イオンペアクロマトグラフィー

Mar 13, 2023

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荷電分析物のクロマトグラフィーは、一般的に使用される逆相カラムでは効果的に保持されず、デッドボリュームで溶出するため、多くの場合困難です。 極性または水性の固定相を含むカラムでは、過剰な保持によりピークの形状が悪化する場合があります。 逆に帯電したイオンを分離するために帯電した固定相を使用するイオン交換カラムは高価であり、狭い範囲の分析物に適しており、分離効率が限られています。 イオンペアクロマトグラフィー (IPC) は、極性またはイオン種のクロマトグラフィーに適した代替手段です。

イオンペアクロマトグラフィーとは何ですか?

イオンペア逆相クロマトグラフィーは他のタイプのイオンクロマトグラフィーとどう違うのですか?

- 保持機構

- 定着率に影響を与える要因

- イオンペア効果の役割

- 環境分析

- 医薬品および食品の分析

- 生物学的分析

- 金属分析

結論

IPC はイオンクロマトグラフィーの一種で、電荷を持たない逆相または「中性」固定相を使用して、カラム上で親水性または帯電した分析物を分離するために使用されます。 これには、移動相に添加されるイオン対試薬との相互作用を通じて、荷電分析物の極性を変更することが含まれます。 これらの試薬分子は、静電結合を形成できる検体イオンとは反対の電荷を持っています。 分析物と試薬イオンの間で形成されるペアは、C18 または C8 カラムで分離できる中性の疎水性部分のように動作します。 IPC は、無機イオンだけでなく極性有機酸、塩基、両性イオンの分離にも使用されます。

イオンペアリング試薬は、イオンペアリング添加剤またはヘテロンとしても知られています。 これらの分子は極性の頭部基と疎水性の炭化水素鎖を持っているため、石鹸に似ています (図 1)。 したがって、この技術は 1973 年に Göran Schill によって導入されたとき「ソープ クロマトグラフィー」と呼ばれていました 1,2。試薬イオンが固定相と相互作用してサンプル中に存在するイオンの保持を調節するため、イオン相互作用クロマトグラフィーとも呼ばれます。 。

イオンクロマトグラフィー (IC) は広くイオンの分離を指し、イオン交換、イオン排除、イオンペアリングという 3 つの異なる機構が含まれます。 分析物イオンと固定相上の逆に帯電した部位における溶離液イオンの間の競合相互作用によって分離が起こる場合 (図 2)、このタイプのクロマトグラフィーはイオン交換クロマトグラフィー (IEX) と呼ばれます。

未解離、部分解離、および完全に解離した分析物の混合物は、帯電固定相も使用するイオン排除クロマトグラフィー (IEC) によって分離できます (図 3)。 移動相は固定相の表面および細孔内に蓄積し、「閉塞相」の形成につながります。 中性分析物は吸蔵相に強く保持され、最後にカラムから溶出します。 吸着移動相との相互作用がわずかに少ない部分的に解離した分析物は、より早く溶出します。 完全に解離し帯電した分析物は、固定相である「ドナン膜」の同様に帯電したイオンによって反発され、最初にカラムの空隙容積内にまとめて溶出します。

イオンペア逆相クロマトグラフィーは、移動相にイオンペア試薬を添加することにより、非極性「逆相」カラムで実行されます。 たとえば、トリフルオロ酢酸は正に荷電したペプチドとのペアリングに使用され、トリアルキルアミンはカルボン酸塩やオリゴヌクレオチドなどのアニオンとのイオンペアリングに使用されます。

移動相イオンクロマトグラフィー (MPIC) は、IPC による小さな無機イオンの分離と、その後の抑制された導電率測定による検出の文脈でよく使用される用語です。 この手法は、局所的な電荷を持つ分子の分析に適しています。

数マイクロリットルのサンプル溶液が逆相カラムに注入されます。 イオンペアリング試薬を含む移動相がカラムを流れるとき、分析物イオンは逆に帯電した試薬イオンと相互作用し、非極性固定相上で分離できる中性錯体を形成します。 分析物の分離は、イオンペアリング試薬、有機修飾剤、および移動相に添加される塩によって制御されます。

紫外 (UV) および蛍光分光法は、IPC で最も一般的に使用される検出手法です。 質量分析法 (MS) や誘導結合プラズマ質量分析法 (ICP-MS)3 などの他の技術の使用も報告されています。 導電率測定は、IC による無機イオンの検出方法として確立されていますが、IPC ではあまり使用されていません。4

IPC で観察される分離のメカニズムを説明するために、さまざまなモデルが提案されています。5 分配モデルとも呼ばれるイオンペアリングモデルでは、分析対象イオンとイオンペアリング試薬イオンの間の相互作用が移動相で起こると考えられています。 検体イオンは対イオンとともに、疎水性固定相に吸着できる非極性部分を形成します。 続いて、移動相中の有機修飾剤の濃度を増加させることにより、イオンペア複合体が溶出されます (図 5)。

イオン交換モデルは吸着モデルとも呼ばれ、固定相上のイオン対試薬分子の親油性アルキル鎖の吸着を伴います。 吸着された分子の自由極性頭部基は、逆に帯電した分析物イオンに対する疑似イオン交換体として機能します (図 6)。

静電モデルとも呼ばれるイオン相互作用モデルでは、カラムがイオン対形成剤を含む移動相で平衡になったときに電気二重層が形成されると考えられています。 これらの部分の非極性炭化水素鎖はカラムに結合します。 極性頭部基は電荷の固定層を形成し、移動相中のイオン対試薬の対イオンは逆に帯電した層を形成します。 分析対象イオンは、固定電荷に対する静電引力を受け、二重層を貫通することができます。 検体分子と「帯電」層の間のクーロン相互作用により、固定相表面の電荷が明らかに減少します。 その結果、イオン対剤の分子が固定相の表面に吸着され、電荷が回復されます。 まとめると、これは 2 つの反対の電荷 (検体とイオン対剤の電荷) が固定相に吸着すると考えることができます。

図 7: IPC 分離のイオン相互作用モデル。分析対象イオン、イオンペアリング試薬イオン、固定相間の動的相互作用を示しています。 A) イオンペアリング試薬は固定相に結合します。 B) 検体イオンが二重層を透過します。 C) 分析対象イオンは極性頭部基に結合します。 D) 新しいイオン対試薬分子が固定相に結合します。

IPC では、目的の分離を達成するためにいくつかのパラメータを変更できます。 分析物の保持に影響を与える変数のいくつかを考えてみましょう。

電解質を溶媒に添加すると、電解質は構成イオンに解離し、溶媒分子に囲まれます。 しかし、溶媒の極性が低下すると、イオンの溶媒和が減少し、静電引力によりイオン間の相互作用が増加します。 イオンのサイズが大きくなると、電荷密度が減少し、溶媒和が減少し、逆に帯電したイオンとの相互作用が大きくなります。 イオンの電荷が大きいほど、逆に帯電したイオン間のクーロン引力も強くなります。

イオン対試薬は長いアルキル鎖またはアリール基を持ち、電荷密度の高い小さなイオンほど溶媒和されません。 その結果、それらは逆に帯電した分析物イオンを引きつけて対にすることができます。 さらに、イオン対試薬が非極性固定相に吸着すると、その溶媒和はさらに減少します。 これにより、分析物分子と「緊密な」または「密接な」イオンペアを形成することができます。 これらのイオンペアには、2 つのイオンの間に溶媒分子がありません。 分析対象物と試薬イオンの電荷が大きいほど、それらの間の結合は強くなります。

イオンペアリング試薬の選択は、おそらく IPC を使用する際の最も重要なパラメータです。 試薬の種類、その濃度、移動相および検出器との適合性はすべて、分析物の効果的な分離において重要な役割を果たします。 調査中のサンプル用のイオンペア試薬を選択するときは、次の考慮事項に留意する必要があります。

イオンペアリングクロマトグラフィーには、IEX や順相クロマトグラフィーなどの他の技術に比べて一定の利点がありますが、限界もあります (表 1)。 この分離方法を選択する前に、これらの長所と短所を慎重に検討する必要があります。

表 1: IPC の長所と限界。

強み

制限事項

他の技術では分離が難しい極性、非極性、イオン性化合物の混合物の分析は、適切なイオンペアリング試薬を選択し、その濃度を調整することで実現できます。

イオンペアリング試薬が固定相の表面に吸着するには長い平衡時間が必要です

IPC は、ほとんどのラボで一般的に入手可能な C18 または C8 カラムで実行できます。

移動相組成の変更によりカラムの平衡時間が長くなる可能性があるため、IPC ではグラジエント分析が困難になる場合があります

同じカラムを使用してカチオンとアニオンの両方を分離できます

イオンペアリング試薬は、UV または蛍光検出が実行される波長を吸収してはなりません。 移動相に光吸収試薬が存在すると、イオンペアリング試薬を含む移動相と比較して検体の吸光度が低いため、ゴーストピークやネガティブピークが発生する可能性があります。

イオンペアリング試薬は、保持、ピーク形状、分解能の向上に役立ちます

一般的に使用されるイオンペアリング剤は揮発性が限られており、質量分析計との互換性が限られています。 TFA を修飾剤として使用すると、質量分析計でシグナル抑制が発生します。

イオンペアリング試薬の存在下では、実行時間と検出限界を短縮できます。

IPC 試薬を使用する場合は、専用カラムを使用する必要がある場合があります

IPC は、環境サンプル、医薬品、食品から生体サンプルや金属に至るまで、幅広い分析対象物の分析に適用されています。

親水性相互作用クロマトグラフィー (HILIC) や IEX などのいくつかのモードのクロマトグラフィー、およびイオン交換相や極性相などのさまざまなタイプの固定相が、荷電分子と分極性分子の分離に使用されています。 それでも、IPC はそのシンプルさとカスタマイズ性により、分析に使用され続けています。 イオンペアリング試薬の選択、その濃度、有機修飾剤、移動相添加剤などのパラメーターを最適化して、目的の分離を実現できます。

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