間体 13 への還元が完了します (図 5)。）。

中間体 13 は非常に不安定であり、容易な互変異性化を受けて、sp2 平面構造の si 面 (主要なルート) または re 面 (マイナーなルート) のいずれかから、α 炭素 (C-3) に溶媒ヒドロンが組み込まれます。それぞれ7または8が得られます57。この機構は、緩衝化2H2Oからの7および8のC-3における重水素の部位特異的取り込みと一致している（図3a）。 8と比較して7の2,3-シス配置にもかかわらず、前者は約[7]eq / [8]eq = 5.4の平衡定数を有する熱力学的に有利な互変異性体であるようです（補足図61）。さらに、7、8および推定エノール中間体13も自動酸化を受けやすく、12が得られます（補足図62）。

推定上のエノール中間体 13 も分子状酸素に敏感であるようで、FAD および NADH の存在下で自動酸化を受ける可能性があります。還元フラビンは O2 と反応して共有結合 Fl4aOOH 付加物 (FAD → FADOOH) を形成することが知られており 58、場合によっては FADOOH から H2O2 が放出されて酸化剤として機能する可能性があります 37,59。ただし、1 も 13 も H2O2 と反応できません (補足図 24、63)。したがって、中間体13は、FADOOHの求電子性C(4a)-ヒドロペルオキシ基と反応して、C-3モノ酸素化生成物が得られると提案されています(補足図64を参照)。水酸化は、平面二重結合 (Δ3,4) の si 面 (主な経路) または再面 (副次的経路) のいずれかから起こり、それぞれ 3 または 9 を生成し、同時に酸化されたフラビンが放出されます (図 5)。。提案されたメカニズムは、(i) C-3 で 3 と 9 の両方に組み込まれる O は O2 に由来し、(ii) 13 から 3 および 9 への変換には FAD、NADH および O2 の存在が必要であるという観察によって裏付けられています。

中間体 14 の単離は、13 を使用しない別の方法でも 3 と 9 を生成できることを示しています。分子状酸素の存在下では、フラビン C(4a)-過酸化物 (FADOO‒) が位置選択的に攻撃する求核剤として機能する可能性があります。 si 面 (主要ルート) または re 面 (副ルート) のいずれかで 1 の C-3 がエポキシド環を開環し、推定上の付加体 50 が得られます (図 5)。電子吸引効果を持つ C-4 カルボニル酸素の存在は、C-360 の電子密度の変化を引き起こし、C-3 を 1 のエポキシドの C-2 よりも求核剤置換に適した部位にする可能性があります。 50 中のフラビン N-5 は C4a-O 共有結合を切断し、14 と FAD を放出します (図 5)。生成物14はC-3異性体の混合物であり、NADHによって容易に3と9に還元されます（図5、補足図65）。 14 と NADH の同時インキュベーションによっても 10 と 11 が生成され、これにはバイヤー・ビリガー反応に似た機構が関与していると考えられています。したがって、14 の C-3 ヒドロペルオキシドは C-4 カルボニルで分子内求核付加を実行して推定中間体 51 を形成し、これが分配して 10 と 11 を生成する可能性があります。前者の場合、中間体 51 はクリージー転位を受けて生成する可能性があります。 7 員ラクトン環 61,62 に続き、C-4 カルボニルに C-1 ヒドロキシが分子内で付加され、脱水後に 10 になります (図 5)63。あるいは、51 の 1,2-ジオキセタン単位はヘテロリティック開裂を受け、続いてグロブ様フラグメンテーションを受けてオキソヘプタン酸中間体 64,65 を生成し、連続的な分子内環化と脱水の後に最終的にヘミアセタール 11 を生成する可能性があります 66。

結論として、還元的エポキシド開環は、フラビン補因子の N-5 と基質 FST C の C-4 の間に形成される共有結合である N5-C4' との一過性付加物 (49) を介して機構的に進行すると示唆されています ( 1) (図5)。得られた生成物の互変異性化により 7 および 8 が得られる一方で、FADOOH との求核反応によりジオール生成物 3 および 9 が得られることもあります。 1 の酸化的エポキシド開環により、推定上の C4a-O-O-C3' 共有結合付加物 ( 50、図5）。フラビン補因子の標準的な反応性には、ほとんどの場合、N-5 水素化物転移または C-4a での酸素活性化による酸化還元化学が関与します 67。しかし、いくつかのフラボ酵素は、酸化還元中性の方法で共有結合フラビン N-5 基質付加物の形成を触媒することが報告されており 68、例としては、UDP-ガラクトピラノースムターゼ 69、アルキルジヒドロキシアセトンリン酸シンターゼ 70 の触媒サイクルにおけるイミニウム付加物が挙げられます。、フラビンプレニルトランスフェラーゼ 71、チミジル酸シンターゼ 72、および 2-ハロアクリル酸ヒドラターゼ 73。

本研究は、フラビン触媒による非酵素反応中のフラビン N-5 付加物の形成に関与すると思われる例を提供します (図 5)。さらに、フラビン酵素触媒作用におけるヒドロキシル化、エポキシ化、およびバイヤービリガー酸化を媒介する求核試薬として機能することに加えて、フラビン C(4a)-ペルオキシド (FADOO‒) は、14 などの過酸化中間体の形成も促進することが提案されています。 .5）。フラビンおよびフラビン誘導体は、自然界で見られるさまざまな反応に補因子として関与することがよく知られています 67,74。以前の報告では、天然フラビンがピコリン酸誘導体の非酵素的酸化的脱炭酸反応 75 と、多様な芳香族化合物の非酵素的ヨウ素化 37,59 を触媒できることが示されています。この研究では、フラビンの化学を還元的および酸化的両方の方法でエポキシド開環反応に拡張し、複数の開環生成物を生成します。したがって、この研究で特定されたフラビンの化学は他のエポキシドにも適用できる可能性があり、有機合成における有用なツールとして期待されています。

FST の単離には、Micromonospora rosaria SCSIO N160 株を使用しました15。 FST Q (21) は、以前に Streptomyces sp. から単離されました。 PKU-MA0004517。化学物質、酵素、およびその他の分子生物学的試薬は標準的な商業供給源から購入し、製造業者の推奨に従って使用しました。

反応の HPLC 分析は通常、逆相 C18 カラム (Kinetex® 5 µm C18 100 Å、LC カラム 150 × 4.6 mm、Phenomenex、米国) を使用して、Agilent 1260 Infinity シリーズ装置 (Agilent Technologies Inc.、米国) で実行されました。以下のプログラムで 256 または 304 nm で UV 検出を行う極性カラム (Comixsep®、P/N FMG-BPF5-EONU、Polar BiPFP 5 u、250 × 4.6 mm、中国): 溶媒 A、10% アセトニトリル (MeCN) 0.1% ギ酸を補充した水中で。溶媒 B、90% MeCN 水溶液; 5% B ～ 80% B (0 ～ 20 分)、80% B ～ 100% B (20 ～ 21 分)、100% B (21 ～ 24 分)、100% B ～ 5% B (24 ～ 25 分) )、5% B (25 ～ 30 分)。 1 mL min−1 での流量。

Streptomyces bottropensis 11 のリシリリド生合成遺伝子クラスターに由来する rs105 (GenBank: KJ437438.1 [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KJ437438.1]) の DNA フラグメントを合成し、pET28a にクローニングして、プラスミド pCSG8112 (補足表 S14)。カナマイシン (50 μg mL-1) を含む LB 培地で大腸菌 BL21(DE3)/pCSG8112 の培養物を 37 °C で約 0.6 の OD600 まで増殖させると、イソプロピル- β-d-チオガラクトピラノシド (IPTG) を最終濃度 0.1 mM まで添加。培養物を16℃でさらに12時間増殖させた。次いで、細胞を遠心分離によって収集し、超音波処理のために溶解緩衝液(20 mM Tris-Cl、500 mM NaCl、および5 mM イミダゾール、pH 8.0)に再懸濁した。Ｎ−Ｈｉｓ６タグ付きＲｓ１０５の精製は、製造業者のマニュアル（Novagen、USA）に従って、Ni-NTAアフィニティークロマトグラフィーを使用して実施した。 PD-10 カラム (GE Healthcare、米国) で脱塩した後、精製 Rs105 を保存緩衝液 (10% グリセロール、1 mM DTT、50 mM Tris-Cl、100 mM NaCl、pH 8.0) 中に -80 °C で保存しました。さらなる使用のために。 Fre34、Alp1U18、FlsH18、XiaK38、TiaM36、およびFlsO235の発現および精製は、Rs105について記載したのと同様に実施した。標準的な in vitro 酵素アッセイ (Alp1U、FlsH、Fre、XiaK、TiaM、Fre、または FlsO2) には、50 mM PBS (リン酸緩衝生理食塩水) 緩衝液 (pH 7.0) 中に 100 μM FST C (1) および 10 μM の精製組換え酵素が含まれていました。 ) 総量 100 μL で 30 °C で 0.5 ～ 2 時間インキュベートします。１００μＬの氷冷ＭｅＯＨを添加することによって反応を停止させ、一般的な分析用ＨＰＬＣ法を使用してモニタリングした。

典型的な反応混合物には、50 mM PBS 緩衝液 (pH 7.0) に 100 μM の 1、100 μM FAD および 10 mM NADH が含まれており、総量 100 μL で 30 °C で 0.5 ～ 2 時間インキュベートします。一般に、１００μＬの氷冷ＭｅＯＨを添加することによって反応を停止させ、一般的な分析用ＨＰＬＣ法を使用するＨＰＬＣによって分析するか、またはＬＣ－ＭＳ分析に供した。嫌気条件下での反応の場合、1 を添加する前に反応バッファーを N2 で 5 分間フラッシュし、パラフィルムを使用してキャップを密閉し、30 °C で 30 分間のインキュベーション中に N2 でフラッシュしました。好気条件下での反応の場合、1 を添加する前に反応バッファーを O2 で 5 分間フラッシュし、パラフィルムを使用してキャップを密閉し、30 °C で 30 分間のインキュベーション中に O2 でフラッシュしました。２Ｈによる同位体標識反応の場合、各反応は重水素水（２Ｈ２Ｏ）で調製した５０ｍＭＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で実施した。 18O2 による同位体標識反応の場合、50 mM PBS 緩衝液 (pH 7.0) 中に 100 μM FAD および 10 mM NADH を含む反応混合物を脱気し、18O2 で 5 分間フラッシュしました。 100μMの1を添加した後、時々振盪しながら室温で2時間、18O2ガスを反応混合物中に連続的に泡立てた。

反応に対する pH の影響を決定するために、30 °C でインキュベートし、pH 値が 3 ～ 10 の範囲の 50 mM 緩衝液中に 100 μM 1、100 μM FAD および 10 mM NADH を含む総容量 100 μL でアッセイを実行しました。 2時間。緩衝液は次のように調製しました。クエン酸/Na2HPO4 緩衝液 (pH 3 ～ 6)。 PBS バッファー (pH 7); ホウ酸/ホウ砂緩衝液 (pH 8 ～ 9)、ホウ砂/NaOH 緩衝液 (pH 10)。コントロールとして、100 μM 1 を、100 μM FAD 単独（または 10 mM NADH 単独）の存在下、さまざまな pH 緩衝液（pH 3 ～ 10）中で 30 °C で 2 時間インキュベートしました。

経時的アッセイでは、100 μM 1、100 μM FAD、および 10 mM NADH を 50 mM PBS 緩衝液 (pH 7.0) 中で 30 °C でインキュベートし、0、2、4、6、6 回の異なる時点でサンプリングして反応を実行しました。 8分、10分、12分、14分、16分、20分、25分、30分異なるFAD/NADH濃度の効果をアッセイするために、様々な濃度のFADおよびNADHを含む50mM PBS緩衝液(pH 7.0)中の100μMの1を用いて反応を実施した。最初のセットの反応は、100 μM 1、1 μM FAD、および 2 (または 5 または 10 mM) NADH を用いて実施されました。 2番目のセットの反応は、100μM 1、10μM FAD、および2 (または5または10) mM NADHを用いて実行されました。３番目のセットの反応は、１００μＭの１、１００μＭのＦＡＤ、および２（または５または１０）ｍＭのＮＡＤＨを用いて実施した。反応混合物を50 mM PBS緩衝液(pH 7.0)中で30℃で30分間インキュベートした。

補因子の適合性をテストするために、50 mM PBS 緩衝液 (pH 7.0) 中に 100 μM の 1, 100 μM FAD (または FMN/リボフラビン/イソアロキサジン) および 10 mM NADH を含む総量 100 μL のアッセイを 30 °C で 1 分間インキュベートしました。 30分。補因子として F420 をテストする場合は、50 mM トリス-HCl 緩衝液 (pH 7.5) に 100 μM の 1, 200 μM F420、2.5 mM グルコース-6-リン酸、10 μM F420 依存性グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ (FGD) を含むアッセイを使用します。 ) を総量 100 μL 中で 30 °C で 1 時間インキュベートしました。

FAD/NADH 媒介エポキシド開環反応は、FST 関連基質 15 ～ 21 と FST 非関連基質 28 ～ 37、42、45、および 46 の両方を含むさまざまな基質を使用してテストされました。典型的な反応混合物には 100 μM の基質 (15 ‒21、28 ～ 37、42、45、または 46)、100 μM FAD および 10 mM NADH を含む 50 mM PBS 緩衝液 (pH 7.0) の総量 100 μL。

FST C (1) と H2O2 の反応性を試験するために、pH 3.0 (または pH 7.0 または pH 10.0) の 50 mM 緩衝液中 100 μM の 1 および 30% H2O2 を含む総量 100 μL でアッセイをインキュベートして実行しました。 30℃で2時間。

総量 1 L 中の 1 のスケールアップ反応を、100 μM 1、10 mM NADH および 100 μM FAD を含む 50 mM PBS 緩衝液 (pH 7.0) 中で、時々振盪しながら 30 °C で 2 時間実行しました。等量の氷冷ブタノンを加えて反応を停止し、2057×g、4℃で20分間遠心分離しました。次いで、反応混合物を等量のブタノンで３回抽出し、溶媒を氷浴上で真空下で除去した。粗抽出物を 1.5 mL MeOH に溶解し、Agilent Eclipse XDB-C18 カラム (250 mm × 9.4 mm、5 μm、Agilent technology Ltd.、米国) を使用し、70% A の定組成溶出勾配で半分取 HPLC に供しました。 (0.8% ギ酸を含む H2O) および 30% B (MeCN)、流速 2.5 mL min-1。このようにして、化合物 3 (8.5 mg、22.0%)、7 (22.0 mg、57.0%)、8 (6.0 mg、15.5%)、9 (2.6 mg、6.7%)、10 (1.6 mg、4.1%)、および１１（３．４ｍｇ、８．８％）が得られた。同様に、100 μM FST F (2) との 40 mL スケールの反応により、22 (2.0 mg、15%)、23 (6.0 mg、46.0%)、24 (0.9 mg、7.0%)、および 25 (1.2 mg、 9.0%）。 16、17、または 36 の 30 mL スケールの反応では、それぞれ 26 (1.3 mg、44.0%)、27 (1.5 mg、46.0%)、または 38 (1.3 mg、67.0%) が得られました。 37 の 30 mL スケールの反応により、39 (1.8 mg、11.0%)、40 (4.8 mg、30.0%)、および 41 (4.3 mg、27.0%) が得られました。

3-18O および 9-18O の単離では、50 mM PBS 緩衝液 (pH 7.0) 中の 100 μM 1、100 μM FAD、および 10 mM NADH からなる 1 の 400 mL スケール反応を 18O2 下でインキュベートして実行しました。 30℃で2時間。反応生成物を上記のように準分取ＨＰＬＣにより精製して、３−１８Ｏ（３．０ｍｇ、３３．０％）および９−１８Ｏ（１．２ｍｇ、１６．０％）を得た。 7-2H および 8-2H の単離では、2H による同位体標識の 400 mL スケールの反応を、100 µM の 1、100 µM の FAD、および10 mM NADH、30 °C で 2 時間インキュベート。反応生成物を半分取HPLCにより精製して、7-2H (11.5 mg、65.0%)および8-2H (3.2 mg、19.0%)を得た。

50 mM PBS 緩衝液 (pH 7.0) 中に 100 μM の 1、10 μM の FAD、および 2 mM NADH を含む総量 100 μL の反応混合物を、通常の雰囲気下、30 °C で 20 分間インキュベートしました。１００μＬの氷冷ＭｅＯＨを添加することにより反応を停止させた。 13 の安定性をチェックするために、中間体 13 を一般的な分析 HPLC 実行から収集し、HPLC 分析のために直ちに再注入しました。同様に、さまざまな条件下で 13 の変化を監視するために、新たに収集した 13 を、(i) 10 μM FAD を含む 50 mM PBS 緩衝液 (pH 7.0) 中で直ちにインキュベートしました。 (ii) 30% H2O2; (iii) 2 mM NADH; (iv) 10 μM FAD および 2 mM NADH (過剰な O2 存在下) 30 °C、30 分間。１００μＬの氷冷ＭｅＯＨを添加することによって反応をクエンチし、Ｃ１８カラムおよび極性カラムを使用する一般的な分析ＨＰＬＣ法によってモニタリングした。

100 μM 1、10 μM FAD、および 2 mM NADH を含む 50 mM PBS 緩衝液 (pH 7.0) を含む総容量 50 mL (100 μL × 500 エッペンドルフチューブ) でのスケールアップ反応を、30 °C で 20 分間実行しました。構造解明のために13を単離することが目的。各エッペンドルフチューブ内の反応を、１００μＬの氷冷ブタノンで３回抽出することによって停止させ、溶媒を氷浴上で真空下で除去した。次いで、粗抽出物を収集し、１．０ｍＬのＭｅＯＨに溶解し、極性カラムを使用する一般的な分析用ＨＰＬＣに供した。凍結乾燥する前に、コレクションを -80 °C で保存しました。収集した画分を再度精製して、13 の分解で生成した 7 を除去しました。このプロセスにより最終的に純粋で安定な化合物 (0.8 mg) が得られ、これを NMR 分析のために DMSO-d6 に溶解し、次の化合物であることが確認されました。 14.

14 の安定性をチェックするために一連のアッセイを実行しました。典型的な反応混合物には、50 mM PBS 緩衝液 (pH 7.0) 中に 100 μM 14、10 μM FAD、および 2 mM NADH が含まれており、総量 100 μL でした。アッセイにおいてFADまたはNADHを省略することにより、対照反応を並行して実行した。 30% H2O2 中の 100 μM 14 の同時インキュベーションも、総量 100 μL で実行しました。反応混合物を 30 °C で 30 分間インキュベートしました。１００μＬの氷冷ＭｅＯＨを添加した後に反応を停止させ、一般的な分析用ＨＰＬＣ法に従って極性カラムを使用するＨＰＬＣによって分析した。

標準的なＲｓ１０５インビトロ反応混合物は、５０μＭ中に１００μＭのトランス−１，３−ジフェニル−２，３−エポキシプロパン−１−オン（４５）またはカルコンα，β−エポキシド（４６）、１０μＭのＲｓ１０５および５ｍＭのＮＡＤＨを含んでいた。 mM PBS バッファー (pH 7.0) を総量 100 μL に加え、30 °C で 2 時間インキュベートしました。４６との反応はまた、重水素化水（２Ｈ２Ｏ）で調製した５０ｍＭＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で実施し、ＬＣ−ＨＲＥＳＩＭＳ分析に供して、溶媒から４７への２Ｈの取り込みを調査した。構造解明のために４７を単離するために、１００μＭの４６、１０μＭのＲｓ１０５および５ｍＭのＮＡＤＨを含む５０ｍＭのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で１５ｍＬの反応を３０℃で６時間実施した。反応物を等量の予冷したブタノンでクエンチした。 2057 × g、4 °C で 20 分間遠心分離した後、上清を等量の予冷ブタノンで 3 回抽出しました。ブタノンを氷浴上で真空下で除去した。粗抽出物を５００μＬのＭｅＯＨに溶解し、Ｃ１８カラム（２５０ｍｍ×１０．０ｍｍ、５μｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、ＵＳＡ）を使用し、６０％Ａ（０．８％のＨ２Ｏ）の定組成溶出勾配で半分取ＨＰＬＣによって精製した。％ギ酸）／４０％Ｂ（ＭｅＣＮ）を２．５ｍＬ／分の流速で混合して、４７（３．０ｍｇ、４１．０％）を得た。

大腸菌 BL21(DE3)/pRSF-BmGDH 内のバチルスメガテリウム DSM 2894 からの d-グルコースデヒドロゲナーゼ BmGDH と大腸菌 BL21(DE3)/pCSG3622 内のサーモプラズマアシドフィラムからの TaGDH の精製は、我々の以前の研究 76 に従って実行されました。 Rs1O5/GDH カップリングアッセイの場合、NADP から NADPH への還元は、50 mM 中に 10 μM TaGDH (または BmGDH)、2 mM NADP、および 100 mM [1-2H]d-グルコースを含む 100 μL 反応液で最初に実行されました。リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.0）に、BmGDHの場合は37℃、TaGDHの場合は50℃で1時間インキュベートし、続いて100μMの46および10mMのRs105を添加し、さらに30℃で6時間インキュベートする。その場で生成した 2H 標識 NADH も 1 および FAD と反応させて、生成物 7 への 2H の取り込みをモニタリングしました。反応は等量の氷冷 MeOH でクエンチし、一般的な分析手法を使用して LC-HRESIMS で分析しました。 HPLC法。

混合ねじれ/ローモード立体配座検索は、21 kJ/mol エネルギーウィンドウを適用する CHCl3 の暗黙的溶媒モデルを備えた MMFF を使用する Macromodel 10.8.011 ソフトウェアによって実行されました 77。得られた配座異性体の幾何学的再最適化は、MeCN の PCM 溶媒モデルを使用して、ωB97X/TZVP レベルで実行されました。 TDDFT ECD 計算は、さまざまな汎関数 (B3LYP、BH&HLYP、CAM-B3LYP、PBE0) と、前述の DFT 最適化ステップと同じ溶媒モデルを使用した TZVP 基底セットを使用して、ECD のガウス 09 で実行されました 78。 ECD スペクトルは、双極子速度から計算された回転強度値を使用して、3000 および 3600 cm-1 の半値幅を持つガウス分布の合計として生成されました 79。ボルツマン分布は、ωB97X エネルギーから推定されました。 MOLEKEL ソフトウェアパッケージは、結果の視覚化に使用されました80。

７、１０、２３はＭｅＯＨと水の混合溶媒中で単結晶が得られ、４０はＣＨ３ＣＮとＨ２Ｏの混合溶媒中で単結晶が得られた。適切な結晶が選択され、結晶データは XtaLAB AFC12 (RINC): カッパ単回折計、Cu Kα 放射線 (λ = 1.541 84 Å) で記録されました。データ収集中、結晶は 7 日間は 99.9(7) K、23 日間は 99.8(9) K、10 日間は 100.00(10) K、および 40 日間は 100.01(12) K に維持されました。 Olex281 を使用して、構造は固有位相制御を使用する ShelXT82 構造解析プログラムで解析され、最小二乗最小化を使用する ShelXL 改良パッケージで改良されました。

この原稿のデータとコードは、公開データリポジトリに適切に保管されているか、一般公開用の補足情報として提供されています。 7 (CCDC 2036399)、10 (CCDC 2129081)、23 (CCDC 2036400)、および 40 (CCDC 2036401) の結晶学的データは、www.ccdc.cam.ac.uk/data_request/cif 経由、または次の方法で無料で入手できます。 [email protected] に電子メールで送信するか、The Cambridge Crystallographic Data Centre, 12 Union Road, Cambridge CB2 1EZ, UK までご連絡ください。ファックス: +44 1223 336033。rs105のDNA断片のGenBankアクセッション番号はKJ437438.1(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KJ437438.1)である。

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この研究は、中国国家自然科学財団 (CZ への 31820103003、WZ への 42176127、WZ への 41676165、CZ への 31630004、および CY への 31700042) によって部分的に支援されています。海南省の主要科学技術プロジェクト (ZDKJ202018 to CZ); MOST (2018YFA0901903 から YZ); KC ウォン教育財団 (GJTD-2020-12 to CZ); 広東省海洋経済開発プロジェクト特別基金 (GDNRC[2021] 48 to CZ); 南部海洋科学工学広東研究所 (広州) (GML2019ZD0406 to CZ); 青少年イノベーション推進協会 CAS (2022349 から CY) および広州科学技術計画プロジェクト (202102020471 から CY)。 BCD は、CAS-TWAS 会長の博士フェローシップの支援に感謝します。 H.-wL は、ウェルチ財団 (F-1511) の支援に感謝します。 GB は、ニュージーランド健康研究評議会を通じてサー・チャールズ・ハーカス・フェローシップによって支援されています。化合物 30 を惜しみなく寄贈していただいた中国科学院微生物研究所の Keqiang Fan 教授に感謝いたします。有益な議論をしていただいたテキサス A&M 大学の Tadhg Begley 教授に感謝いたします。分光データの記録については、SCSIO 機器公共サービスセンターの ZH Xiao 博士、XH Zheng 博士、AJ Sun 博士、Y. Zhang 博士、および X. Ma 氏に感謝します。また、中国国家科学技術インフラである国家地球システムデータセンター (http://www.geodata.cn) からのデータアーカイブサポートにも感謝いたします。

これらの著者は同様に貢献しました: Bidhan Chandra De、Wenjun Zhang。

熱帯海洋生物資源および生態学の主要研究所、広東省海洋マテリアメディカの主要研究所、中国科学院南シナ海海洋研究所、広州、510301、中国

Bidhan Chandra De、Wenjun Zhang、Chunfang Yang、Chunshuai Huang、Liping Zhang、Wei Liu、Yiguang Zhu、Changsheng Zhang

中国科学院大学、19 Yuquan Road、北京、100049、中国

Bidhan Chandra De、Wenjun Zhang、Chunfang Yang、Liping Zhang、Yiguang Zhu、Changsheng Zhang

南部海洋科学工学広東研究所（広州）、1119 Haibin Road、Nansha District、Guangzhou、511458、中国

Wenjun Zhang、Chunfang Yang、Liping Zhang、Yiguang Zhu、Changsheng Zhang

三亜海洋生態環境工学研究所、雅州科学湾、三亜、572000、中国

Wenjun Zhang、Chunfang Yang、Yiguang Zhu、Changsheng Zhang

デブレツェン大学有機化学学部、私書箱 400、H-4002、デブレツェン、ハンガリー

アッティラ・マンディ & ティボール・クルタン

テキサス大学オースティン校、ケミカルバイオロジーおよび医薬化学部門、薬学部、化学学部、オースティン、テキサス州、78712、米国

マーク・W・ルシュチッキー & フンウェン・リウ

北京大学薬学部、天然および生物模倣薬の国家重点研究所、38 Xueyuan Road、Haidian District、Beijing、100191、中国

ミン・マ

オークランド大学生物科学部分子微生物生化学研究室、オークランド、ニュージーランド

ガーデルバシリ

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

BCD、WZ、CY、HC、LP、および WL は、エポキシドの開環反応、化合物の単離、および構造決定を実行しました。 AM と TK は ECD の計算を実施しました。 MM と GB は主要な化合物と試薬に貢献しました。 BCD、WZ、MWR、YZ、TK、HwL、CZ がデータを分析して原稿を執筆しました。 CZ と HwL が研究を指揮しました。 BCD と WZ はこの作業に等しく貢献しました。

Hung-wen Liu または Changsheng Zhang との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Xudong Qu と他の匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

De、BC、Zhang、W.、Yang、C. 他。フラビンによる還元的および酸化的エポキシド開環反応。 Nat Commun 13、4896 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-32641-1

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受信日: 2022 年 4 月 9 日

受理日: 2022 年 8 月 8 日

公開日: 2022 年 8 月 20 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32641-1

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