MRI 造影剤としての高度に水和した常磁性非晶質炭酸カルシウム ナノクラスター

Apr 04, 2023

Nature Communications volume 13、記事番号: 5088 (2022) この記事を引用

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非晶質炭酸カルシウムは、自然界における生物起源の炭酸カルシウム形成の初期段階で一時的な前駆体として重要な役割を果たします。 しかし、水溶液中での不安定性のため、非晶質炭酸カルシウムを生物医学に利用する成功例はまだ稀です。 今回我々は、常磁性ガドリニウムイオンと非晶質炭酸カルシウムの間の相互効果を報告し、ガドリニウムが吸蔵された高水和炭酸塩様環境とポリ（アクリル酸）の両方の存在下で超微細な常磁性非晶質炭酸カルシウムナノクラスターを生成することを報告する。 ガドリニウムは非晶質炭酸カルシウムの水分含有量を高めることが確認されており、非晶質炭酸カルシウムナノクラスターの高い水分含有量は、市販のガドリニウムベースの造影剤と比較して、磁気共鳴画像処理のコントラスト効率の大幅な向上に貢献します。 さらに、非晶質炭酸塩ナノクラスターの向上した T1 強調磁気共鳴イメージング性能と生体適合性は、生体内での安全性が期待できることと併せて、ラット、ウサギ、ビーグル犬などのさまざまな動物でさらに評価されています。 全体として、非常に容易に大量生産できる非晶質炭酸塩ナノクラスターは、優れたイメージング性能と印象的な安定性を示し、磁気共鳴造影剤を設計するための有望な戦略を提供します。

自然界に広く存在する非晶質炭酸カルシウム (ACC) は、生体ミネラル形成の初期段階で一時的な前駆体として重要な役割を果たしています 1,2,3,4。 生物からインスピレーションを得た戦略を使用すると、制御された相、物理的および化学的特性を持つ多様な材料を実現できます5、6。 高度に含水している内容は ACC の特徴であり、その安定化において極めて重要な役割を果たしています 6,7,8,9,10,11,12。 炭酸カルシウムの準安定相である ACC は水溶液中で不安定であり、脱水、イオン結合およびその他の要因により急速に結晶相に変化します 6、7、8、13。 したがって、高水和ACCの潜在的な応用はほとんど無視されており、生物医学におけるACCの利用の成功例はほとんどありません。

ガドリニウムベースの T1 MRI 造影剤の造影性能を向上させる重要なパラメータの 1 つは、その水和です 14。 ガドリニウム イオンは 7 個の不対電子を持ち、大きな磁気モーメントと長い電子スピン緩和時間を備えているため、臨床的に利用可能な T1 MRI 用の細胞外ガドリニウムベースの造影剤が数多く存在します 14,15。 生体内で生体分子と相互作用するための多用途な機能化と、無機ナノ構造の利点によるガドリニウムイオン漏出率の低下により、Gd ベースの無機ナノ薬剤は大きな注目を集めました 15,16。 残念なことに、ガドリニウムベースのナノ粒子の水和は高温合成の影響を受けますが、結果として生じるイオン漏出は、キレート錯体と比較して閉じ込められたナノ構造によって最小限に抑えられます15。

ここでは、ACC 鉱化プロセスにガドリニウム イオンを導入します。これは、最終的な非晶質炭酸カルシウム相に統合されることが証明されています。 この非晶質系では、ガドリニウムイオンがポリ（アクリル酸）と組み合わされることで水和水とナノクラスターの安定性が向上し、炭酸塩によるガドリニウムイオンの閉じ込めにより生体適合性と性能が向上し、得られた製品が注目すべきMRI造影剤特性を備えていることが示されました。 さらに、常磁性ランタニドガドリニウムイオンと非晶質炭酸カルシウムの間の相互効果が発見され、それが調製されたままの非晶質複合ナノクラスターの水和含有量の最大化と高い縦緩和に寄与する。 最終的な常磁性非晶質炭酸塩ナノクラスター (ACNC) は、通常の ACC と比較して高い水対 Ca 比 (水/Ca = 7.2) を持っています (比は約 0.4 ～ 1.9 で一定の​​まま)。 ACNC の縦緩和能 (3.0 T で 37.93 ± 0.63 mM-1 · s-1) は、市販の MR 造影剤ガドペンテチン酸 (Gd-DTPA) の 10 倍である高い含水量からも恩恵を受けています。イオン漏洩に対する耐性が高いため、MR 造影剤として使用できる可能性があります。

これまでのところ、生体分子やポリマーなどのさまざまな種類の有機添加剤のほかに、ACC を安定化できることが報告されている唯一の無機陽イオンはマグネシウムです6,17。 ガドリニウムイオンは、そのイオン半径がマグネシウムよりもカルシウムイオンに近いため、より高い価数と水和エネルギーを備えた小型のカルシウムイオン類似体とみなすことができます18,19。 ACC7,20の安定性を高めるためのポリ（アクリル酸）（PAA）とカルシウム間のキレート化と同様に、PAAのカルボキシレート基はガドリニウムイオンをキレート化する可能性があり、結合した複合体が後にカーボネートに固化することを可能にします21。

図1aに示すように、塩化カルシウムと塩化ガドリニウムをPAAと混合し、次に等モルの炭酸ナトリウム溶液を激しく撹拌しながら加えました。 室温でのこの効率的な合成により、ガドリニウムと PAA の両方の存在下で ACNC が得られることが証明されました。 2 リットルの水性生成物が容易に生成でき、ここで報告する方法の拡張性と再現性が示されています (図 1b)。 生理食塩水中に分散したクラスターの存在は、チンダル効果を反映していました (図 1c)。 図1dに示すように、球状形態は低温透過電子顕微鏡法（cryo-TEM）によってさらに調査され、以前に報告されたようにACCと同等であることが証明されました22。 STEMによって観察されたナノクラスター（補足図1）は、高角度環状暗視野走査TEM（HAADF-STEM）観察と一致しており、クラスターの非晶質特性はSAED分析によって検証されました（図1e）。 EDS データは、クラスター凝集体中のガドリニウムとカルシウムの均一な分布を示しました（補足図 2a、b）。

ACNCの合成プロセスのスキーム。 b 総容積が 2 リットルを超える大規模に準備された ACNC のデジタル画像。 c 生理食塩水に分散させた 4 リットルの ACNC と 1 本の脱イオン水ボトルを挿入した場合のチンダル効果のデジタル画像 (右から 2 番目)。 d 通常の食塩水に分散した ACNC のクライオ TEM および e HAADF-STEM 画像。 3 つの個別の実験の代表的な画像が示されています。 (e) の挿入図は ACNC の SAED を示しています。 実験は独立して 3 回繰り返されました。 f k2 加重 EXAFS および g ACNC および ACC 標準の EXAFS の k2 加重フーリエ変換。 黒い点線が最適です。 h 通常の食塩水に分散した ACNC の SAXS パターン。 赤い実線は球粒子に適合します。 i 生理食塩水中に分散した ACNC の SAXS が受信した距離分布。 j N2 雰囲気下、加熱速度 10 °C min−1 での ACNC 粉末の TGA。 k N2 雰囲気下、10 °C min-1 の加熱速度での ACNC 粉末の TG-FTIR スペクトル。

ACNCは、6か月間水溶液に分散させた後でも、粉末X線回折（XRD）パターンに結晶ピークを示さなかった（補足図3）。 ACNC の X 線光電子分光法 (XPS) では、酸素 (O 1s)、炭素 (C 1s)、ガドリニウム (Gd 4d)、およびカルシウム (Ca 2p) にそれぞれ対応する特徴的なピークが示されました。 ACC7 の以前の観察と一致して、結合エネルギー 350.8 および 347.3 eV のピークは、それぞれ Ca 2p1/2 および Ca 2p3/2 状態に起因すると考えられました。 Gd 4dのコアレベルスペクトルでは、142.6 eVと150.6 eVで2つのピークが観察され、それぞれGd 4d5/2およびGd 4d3/2状態に対応しました（補足図4）。 ACNC は X 線吸収分光法 (XAS) および拡張 X 線吸収微細構造 (EXAFS) 分析によってさらに研究され、ACNC 内の Ca-O 近距離環境は ACC 標準および以前に報告されたACC10、11、23（図1f、g、補足表1、2）。 SAXSフィッティング分析から得られたACNCのサイズ分布は、平均半径1.3 nmを示しました（図1h、i）。

ACNC の熱重量分析 (TGA) および示差走査熱量計 (DSC) の結果は、300 °C に加熱すると ACC の脱水による 20 wt% 以上の損失を示し、ACNC の含水量が高いことを示しました。 さらに、PAAの熱分解は300〜500℃の間で起こり、炭酸塩は550℃を超えると分解されました（図1jおよび補足図5）。 TGA の結果に基づくと、ACNC の組成には、約 20% の水分含有量、40% の PAA、および 40% の非晶質炭酸塩が含まれていました。 ACNC上のTGA結合FTIR（TG-FTIR）で550℃以上の2358および2322cm-1で観察された吸光度は、炭酸塩の分解によるCO2の非対称伸縮振動に対応しました（図1k）。 補足図6に示すように、フーリエ変換赤外分光法（FTIR）の1415および1454 cm-1の分割バンドは、典型的なACC環境における炭酸イオンの非対称伸縮振動に割り当てることができます20。 内部の CO32 対称ストレッチに起因する 1086 cm-1 を中心とする幅広いピークがラマン分光法によってさらに確認されました（補足図 7）。

高含水量および ACC 様環境に対する各成分の寄与を調査するために、補足表 3 にリストされているように、Gd 吸蔵 ACC 複合材料 (ACC-Gd) を含む、さまざまな組成の一連の対照サンプルを合成しました。 PAA 安定化 ACC (ACC-PAA)、非晶質炭酸ガドリニウム (AGC)、PAA 安定化 AGC (AGC-PAA)、および 2 つの炭酸塩を含まないキレート (PAA-Ca および PAA-Ca/Gd)。 XRDパターンとラマンスペクトルを実行して、非晶質相を特定しました（補足図8a、b）12。 拡張X線吸収微細構造（EXAFS）の結果により、ACCのような環境の存在がさらに確認されました（図2a、b）。

a k2 加重 EXAFS、b ACNC、ACC 標準、ACC-PAA、ACC-Gd、PAA-Ca、PAA-Ca/Gd の EXAFS の k2 加重フーリエ変換。 黒い点線が最適です。 c 脱イオン水で分離され、6 か月以上乾燥空気にさらされた ACC および ACC-Gd 凍結乾燥粉末の熱重量曲線。 300 °C より前の重量減少は、水分の損失に起因すると考えられます。 d 熱重量分析 (TG) 分析およびカールフィッシャー容量滴定測定による、ACC、ACC-PAA、ACC-Gd、AGC、AGC-PAA、および ACNC の水分含有量 (n = 3 個の独立したサンプル)。 データは平均±SDを示します。 e ACC、ACC-PAA、ACC-Gd、および ACNC における CaCO3 1 モル当たりの水分子のモル比を、無添加 ACC (ピンク色の領域) および PAA で安定化させた ACC (オレンジ色の領域) の報告値範囲と比較した (n = 3 つの独立したサンプル)。 データは平均±SDを示します。 f AGC、AGC-PAA、ACC-Gd、および ACNC における Gd 1 モルあたりの水の分子のモル比 (n = 3 の独立したサンプル)。 データは平均±SDを示します。

PAAが存在しない場合、ACC-Gdは、GdとCaが均一に分布した凝集ACCナノ粒子の典型的な形態を示しました（補足図9）。 ACC-Gd の 13 C 核磁気共鳴 (NMR) の結果は、168 ppm で特徴的な振動を示し、これは ACC-Gd の ACC 前駆体相を示しました (補足図 10)。 FT-IRスペクトルは、非晶質炭酸カルシウム相と比較して一貫性を示し、v2振動がより低い値にシフトしたことは、非晶質炭酸ガドリニウム（AGC）相の形成を示しました（補足図11）24。 ACG の XPS 結果の酸素 (O 1s) ピークは、ACC の曲線と非常に似ていました (補足図 12)7。 AGC-PAAのXPSスペクトルは、ACNCと同様のプロファイルを示しました（補足図13）。

Gd が ACC の安定性にどのような影響を与えるかをさらに調査するために、ACC-Gd の変換をさまざまな媒体 (エタノール、水) 中で調査しました。 サンプルの XRD 結果は、さまざまな時点で収集されました (補足図 14)。 6 か月後、エタノールに分散した ACNC には方解石、アラゴナイト、バテライトがすべて含まれていました。 顕著な対照的に、ACC-Gd はエタノール中で 6 か月以上安定でした。 新たに調製した添加物を含まないACCは水に分散させた後急速に結晶化したが、ACC-Gdは数十分の間非晶質相を維持できた。 全体として、Gd は ACC の結晶化を遅らせるのに適切な役割を果たすはずです。 さらに魅力的なのは、純粋な ACC と比較して、ACC-Gd には依然として高い水分含有量が長期間にわたって保持されていることです。 TGAの結果によると、ACC-GdおよびACC粉末の300℃前の6ヶ月間の空気暴露後の重量減少は、それぞれ10％以上、わずか0.1％でした（図2c）。 この条件下では、ACC は水分補給水を完全に失っていることに注意してください。

TGA と体積カールフィッシャー滴定の両方の測定結果において、300 °C までの重量損失は水の損失に割り当てることができ、ACNC は異なる組成の製品の中で計算上の 20 wt% という最も高い含水量を示しました（図 2d）。 。 以前の報告によると、無添加 ACC および PAA 安定化 ACC のカルシウム 1 モルあたりの水分含量は、通常、それぞれ 0.4 ～ 1.58 および 1.33 ～ 1.93 の範囲にありました 20,25。 反対に、ACC-GdとACC-PAAは両方ともより高い水対Ca比を示し、ACNC（水/Ca = 7.2）で最も高い比が得られました（図2e）。これは、PAAとACC-PAAによる水結合の相乗強化を示しています。これらの非晶質ナノ粒子には Gd が含まれています。 さらに重要なことは、図2fにリストされている水とGdの比率を比較すると、ACNC内のACCのような環境とPAAの両方の存在下でのガドリニウム1モルあたりの水和含有量は、PAAで吸蔵された炭酸ガドリニウムの4倍以上です（ PAA-AGC）。 AGC と比較して、Gd-ACC 複合材料に ACC が存在することにより、ガドリニウム イオンあたりの水和含量が 2 倍増加しました。

水和の起源を調査するために、分析超遠心分離（AUC）を適用して、電子顕微鏡画像に見られる球形を仮定した摩擦比とペリン関数を介してACNCの水和水を決定しました（補足表4）。 サンプルは 10-13 秒程度の沈降係数を示し、これは同様のサイズを持つ核生成前クラスター (PNC) に典型的なものです 26。 ACNC の直径は 1.5 nm で、SAXS で見つかった直径よりもさらに小さいですが、それでも十分に一致しています。 分子量 2230 g/mol は、Gd3+ イオンを含む約 20 個の CaCO3 イオンペアで構成されていることを示しています。 CaCO3あたり8.8モルH2O（およびGd3+あたり23.0モルH2O）の溶液中の結合水和水の決定された量は、一般的なACCよりもかなり高い（図2e、fおよび補足表5）。 特に、水和がそれぞれ湿潤状態と乾燥状態で測定されたことを考慮すると、AUC によって測定された ACNC の水分含量は、TGA の結果と合理的に一致しています6。

高水和ACC含有量に対するガドリニウムイオンのドーパントの寄与に加えて、M-H曲線に示されているように、非晶質炭酸塩ナノクラスターでは典型的な常磁性挙動が達成されました（図3a）。 常磁性 ACNC は、高い水和とガドリニウム イオンの閉じ込めの両方により、MRI コントラスト性能の向上に役立ちました。 生理食塩水中にさまざまな濃度で分散させた ACNC の T1 緩和時間を、3.0 テスラ MR スキャナーを使用して測定しました。 T1マップ（図3b）に示されているように、ACNCの縦緩和係数（r1）は37.21 mM-1・s-1（図3c）に達し、これは市販のGd-DTPA（3.19mM）の10倍でした。 mM−1・s−1）。 高分子とナノ粒子の寄与に加えて、ACNC は PAA 修飾非晶質炭酸ガドリニウム (AGC-PAA) (7.91 mM-1・s-1) と比較して 4 倍高い縦緩和能を有しており、これは ACC の高い水和含量に起因すると考えられます。 -のような環境。 この高い水含有量は、主に、二価の Ca2+ イオンと比較して三価の Gd3+ のより強い水和能力に起因すると考えられます 19。これにより、ACC 様環境が閉塞した ACNC14 の内圏および外圏の緩和が合理的に強化されました。

室温での ACNC の M-H 曲線。 b、c 3.0 T における ACNC (R2 = 0.9999)、AGC-PAA (R2 = 0.9987)、および Gd-DTPA (R2 = 0.9966) の T1 マップおよび 1/T1 対 Gd 濃度曲線。 d 1 モルあたりの水分子のモル比ACNC、ACNC(2n-PAA)、ACNC(n/2-PAA)、および ACNC(n/10-PAA) における Gd および r1 緩和度の解析 (n = 3 の独立したサンプル)。 データは平均±SDを示します。 e ACNC (R2 = 0.9999)、ACNC(2n-PAA) (R2 = 0.9999)、ACNC(n/2-PAA) (R2 = 0.9999) および ACNC(n/10-PAA) の 1/T1 対 Gd 濃度曲線(R2 = 0.9845) 3.0 T 下の ACNC(Gd/Ca=1:10) (R2 = 0.9993) および ACNC(Gd/Ca=1:2) (R2 = 0.9996) の f 1/T1 対 Gd 濃度曲線3.0 T. g 1/T1 対 3.0 T での ACNC の Gd 濃度曲線 (n = 3 個の独立したサンプル)。 h 1/T1 対 3.0 T (R2 = 0.9993) および 0.5 T (R2 = 0.9999) での ACNC の Gd 濃度曲線。 i 3.0 T (R2 = 0.9991) および 0.5 T (R2 = 0.9999) での ACNC の 1/T2 対 Gd 濃度曲線。 j ACNC、Gd-DTPA、PAA-Ca/Gd のゼロ時間から各時間までの相対 R1 値の展開 (R1(t)/R1(0)) (n = 3 の独立した実験)。 データは平均±SDを示します。

ここでは、PAA の含有量が水分含有量と緩和性に及ぼす影響をさらに評価します。 ACNC 製品の PAA の入力を「n」として示しました。 同じ合成方法を使用して、「2n」、「n/2」、「n/10」の PAA 入力を持ついくつかの製品 (ACNC(2n-PAA)、ACNC(n/2-PAA)、ACNC(n/10 というラベル) -PAA))は、同じ実験条件下で得られました。 PAAを添加すると、製品システム全体の水分含有量が大幅に増加することがわかりました（補足図15）。 ただし、Gd 1 モルあたりの水分子のモル比は、入力サイズ「n」でピークに達しましたが、入力サイズが「2n」など増加すると減少するため、「ジェットコースター」効果も検出されました (図1)。 3d）。 さらに、これらのサンプルの緩和能を測定しました。 興味深いことに、その性能は、ACNC の緩和度が「n」の条件下で最高に達するのに対し、PAA の量が「2n」および「n/2」の場合には低下するという点で、Gd あたりの含水量の性能と非常に一致していました。 。 具体的には、PAAの量がわずか「10/n」の場合、緩和度は大幅に減少しました（図3d、e）。 結果を考慮すると、Gd 1 モル当たりの水分子のモル比が製品の性能に強く影響することは明らかでした。 これらの比較は、同様の変化経路を共有しているため、Gd あたりの水分含有量に応じて緩和度が変化していることを示唆しました。

さらに、比較の目的で、Gd の比率を変えてさらに 2 つの非晶質炭酸塩ナノクラスターを設計および作製しました。 ACNC の合成では、mol[GdCl3]:mol[CaCl2] は 1:5 に等しくなります。 また、初期 Gd/Ca 供給比を 1:10 および 1:2 とした 2 つのサンプルも準備しました (それぞれ ACNC(Gd/Ca=1:10) および ACNC(Gd/Ca=1:2) と表します)。 ACNC（Gd / Ca = 1：10）とACNC（Gd / Ca = 1：2）は両方とも非晶質相であり、3か月以上水溶液に分散した2つの製品のXRDパターンでは結晶化ピークは見つかりませんでした（補足図） .16）。 ＡＣＮＣ（Ｇｄ／Ｃａ＝１：１０）は、Ｇｄのドーピング割合が低い場合、３４．２５ｍＭ−１・ｓ−１という高い緩和度を有し、良好なＭＲ性能を維持した。 しかし、Gdの組み込みレベルが増加すると、ACNC（Gd / Ca = 1：2）の縦緩和率（r1）値は17.21 mM-1・s-1と著しく減少しました（図3f）。 1 つの説明としては、過剰量の Gd が高含水 ACC のような環境を乱す可能性があり、その結果、高含水量の ACC の生成に影響を与える可能性があるということです。 要約すると、Gd のドーピング量は常磁性 ACNC の緩和性に大きく影響し、ACNC はコントラスト性能の点で最良の製品であることがわかりました。

3回のテストの後、ACNCのr1値は〜37.93±0.63mM-1・s-1と計算されました（図3g）。 さらに、ACNCのr1およびr2値が異なる磁場（3.0Tおよび0.5T）下で測定され、対応するr2 / r1比が計算されました（図3h、i）。 3.0 Tで測定したACNCのr1値は38.19 mM-1・s-1と高く、対応するr2値とr2/r1比はそれぞれ72.49 mM-1・s-1と1.90でした。 低磁場 MR スキャナ システム (0.5 T) を使用した場合、ACNC の対応する r1 および r2 値はそれぞれ 66.37 mM-1 · s-1 および 78.04 mM-1 · s-1 であり、r2/r1 比は 1.18 でした。 AUC 測定の結果に基づくと、直径 1.5 nm の ACNC のモル質量は 2230 g/mol でした。 ACNC の緩和密度は、体積と分子量 (それぞれ 21.46 mM-1 · s-1/nm3、17.01 mM-1 · s-1/kDa) を利用して最終的に計算できます。

メタル交換により、腎性全身性線維症などの毒性が報告されている解離ガドリニウムイオンの放出につながるため、ガドリニウムベースの造影剤には高い安定性が不可欠です14,27。 Western と Muller は、市販の Gd-DTPA28 などの線状ガドリニウムベースの造影剤のトランスメタル化に対する運動学的不活性度が低いことを報告しました。 図３ｊに示すように、ＰＡＡ−Ｃａ／Ｇｄキレートは、ＰＢＳ中のＺｎ２＋に４８時間曝露した後、Ｇｄ−ＤＴＰＡよりもさらに悪い不活性を示した。 逆に、ACNC は、ACC のような環境でのガドリニウムの閉じ込めにより、トランスメタル化に対する安定性を明らかに強化しました。 さらに、DTPA と ACNC を含む均一水溶液中でのリガンド競合アッセイにも取り組みました。 ACNCの緩和度が大幅に変化したことを示す観察可能な証拠はなく、ACNCがGd(III)錯体と過剰なDTPAフリーリガンド間の競合の影響を受けないことが確認されました（補足図17）。

Arsenazo III の吸収スペクトルは、一般に、Gd ベースのナノ複合材料およびガドリニウムキレートからのガドリニウムイオンの漏洩を検出するために使用されます 29,30。 アルセナゾIII水溶液をGd3+と混合すると、アルセナゾ-Gd3+錯体の形成によりピンク色の溶液が青色に変わりました（図4a）。 図4bに示すように、1μg/mLの低濃度の遊離ガドリニウムイオンがArsenazo III媒介吸収スペクトルによって検出可能でした。 ただし、ACNCの生理食塩水分散液では、この比色分析を使用して1週間の透析で遊離ガドリニウムイオンの漏出は検出されず、ICP-MSによってさらに確認されました（図4c）。 ACNC とは対照的に、PAA-Ca/Gd キレートは ACNC と比較して明らかな漏洩を示し、炭酸塩によるガドリニウム イオンの閉じ込めがさらに確認されました。

a Arsenazo III 水溶液と、ACNC の透析溶液、生理食塩水 (NS、ネガティブコントロールとして使用)、およびさまざまな濃度 (1、10、および 100 μg Gd/mL) の塩化ガドリニウム水溶液との混合物の写真 (ポジティブコントロール）をそれぞれ。 b ACNC からのガドリニウムの漏出を監視するために、Arsenazo III 透析液混合物および透析液の吸収スペクトルを 7 日間のさまざまな時点で収集しました。 陰性 (NS) および陽性 (塩化ガドリニウム水溶液) 対照と比較して、ガドリニウム イオンの検出可能な漏れは監視されませんでした。 c ICP-AESによる、NSのACNCおよびPAA-Ca / Gdからの遊離ガドリニウムイオンの漏洩の定量分析と比較。 PAA-Ca/Gd キレートは NS において不活性度が低く、7 日後にはキレートから約 9% のガドリニウムが漏出しました。 反対に、ACNC の透析液では遊離ガドリニウム イオンがほとんど検出されませんでした (n = 3 の独立したサンプル)。 データは平均±SDを示します。 d、e 分散ACNCを含むdヒト血清および分散ACNCおよび追加のリン酸塩を補充したeヒト血清から異なる時点で収集された透析溶液とアルセナゾIII混合物の吸収スペクトル。 f さまざまなガドリニウム濃度での ACNC の血液適合性評価 (n = 3 の独立したサンプル)。 データは平均±SDを示します。

pH が組織および細胞の恒常性において重要な役割を果たすことはよく知られています。 さらに、異なる細胞コンパートメントはさまざまな酸塩基条件を示します。 細胞内のさまざまな位置の弱酸性条件を模倣するために、pH 6.0 ～ 6.8 の PBS バッファーを使用しました。 Caイオンの漏出は観察できますが、Gdイオンの漏出は7日ではほとんど検出されませんでした（補足図18）。 リン酸塩の熱力学的溶解度積（Ksp）が炭酸塩よりも低いため、ACNC 内の Gd(III) は PBS 緩衝液中でリン酸塩と GdPO4 を形成する傾向があると推測されます 31。 遊離 Gd3+ イオンの沈殿は中性付近 (pH = 6) 条件で抑制され 32、Gd イオンの漏出が防止され、弱酸性条件下での ACNC の良好な生物学的安全性が示されました。 酢酸緩衝液によってシミュレートされたより酸性の環境pH（pH 4.5〜5.5）下では、pHの低下に伴ってGdイオンの放出がわずかに増加します（補足図18）。 PBS 環境での結果と比較すると、Gd イオンの漏出が改善されたのは、リン酸塩による保護が失われたためであると考えられます。 したがって、Gd(III) は ACNC から漏出しにくく、生理的環境下ではイオンとして存在していると推測されました。

さらに、ACNC は 1 mmol (Gd) /L でヒト血清中に分散されました。 一方、末期腎疾患患者の血清中のリン酸濃度の上昇をシミュレートするため 33、同じ濃度の ACNC を、追加のリン酸濃度 10 mmol/L を補充したヒト血清に 15 日間分散させ、その後、異なる時点で透析を行いました。 。 ICP-MS および比色分析を使用して透析液中に遊離ガドリニウムイオンの漏出は検出されず（図 4d、e、および補足図 19）、これは in vivo の保持期間における ACNC の解離リスクが低いことを示しています。

ACNC が溶血を引き起こすかどうかを判断するために、溶血試験のためにさまざまな濃度の ACNC をヒト血清と 37 °C でインキュベートしました。 規格によれば、ACNC は 0.5 mg (Gd)/mL の高濃度でも血球融解を示さず、良好な血液適合性を示唆しています (図 4f)。 MTT アッセイは、ヒト腎尿細管上皮細胞 (HK-2) またはヒト不死角化細胞 (HaCaT) 株を ACNC と 24 時間および 48 時間共培養することによる細胞毒性の評価として使用されました。 ACNCへの曝露後は、0.5 mg (Gd)/mLの高濃度であっても、細胞の生存率の低下はほとんど誘発されませんでした（補足図20）。 さらに、ACNC（Gd / Ca = 1：10）とACNC（Gd / Ca = 1：2）の両方の良好な細胞適合性が検証されました（補足図21）。 これまでの結果に勇気づけられて、ヒト腎尿細管上皮細胞 (HK-2) を使用して一連の細胞内適合性研究が実施されました。 HK-2細胞の健康なミトコンドリアは、ミトコンドリア膜電位（MMP）研究によって証明されました（補足図22）。 HK-2の免疫蛍光TdT媒介dUTPニックエンドラベリング（TUNEL）染色アッセイは、ACNCが細胞の核DNAに蓄積した損傷を持たないことを示しました（補足図23）。 EdU（5-エチニル-2'-デオキシウリジン）アッセイを実施し、ACNCが細胞増殖に影響を及ぼさないことを確認した（補足図24）。

一方、主要臓器の組織切片は、5 mg Gd / kgの用量でマウスに静脈内注射した2週間後に収集されましたが、H＆E染色画像では病理学的変化の証拠は確認されませんでした（補足図25）。 ウサギの腎臓のH&E染色も実施しましたが、急性腎毒性は観察されませんでした（補足図26）。 マウスにACNCを静脈内注射してから3日後および3週間後、すべての血液学的および生化学的パラメーター値は標準範囲および対照群と一致しました（補足図27）。 大型動物のビーグル犬で高用量（9 mg Gd/kg 体重）でさらに試験したところ、静脈内注射後、対照群と実験群の間に血液学的および生化学的パラメーターに明らかな差はなく（補足図28）、生理学的パラメーターが示唆されています。機能は ACNC によって損なわれませんでした。

ACNC の T1 強調 MRI 性能の向上は、ラット、ウサギ、ビーグル犬の MR 血管造影によってさらに確認されました。 低用量（3 mg/kg 体重）の ACNC をボーラス静脈内注射すると、頚静脈、頸動脈、大動脈、尾大静脈が明確に識別でき（図 5a ～ c​​）、用量は投与量の 1/5 未満です。臨床で通常使用される値。 ラット、ウサギ、およびビーグル犬の上半身の全身血管造影画像は、Gd-DTPA 対照群と比較して、より良好な血管造影コントラストおよびより詳細を示した。 一方、半定量分析では、ACNCグループのシグナル強度がGd-DTPAグループのシグナル強度と比較して顕著に増強されていることが明確に示されました（補足図29、30）。 図5dに示すように、生体内でのACNCのコントラスト強調は、それぞれウサギとビーグル犬の信号対雑音比（SNR）の平均値によってさらに定量的に反映されました34。

a、b (i) Gd-DTPA および (ii) ACNC のボーラス注射直後のラットおよび b ウサギの全身の造​​影 MR 血管造影 (MRA) 画像。 c (i) Gd-DTPA および (ii) ACNC のボーラス注射後すぐ (IM) および 20 秒後のビーグル犬の上半身の MRA 画像。 (C) と (S) はそれぞれ冠状面と矢状面を表します。 d (i) 腕頭幹動脈、(ii) 左鎖骨下動脈、(iii) 左総頚動脈、(iv) ビーグル犬の嗅動脈右枝、および (v) 下行大動脈における ROI の SNR の定量的測定、(vi) 大動脈弓、(vii) ウサギの上行大動脈。 ROI の SNR の定量的測定の時間は、「IM」期間にありました (n = 3 回の独立した実験)。 データは平均±SDを示します。 P は、両側スチューデント t 検定を使用して計算されました (** P < 0.01、*** P < 0.001)。

最近、ナノサイズの生体材料の臨床応用が大きな注目を集め、診断および治療のための新規かつ特異的なナノ医療ツールの開発が期待されています 16,35,36,37,38。 投与されたナノ材料の大部分は肝臓と脾臓によって隔離され、したがってこれらがナノ医薬品を翻訳するための主要な生物学的障壁となっている 39。 in vivo での潜在的なリスクを回避するために、異化と身体への曝露を最小限に抑えるため、腎臓クリアランスが医療物質の望ましく好ましい排泄経路です。 しかし、低分子造影剤と比較して、ナノサイズの MR 造影剤、特に FDA 承認のナノサイズ酸化鉄注射剤は、サイズ分布が大きい (>20 nm) ため、腎排泄が不十分という問題があります 40。 肝臓は、循環系へのアクセスを伴うナノ粒子の感染の第一次または二次標的であり、肝臓内でのナノ粒子の蓄積が避けられない。 肝臓に滞留したナノ粒子は、肝胆道クリアランスを介して肝臓から除去される可能性があります41。 肝臓からの従来の除去（補足図31）に加えて、静脈内注射後のMRA画像では、血管からのACNCの迅速な腎臓クリアランスが観察されました（補足図32）。 さらに、T1w画像では、ビーグル犬の膀胱も20分以内に明るくなりました（補足図33）。 さらに、ICP-AESによって測定されたマウスとビーグル犬の血中濃度-時間曲線に示されているように、ガドリニウムは6時間以内に血管から効果的に除去され、24時間後にはガドリニウムの残留含有量はほとんどありません（図6a）。 、bおよび補足表6)。 ACNCの静脈内注射後に収集されたラット尿では、ガドリニウムの含有量がICP-AESによって検出され、24時間で約13％IDの腎臓クリアランス効率が実証されました（補足図34）。これは金のそれに匹敵します同様の直径を持つナノクラスター42。 豊富なSAED非晶質クラスター凝集体が透析尿のTEM画像で観察でき（図6c）、EDSマッピングにより、ACNCに対応するこれらの凝集体中のガドリニウム、カルシウム、炭素、酸化物元素の一致する分布が明らかになりました（図6d、e） 。 低注射量と腎臓を介した部分クリアランスとの相乗効果による物理化学的および生理学的安定性により、これらのガドリニウムベースの非晶質炭酸塩クラスターの生体内生体適合性と潜在的な翻訳能力がもたらされました。

a、b 24 時間以内の a マウスと b ビーグル犬の血漿中の ACNC の時間依存分布 (n = 5 生物学的に独立した動物)。 データは平均±SDを示します。 c TEM、d EDS の結果、e 注射から 12 時間後に採取されたラットの尿で観察された ACNC の HAADF-STEM 画像と EDS マッピング。 3 つの個別の実験の代表的な画像が示されています。 c の挿入図は相対的な SAED パターンです。 実験は独立して 3 回繰り返されました。

多くのガドリニウムベースの造影剤が T1 MR イメージング用に設計され、世界中で承認されています 14。 価電子帯における高密度の自由電子と、生体内で生体分子と相互作用するための多用途な機能化の結果、さまざまなイメージングモダリティで造影剤として機能する無機ナノ材料は、ナノ医療の臨床応用を達成すると期待されています15,43。 したがって、科学者らは、Gd ベースの無機ナノ粒子の翻訳可能性を調査するために、さまざまな製造方法と明確な薬物動態を含めてたゆまぬ研究を続けました 16。 遊離 Gd イオンの放出に起因する危険性を考慮して、具体的な目的は、性能の向上により注入されるナノ粒子の線量を減らすことでした。

水和レベルは、MR 造影剤の造影性能を決定する際に重要な役割を果たします 14。 残念なことに、Gd ベースのナノ結晶の水和含有量は、従来の高温合成プロセスによって制限されています 15。 言及する価値があるのは、内部の水や深部に位置する構造水を含む高い含水率が、ACC7、8、9、10、11 の最も際立った特徴であることです。 しかし、不安定な水和 ACC の潜在的な応用はほとんど無視されています。 興味深いことに、ガドリニウム イオンのイオン半径はカルシウム イオンのイオン半径に非常に近く、ガドリニウム イオンとカルシウム イオン間の相互作用の可能性を示唆しており、それを利用することができます。

要約すると、我々の研究は、常磁性ランタニドガドリニウムイオンと非晶質炭酸カルシウムの間の相互効果を確認しており、これは得られた非晶質複合ナノクラスター中の水分含有量を最大化するのに有益である。 この材料は室温での簡単なワンポットプロセスで合成されるため、大規模かつコスト効率の高い生産が可能になります。 重要なのは、この高い含水量が、ガドリニウムベースのナノクラスターの透明な MRI コントラストの強化に寄与することです。 低毒性、部分的腎クリアランス、および大量生産の容易な可能性と組み合わせることで、私たちの研究により、ACC 複合材料の生物医学的可能性をさらに特定することが可能になり、それが次世代のより効率的な診断薬につながる可能性があると期待しています。将来の非晶質ナノクラスター。

無水塩化カルシウム、無水炭酸ナトリウム、およびエチルアルコールは、Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd (Shanghai) から購入しました。 塩化ガドリニウム六水和物 (GdCl3・6H2O、99.95%) は Yutai QingDa Fine Chemical Co., Ltd. (山東省、中国) から購入しました。 ポリ(アクリル酸) (PAA、Mw ≈ 1800) は Aldrich から購入しました。 すべての試薬は、さらに精製することなく、受け取ったままの状態で使用しました。 市販の Gd-DTPA は、中国の広東康順製薬グループによって製造されました (仕様: 20 mL)。

無添加非晶質炭酸カルシウム (ACC) を合成する一般的な手順では、10 mL の Na2CO3 水溶液 (0.1 mol・L-1、10 mL) を塩化カルシウム (0.1 mol・L-1、10 mL) 水溶液に注ぎます。 15 秒間激しく磁気撹拌しながら。 20 mLのエタノールを加えた後の水性懸濁液を直ちに850×gで2分間遠心分離し、その後沈殿をエタノールで洗浄し、5000×gで5分間遠心分離を2回行った。

ACNCを合成するための典型的な手順では、無水塩化カルシウム（CaCl2、0.1 mol・L−1）、塩化ガドリニウム六水和物（GdCl3、0.02 mol・L−1）、およびPAA（0.45 g）を磁気を利用して10 mLのDIWに溶解しました。撹拌。 無水炭酸ナトリウム (Na2CO3、0.1 mol・L-1、10 mL) を上記の溶液に、激しく磁気撹拌しながら 1 分間注ぎました。 エタノール２０ｍＬを加えて反応を停止させた。 混合物を直ちに 850 × g で 2 分間遠心分離し、沈殿を DIW で再懸濁し、5000 × g で 5 分間遠心分離を 2 回行いました。 リットルスケールの合成では、反応体積を 50 倍にスケールアップし、強力な機械的撹拌下で進行させました。

ＰＡＡにより安定化されたＡＣＣ（ＡＣＣ−ＰＡＡ）の合成では、ガドリニウム塩を添加せずに０．４５ｇのＰＡＡを合成プロセスに使用し、生成物をエタノールで洗浄した。 ACC-Gd の調製では、合成プロセスに PAA が存在せず、無水 CaCl2 (0.1 mol・L-1) と GdCl3 (0.02 mol・L-1) が 10 mL DIW 中で混合されました。 次に、得られたＡＣＣ－Ｇｄをエタノールで洗浄した。

非晶質炭酸ガドリニウム (AGC) および AGC-PAA を合成する一般的な手順では、Na2CO3 (0.1 mol・L-1、10 mL) を 10 mL の GdCl3 水溶液 (0.067 mol・L-1、mol[GdCl3]) に注ぎました。 mol[Na2CO3] = 2:3)を激しく磁気撹拌しながら15秒間撹拌し、次いで20 mLのエタノールを水性懸濁液に注いだ。 直ちに850×gで2分間遠心分離した後、沈殿をエタノールで洗浄し、5000×gで5分間遠心分離を2回行った。 さらに、ＧｄＣｌ ３ 水溶液中の０．４５ｇのＰＡＡの存在下で、同じ手順でＡＧＣ−ＰＡＡを調製した。

透過型電子顕微鏡 (TEM) は、H7700 (日立、日本) で加速電圧 100 KV で実行されました。 低温透過型電子顕微鏡 (cryo-TEM) は、Tecnai F20 透過型低温電子顕微鏡で実行されました。 高角度環状暗視野走査型 TEM (HAADF-STEM)、エネルギー分散型分光計 (EDS)、および EDS マッピングは、電界放射型高分解能透過電子顕微鏡 (FEI、Talos F200X) で実行されました。 粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）パターンは、回転陽極Ｘ線回折計（ＳｍａｒｔＬａｂ（商標）９ｋＷ）で実施した。 X 線光電子分光法 (XPS) は、光電子分光計 (ESCALAB、250Xi、Thermo Fisher、USA) で実行されました。 13C 核磁気共鳴 (NMR) は、400 MHz WB 固体核磁気共鳴分光計 (Bruker AVANCE III 400 WB) で実行されました。 FT-IRスペクトルは、Thermo Nicolet 8700 FT-IR分光計を使用して室温で記録しました。 ラマンスペクトルは、Horiba LabRAM 高分解能 (HR) Evolution ラマン分光計を使用して記録されました。 顕微鏡の光源はダイオードレーザー (780 nm) に移されました。 スペクトルは 3 × 100 秒間スキャンされました 44,45。 熱重量分析 (TGA)、示差走査熱量計 (DSC)、およびフーリエ変換赤外分光法 (TG-FTIR) と組み合わせた熱重量分析は、TGA 熱分析装置 (NETZSCH STA) で窒素流下で 10 K min-1 の加熱速度で記録されました。 449F3）。 磁気調査は、超伝導量子界面デバイス (SQUID) 磁力計 (Quantum Design SQUID-VSM) で実行されました。 ICP-AES は Optima 7300 DV 機器で実行されました。 ＵＶ－可視スペクトルは、島津ＵＶ－２６００分光光度計を用いて室温で測定した。

小角 X 線散乱 (SAXS) 分析は、SAXSpoint 2.0 (Anton Paar) で実行されました。 SAXS によって決定されたサイズ分布関数は、数によって重み付けされた均一な球の前提条件を備えた GIFT (一般化間接フーリエ変換) ソフトウェアを使用して評価されました。 これは次の式46を使用して計算されます。

カルシウム K 端 (4.0381 keV) での X 線吸収分光法 (XAS) 測定は、エネルギー 2 GeV、電流 300 mA で動作するイタリアの Elettra シンクロトロンで実施されました。 サンプルはメノウ乳鉢で粉砕され、グラフェン粉末で希釈され、薄いペレットに圧縮されました。 ACNC、ACC-Gd、および ACC 標準を含む各サンプルについて、グラフェン粉末で最適に希釈した後の最適なサンプル厚さ約 300 μm および最適なカルシウム濃度を調製しました。 X 線吸収近端構造 (XANES) および拡張 X 線吸収微細構造 (EXAFS) のサンプルごとに 3 回のフルスキャンを、FMB-OXFORD 電離箱検出器を使用して透過モードで、プレモードで 5 eV ステップで収集しました。 -エッジ領域 (3738.43 ～ 4028.53 eV)、エッジ領域 (4061.51 ～ 4061.71 eV) で 0.2 eV、ポストエッジ領域 (4061.71 ～ 4589.30 eV) では k = 13 まで 2.6 eV まで徐々に増加します。エネルギー校正とグリッチ除去は、Athena ソフトウェア パッケージの組み込み機能を使用して実行されました47。 カルシウム (Ca – O) の周りの最初の配位シェルは、方解石の結晶学的データに基づいて Ca – O の単一散乱経路を生成することによってフィッティングされました。 単一散乱経路の解析は、3 ～ 9.1 Å のフーリエ変換された k2 重み付けデータの R 空間で 1.3 ～ 2.53 Å で行われました。 ここで使用される k 範囲にわたる EXAFS データ フィッティングに関連する標準誤差は、第 1 シェル配位数について 15%、半径方向距離について 0.03 Å、およびデバイ ウォーラー係数について 15% です。

独立したデータ ポイントは、XAFS によって決定できる情報量の基本的な制限を定義するスターンの規則によって決定されました。 スターンの法則によれば、フィッティングに使用されるパラメーターの数 (Npar) は、2∆k∆R/π + 2 として定義される独立 (Nind) パラメーターの数よりも厳密に小さくなければなりません。ここで、∆k と ∆R はフィッティングされた値です。 k 空間と R 空間の範囲はそれぞれ 48,49 です。 Nind < Npar の場合、データセットはモデルの複雑さのレベルによって決定されないため、モデルを調整環境の証明として使用することはできません。 この場合、ACC 標準、ACC-Gd、および ACNC サンプルでは Nind = 7.5、ACC-PAA では Nind = 8.16、Npar = 4 となり、Nind > Npar となります。 実験データの最適な適合をもたらす多成分モデルは合理的であると考えられ、したがってカルシウム配位環境を特徴付ける可能性の高い表現と考えることができます。 線形結合は、XANES および近 EXAFS 領域 (エッジジャンプ前の 30 Å-1 から後の 80 Å-1 まで) で実行されました。 サンプル ACC-Gd、ACNC、PAA-Gd/Ca を標準サンプル ACC-PAA および PAA-Ca と比較しました。

AUC 測定は、Nanolytics (https://www.nanolytics-instruments.de/) が開発した吸光光学系と高度なレイリー干渉光学系を使用して、改良型 Optima XL-A (Beckman Coulter、パロアルト、カリフォルニア州、米国) で実行されました。干渉_光学_アイダ)。 すべての実験には、サファイア窓を備えた光路長 12 mm のダブルセクター チタン センターピース (Nanolytics、ポツダム、ドイツ) を使用しました。 ACNC サンプルの測定では、元の ACNC サンプルを UNIVERSAL 320 Hettich 遠心分離機 (Hettich、Tuttlingen、Germany) で 9,000 rpm (6000 × g の遠心力に相当) で 20 分間事前に沈殿させました。 前処理した ACNC 溶液 360 μL をサンプルセクターで使用し、1:175 に希釈した (0.154 M NaCl で) 反応前 PAA-Ca/Gd 溶液 (PAA、塩化カルシウム、塩化ガドリニウムを含む水性混合物) 360 μL をサンプルセクターで使用しました。参照セクター。 参照としての PAA サンプル測定では、10 mg の PAA (1800 Da) を 1 mL の 0.154 M NaCl 溶液に溶解しました。 すべてのサンプルは 20 °C、最大 290,000 × g の遠心力に相当する 60,000 rpm で調査されました。

沈降速度データは Sedfit と UltraScanIII で評価されました。 Sedfit (Schuck、PP SEDFIT バージョン 16.1c. http://analyticalultracentrifugation.com/download.htm) では、ls-g*(s) および連続 c(s,ff0) モデルが使用されました。 最小二乗 g*(s) モデル 50 を使用した沈降係数分布 g(s) の計算では、信頼水準 (F 比) 0.683 および解像度 100 グリッドを使用してデータを Tikhonov-Phillips 正則化でフィッティングしました。ポイント。 c(s,ff0) 解析 52 による沈降粒子密度 51 の決定では、信頼水準 (F 比) 0.683 および s 単位で 100 グリッド点および 10 ～ 20 グリッドの解像度を使用して、データを最大エントロピー正則化でフィッティングしました。 f/f0 のポイント。 2D c(s,ff0) 分布は、MathWorks の MATLAB ソフトウェア バージョン R2017b (64 ビット) を使用してプロットされました。 2D 分布からのサンプル密度の計算には、Quy Khac Ong によって開発された MATLAB マスク スクリプトが使用されました (Institute of Materials, École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Station 12, 1015 Lausanne, Switzerland。電子メール: quy.ong @epfl.ch)。 異方性の特性評価には、UltraScanIII (Demeler, B. UltraScan バージョン 4.0、リリース 2783。分析超遠心実験用の包括的なデータ分析ソフトウェア パッケージ。レスブリッジ大学、化学および生化学学部。http://www.ultrascan3.aucsolutions)。 com/download.php) は、2 次元スペクトル解析 (2DSA)53 の実行に使用されました。 2DSA モンテカルロ (MC) 解析は、スーパーコンピューターで 50 回反復して実行されました。

高分子の形状、柔軟性、溶媒和（水、塩イオン、その他の溶媒分子による）の程度を定義する関数は、ペリンの並進摩擦関数 P です（次の式を参照）。 この水の結合度は溶質の水和δと呼ばれ、無水溶質 1 グラムあたりの結合溶媒のグラム数として定義されます 54。

ここで、f/f0 は摩擦比 (同じ無水質量と密度 f0 の等価な球状分子の並進摩擦係数 f に対する観察された並進摩擦係数 f の無次元比)、\(\bar{v}\) は部分溶質の比容積 (cm3/g)、\({\bar{v}}_{s}\) は水和比容積 (無水溶質の単位質量あたりの溶質と関連溶媒が占める体積)、および\({\bar{v}}_{{{{{{\rm{H2O}}}}}}}\) = 水の比容積は次のように与えられます。

すべての過剰な摩擦が水和によるもので、溶質が球である場合、P は 155 となり、水和は次のように計算できます。

したがって、誘導結合プラズマ原子発光分光法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）、ＴＧ分析、および体積カールフィッシャー滴定測定の結果に従って、ＣａＣＯ３１モル当たりの水子のモルを計算した。 滴定測定は、カールフィッシャー水分滴定装置（Ｖ１０Ｓ、体積ＫＦ滴定装置、メトラー・トレド）で実施した。 水和含量は吸熱ピークから 300 °C までの重量損失に割り当てられ、Ca2+ および Gd3+ イオンの含量は ICP-AES によって測定されました。 したがって、ACC 中の水と Ca2+ イオンのモル比は、以前の報告に従って計算できます 20、56、57。

ガドリニウムイオンの漏洩の検出は、以前に報告された方法を使用して実行されました29,30。 ACNC は、生理食塩水、ヒト血清、および 10 mmol/L の追加のリン酸濃度を補充したヒト血清を含む一連の模擬生理学的環境に分散されました。 ACNC は最終濃度 1 mmol (Gd)/L で分散されました。 ACNC の透析は、透析バッグ (MWCO 1000 Da) を使用して 37 °C で 7 日間実施されました。 さまざまな時点で収集された透析液中のガドリニウムの濃度は、Arsenazo III 媒介発色アッセイと ICP-AES の両方によって測定されました。 発色アッセイでは、採取した透析液にクロロ酢酸・水酸化ナトリウム緩衝液（pH 2.8）に溶解したArsenazo III（0.05 mM）を混合し、658 nmの吸収を検出した。 生理食塩水および GdCl3 溶液をそれぞれ陰性および陽性対照として使用しました。

ACNC、Gd-DTPA、および PAA-Ca/Gd サンプルは新たに調製されました。 t = 0 で、各サンプル (2.5 mM Gd) と ZnCl2 水溶液 (250 mM、20 μL) を 2 mL リン酸緩衝液中で混合しました。 次に、混合溶液１ｍＬをクロマトボトルに入れて測定した。 測定は、0.5 T NMI20-Analyst NMR 分析およびイメージング システムの下、37 °C で実行されました。 TR/TE = 100/5.6 ミリ秒。 縦緩和時間はさまざまな時点で測定されました28。 t = 0 での緩和率 (R1(0) と表記) は、式 R1 = (1/T1) によって計算されました。 R1(t)/R1(0) の比を監視することによって 2 日間のトランスメタル化を評価する目的で、他の時点での緩和速度はすべてそれぞれ計算され、対応する R1(t) として記録されました。

1 mLのACNC水溶液（5 mM Gd）を1 mLのDTPA溶液（5 mM）に添加し、均一な溶液を測定のために採取した。 市販の Gd-DTPA と比較して、Gd-DTPA 溶液の濃度は ACNC 溶液と同じ 5 mM Gd でした。 測定と計算は金属転移研究と一致しました。

１ｍＬのＡＣＮＣ水溶液（１ｍｇ（Ｇｄ）／ｍＬ）を透析バッグ（ＭＷＣＯ：１０００ＫＤ）に導入した。 次に、バッグを異なる pH の 50 mL PBS または酢酸緩衝液に入れ、37 ℃、50 rpm で振盪しながらインキュベートしました。 分析のために各時間間隔で周囲の PBS または酢酸塩溶液をすべて収集し、新しい 50 mL の PBS または酢酸塩緩衝液と交換しました。 分解により生成した遊離金属イオンが PBS 緩衝液中のリン酸イオンと沈殿するという干渉の可能性を防ぐために、1 mL の新たに調製したクロロアゾチン酸 (HNO3/HCl = 3:1) を、収集した周囲の PBS または酢酸溶液に添加しました。 、混合溶液が強酸性環境 (pH < 3.0) になります。 最終的に、周囲の溶液中の Gd イオンの濃度は ICP-AES によって測定されました。

ヒト腎尿細管上皮 (HK-2) 細胞とヒト不死角化細胞 (HaCaT) 細胞株をダルベッコ改変イーグル培地で培養しました。 細胞生存率は標準的な MTT 法によって実行されました。 簡単に説明すると、細胞を 96 ウェル プレートのウェルあたり約 1 × 104 細胞の密度でプレーティングし、12 時間インキュベートしました。 次に、ACNC を含む DMEM 培地を添加し、細胞をさまざまな濃度の ACNC に 24 時間および 48 時間曝露しました。 次に、10μLのMTT溶液(PBS中5mg/mL)を各ウェルに添加し、37℃でさらに4時間インキュベートした。 培地を除去した後、150μLのDMSOを加えて各ウェル内に形成されたホルマザン結晶を溶解し、Microplate Reader (BioTek Instruments, USA)を使用して溶液の光学密度を570 nmで測定した。 HK-2 細胞は、ミトコンドリア膜電位 (MMP) アッセイ、TdT 媒介 dUTP ニックエンド標識 (TUNEL) アッセイ、および 5-エチニル-2'-デオキシウリジン (EdU) アッセイに使用されました。 J 凝集体 (JC-1) を使用したミトコンドリア膜電位アッセイ キット (Beyotime、上海、中国)、ワンステップ TUNEL アポトーシス アッセイ キット (Beyotime、上海、中国)、および Alexa Fluor 555 を使用した EdU 細胞増殖キット (Beyotime、上海) 、中国）が採用されました。

実験用の血液は、安徽医科大学第一附属病院の輸血部門の医療専門家がボランティアから専門的に採取した。 血液研究は、中国科学技術大学および安徽医科大学の倫理委員会によって承認されたプロトコールに従って実施されました（ライセンス番号：20170267、20170268）。

特定病原体フリー (SPF) BALB/c マウス (雄、6 週齢)、ニュージーランドウサギ (雄、2 kg)、およびビーグル犬 (雄、6 kg) を安徽医科大学から購入しました。 動物実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に従って実施されました。 in vivo 適合性研究と in vivo MRI 研究は、安徽医科大学の施設内動物管理使用委員会 (IACUC) (LLSC20170299、LLSC20170300) および中国科学技術大学第一附属病院 (2021-) によって承認されたプロトコルに基づいて行われました。 N(A)-041)。

ACNC生理食塩水を、マウスに5 mg Gd/体重kgの用量で（尾静脈経由）、ビーグル犬に（後肢静脈経由）9 mg Gd/体重kgの用量で静脈内注射した。 血液指数および生化学指数を評価するために、マウスを静脈内注射後それぞれ 3 日間および 3 週間麻酔により屠殺しました。 ビーグル犬の血液を後肢静脈経由で 2 週間ごとに採取しました。 血液サンプルは、抗凝固剤採血管と分離ゲルチューブによって収集されました。 血液指数と生化学指数の検査は、それぞれ Sysmex XE2100 と Vitros 5600 で実行されました。

模擬ボーラス注射研究のために、ACNC 生理食塩水を 20 匹のマウス (雄、20 g) に 3 mg Gd/kg 体重 (0.5 mg Gd/mL、120 μL) で急速手動注射により静脈内注射しました。 これらのマウスをランダムに 4 つのグループに分け、静脈内注射からそれぞれ 1、7、15、30 日後に各グループのマウスからさまざまな臓器を切除しました。 尿サンプルは、ラットに 5 mg Gd/kg 体重で ACNC を静脈内注射してから 12 時間後に収集し、続いて 25 °C で透析しました。 24 時間後、さらなる特性評価のために透析バッグ内の透析液 (MWCO = 1000 Da) を収集しました。

5 mL マイクロチューブ内の勾配濃度で生理食塩水に分散した ACNC と Gd-DTPA を、NiSO4 溶液に浸漬した支持体上に置きました。 ガドリニウムの濃度はICP-AESにより測定した。 MR T1 マップは、ヘッド コイルを備えた 3.0 テスラ MR スキャナー (Trio Tim、Siemens) で反転回復シーケンスを使用して取得されました。 イメージングパラメータは次のとおりです: 繰り返し時間 (TR) = 4000 ミリ秒、エコー時間 (TE) = 14 ミリ秒、反転時間 (TI) 25 ～ 3500 ミリ秒 (TI には 25、50、75、100、150、200、250 が含まれます) 、300、350、400、500、600、800、1000、1500、2000、2500、3000、3500 ms)、視野 (FOV) = 220 × 144 mm2。 縦緩和率（ｒ１）は、ガドリニウムイオン０．０５から０．４ｍＭの濃度勾配を用いて以前に報告された式に従って次のように計算された。 緩和時間の逆数 (1/T1, s-1) がガドリニウムの濃度に対してプロットされ、プロットの傾きが薬剤の緩和能 (mM-1 · s-1) でした 58,59。 低磁場 MR スキャナ システムでの測定は、Suzhou Niumag Analytical Instrument Corporation が提供する 0.5 T LF-NMR 装置を 32 °C で使用して実行されました。

完全な静脈麻酔後、動物を適切なサイズのさまざまな支持体に固定しました。 次に、生理食塩水に分散させたACNC、または生理食塩水で希釈したGd-DTPAを静脈内注射した。 ラットに、留置針を使用して尾静脈から2.5 mg Gd/kgの用量を注射した。 ウサギおよびビーグル犬へのボーラス注射は、機械式高圧注射器 (Optistar LE、Mallinckrodt、USA) により前肢静脈から 3 mg Gd/kg の用量で行われました。 FLASH 3D シーケンスを使用して血管造影データを収集しました。 ラットのMR血管造影の詳細なパラメータは次のとおりです: 膝コイルを使用しました。 TR = 3.95 ミリ秒、TE = 1.9 ミリ秒、FOV: 210 × 280 mm2。 取得時間 (TA) は 24.62 秒でした。 フリップアングル（FA）は20でした。収集マトリ​​ックスは288p * 512でした。収集数と平均数は両方とも1でした。ウサギのMR血管造影の詳細なパラメータは次のとおりでした。局所頭頸部コイルを使用しました。 TR = 3.6 ミリ秒、TE = 1.65 ミリ秒、FOV: 210 × 280 mm2。 取得時間 (TA) は 23.4 秒でした。 フリップアングル（FA）は18でした。収集マトリ​​ックスは288p * 512でした。収集数と平均数は両方とも1でした。ビーグル犬のMR血管造影の詳細なパラメータは次のとおりでした：局所頭頸部コイル、脊椎コイル、高周波ボディ送信コイルを使用しました。 TR = 3.19 ミリ秒、TE = 1.28 ミリ秒、FOV: 240 × 320 mm2。 取得時間 (TA) は 20.74 秒でした。 フリップ角（FA）は 16 でした。取得マトリックスは 288p * 512 でした。取得数と平均数は両方とも 1 でした。画像は最初に Siemens Syngo MR ワークステーションによって処理されました。

信号ノイズ比 (SNR) は、2 つの個別の関心領域 (ROI) に基づいて単一の画像 (κ) で計算されました。 対象の血管 (ROIvessel) 内の 1 つは、Gd-DTPA グループと ACNC グループの両方の同じスライス内の同じ ROI にシグナルを配置することによって測定され、血管 (Svessel) の平均シグナル強度として記録されました。 画像の背景 (ROIbackground) の 1 つは、アーティファクトのない均質な領域に位置し、背景信号 (Sbackground) として定義されました 34。 SNR は、Svessel と Sbackground の間の比に対応し、式 1 を使用して計算されました。 (5):

ウサギでは下行大動脈、大動脈弓、上行大動脈の 3 つの ROI が選択され、ビーグル犬では腕頭動脈幹動脈、左鎖骨下動脈、左総頚動脈、嗅動脈右枝の 4 つの領域がそれぞれ測定されました。

すべてのデータは平均±SDとして表されました。 2つのグループ間の比較の統計分析には両側スチューデントのt検定を使用し、複数のグループ間の比較の統計分析には一元配置分散分析を使用しました。 P < 0.05 の値は統計的な差異とみなされます (*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001)。 統計的有意性は、SPSS 統計 17 を使用して決定されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

著者らは、この研究で生成されたデータが論文および補足情報で提供されるか、要求に応じて対応する著者から入手できることを宣言します。

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この研究は、中国国家自然科学財団（SHYへの助成金51732011およびU1932213、YLへの助成金22122502および51972090、LDへの51702309; HQWへの助成金81801831）、中国国家重点研究開発プログラム（助成金2021YFA0715700および2018）によって支援されました。 YFE0202201) SHY、中央大学基礎研究基金（YJX は WK9110000062、LD は WK2060190056）、安徽省大学シナジーイノベーションプログラム（助成金 GXXT-2019-028）、安徽省科学技術重点プロジェクト SHY へ（201903a05020003） ) SHY、安徽省自然科学財団 (2008085J06 から YL; 1708085ME114 から YJX)、中国ポスドク科学財団 (2015M570540) から LD、合肥物理科学技術センター開発財団メジャー/革新プログラム (2016FXZY005) ) YL へ 著者は、科学大学の Mei Sun、Yan-Wei Ding、Cheng-Min Wang、Yu-Song Wang、Guan-ying Gao、Han-Bao Chong、Yu-Feng Meng、Yang-Yi Liu に感謝します。中国の技術と中国の技術、蘇州ニウマグ分析機器株式会社のハオ・ディン、合肥理工大学の宋永宏、呉文秀、安徽医科大学の銭海盛、第一提携の何陳、李張、王慧安徽医科大学病院、アモイ大学の Kun Liu、コーネル大学の Duo An、およびアントンパール中国の Ye-Ping Li にこの原稿の有益な支援をしていただきました。また、エレットラ シンクロトロンの XAFS ビームラインの Luca Olivi、Giuliana Aquilanti、Simone Pollastri には協力していただきました。彼らの助けのために。 DG はハノーバー ライプニッツ大学の教授です。 JA は SFB 1214 (ドイツ研究財団 DFG が資金提供する共同研究センター、プロジェクト A02) の枠組み内で資金提供を受けています。 HC は、AUC 装置について SFB 1214 の粒子分析センターに感謝します。

Liang Dong、Yun-Jun Xu、Cong Sui などの著者も同様に貢献しました。

安徽省生体模倣材料化学研究所化学科 合肥科学技術大学国立総合科学センターエネルギー研究所ナノ材料化学部門ナノ材料化学部門生体模倣材料研究室中国、合肥、230026、中国

リャン・ドン、コン・スイ、ヤン・チャオ、リー・ボー・マオ、フアイリン・ガオ、ジャオ・パン、シューホン・ユー

中国科学院癌病院 (浙江癌病院)、基礎医学・癌研究所 (IBMC)、中国科学院、杭州、浙江省、310022、中国

梁東＆趙潘

安徽省先端触媒材料反応工学重点実験室、合肥理工大学化学化学工学部、合肥市、230009、中国

Liang Dong、Ya-Dong Wu、Xu Yan、Fei Li、Yang Lu

中国科学技術大学第一附属病院、安徽省病院放射線科、合肥、230001、中国

ユン・ジュン・シュウ

ライプニッツ大学ハノーバー無機化学研究所、カリン通り 9、30167、ハノーバー、ドイツ

デニス・ゲバウアー

コンスタンツ大学化学部物理化学 10、コンスタンツ、D-78457、ドイツ

ローズ・ローゼンバーグ & ヘルムート・ケルフェン

科学者 - X 線分析センター、エンパ - スイス連邦材料科学研究所、Lerchenfeldstrasse 5、9014、ザンクト ガレン、スイス

ジョナサン・アバロ

230022 中国、合肥市、安徽医科大学第一附属病院輸血部

ウェン・ホイチン

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SHY と YL がアイデアを考案し、実験を設計し、研究を監督し、LD、CS、YL、YZ、LBM、DG、HC、RR、YDW、FL が合成実験と解析を実行しました。 EXAFSの測定・解析にはDG、JA、HC、LDが取り組みました。 LD、YZ、HLG、ZP、HQW、XY、FLは生体適合性評価を行いました。 LD、YJX、YDW、YL、HLG、ZP、XY、FL、CSは動物実験に取り組み、LD、YJX、YL、FL、CSはMRIの性能を調査、LD、YJX、CS、DG、YL、HC 、SHY が論文を執筆し、著者全員が結果について議論し、原稿にコメントしました。

Yang Lu、Helmut Cölfen、または Shu-Hong Yu との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Peng Huang と他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Dong、L.、Xu、YJ.、Sui、C. 他。 MRI 造影剤としての高度に水和した常磁性非晶質炭酸カルシウム ナノクラスター。 Nat Commun 13、5088 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-32615-3

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受信日: 2021 年 6 月 6 日

受理日: 2022 年 8 月 8 日

公開日: 2022 年 8 月 29 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32615-3

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