中国昆明におけるロサ・キネンシスの黒点病の分離・同定に関する研究

Oct 24, 2023

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8299 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

中国、昆明の南熱帯園で行われたバラの病気の調査により、黒点病が露地栽培のバラで最も一般的かつ重篤な病気で、発生率が90％以上であることが判明した。 この研究では、南熱帯庭園で採れた黒点病に感染しやすい 5 品種のバラの葉サンプルに対して、組織分離により真菌の分離を実施しました。 最初に 18 株の真菌が入手され、そのうちの 7 株がコッホの法則による検証の結果、バラの健康な葉に黒点症状を引き起こすことが最終的に特定されました。 コロニーと胞子の形態を観察し、分子生物学と複数の遺伝子を組み合わせて系統樹を構築することにより、2 つの病原性真菌、すなわち Alternaria alternata と Gnomoniopsis rosae を同定しました。 G. rosae は、この研究で分離および同定された最初のバラ黒斑病の病原性真菌でした。 この研究の結果は、昆明におけるバラの黒点病のさらなる研究と制御のための参考資料を提供することができます。

バラは数ある花の中でも最も有名で人気のある花のひとつで、中国はバラの花の発祥の地です。12世紀以前にシルクロードからペルシャ、セイロンなどに伝わり、バラの花として海外でも高く評価され愛されてきました。文化交流のための固有種1． 中国では、バラはいくつかの都市によって市の花として定義されており、都市景観に広く使用されていますが、植えて生育する過程で病気や害虫に弱く、その結果、生育不良、葉落ち、しおれ、さらには枯れてしまうことがあります。バラの病気は観賞に影響を与えるだけでなく、バ​​ラ自体の経済的価値も低下させます。2. バラの病気は 10 種報告されており、そのうち 7 種は真菌性です：うどんこ病、黒点病、べと病、灰色かび病、葉かび病、さび病、中でも黒点病は最も深刻で世界的な病気となっており、ほとんどのバラ栽培地域、特に露地栽培で一般的に発生し、発生率が非常に高い3。

バラの黒点病は、1815 年にスウェーデンで初めて報告されました4。現在、バラの黒点病は世界各地で発生しており、バラ生産において早急に解決すべき重要な問題となっています。 これまでの研究によると、バラの黒点病を引き起こす病原菌は 2 種類あります。1 つは Marssonina rosae で、もう 1 つは Alternaria sp.5 です。アッバスは、バラの黒点病を引き起こす病原菌は主に Alternaria sp.5 であることをパキスタンで初めて報告しました。 .6. 2013 年に Xu ら。 彼らは、西安、咸陽、宝鶏、渭南で典型的な黒点症状を示すバラの葉のサンプル15枚を収集し、単離精製後、黒点病に感染している病原性真菌をMarssonina rosaeと同定した7。 フェンら。 運城学院の庭で黒点症状を呈するバラの病葉を収集し、形態学的同定と分子系統解析を行った結果、バラの黒点病を引き起こす病原菌はAlternaria alternataであることが判明した8。

この研究の目的は、形態学的同定と病原性判定と組み合わせた分子生物学系統解析によって、中国の昆明にある南熱帯園のバラ 5 品種の黒点病の葉から分離された 2 つの病原性真菌を正確に同定することであり、バラの黒点病原菌の生物学的特性に関するその後の研究、または将来のバラの黒点病の効果的な制御のための理論的基礎。

2021年11月、私たちは中国昆明市の南熱帯園の4つのエリア（約5エーカーの面積をカバー）でバラの病気の調査を行いました。 これらの黒点病の症状は似ています。 明らかな黒点病の症状のあるバラの 5 品種 (「レッド レオナルド ダ ヴィンチ」、「スイート プリティ」、「ハッピー ケアフリー」、「ベニータ」、「ホームラン」) の葉サンプル 50 枚を収集しました (品種ごとに 10 個のサンプルを収集しました)。 ）、研究室に持ち帰って冷蔵庫で4℃で保管しました。 バラの 5 品種が黒点病に重度に感染しており、各品種の発生率は 80% 以上でした。

培地：ポテトデキストロース寒天培地（PDA）：ジャガイモ 200 g、無水グルコース 20 g、寒天 17 ～ 20 g、蒸留水 1 L。

試薬: Sangon Biotech Rapid Fungi Genomic DNA Isolation Kit、PCR プライマー (ITS1/ITS4、NS1/NS4、LSU1Fd/LR5、EF1-728F/EF1-986R、T1/T2)、2× Taq PCR Mix、核酸色素、DNAマーカー DL2000、5xTAEなど

使用機器：光学顕微鏡、オートクレーブ、恒温金属槽、低温遠心分離機、PCR装置、ゲルイメージング電気泳動装置、恒温恒湿インキュベーターなど

組織分離 9 は、明らかな黒点症状のあるバラの葉サンプルを分離するために使用されました。 病気のバラの葉をすすいだ後、超クリーンベンチ内で滅菌メスを使用して病気の葉と健康な葉の接合部の組織を3×3 mmに切り取り、これらの組織を1％次亜塩素酸ナトリウム溶液に入れます（5秒）。 75% アルコール (30 秒)、最後に滅菌水で 3 回洗浄し、滅菌濾紙上に置き、乾燥させた後、鉗子で PDA 培地に接種します。 3 つの組織ブロックを各ペトリ皿に接種し、蓋に番号と日付をマークし、密封して 25 ℃の恒温恒湿インキュベーター内でインキュベートしました。 各実験には 3 つのグループの並行対照を使用しました。 2日後、コロニーが増殖し、直ちに精製し、2〜3回精製して純粋培養物を得た後、それをPDA試験管の傾斜面に接種し、25℃の恒温インキュベーターに入れてコロニーが培地でいっぱいになるのを待ち、 4℃の冷蔵庫で冷蔵保存してください。

ex vivo 葉接種: 5 種類のバラ (「レッド レオナルド ダ ヴィンチ」、「スイート プリティ」、「ハッピー ケアフリー」、「ベニータ」、「ホームラン」) の健康な葉を中国昆明の南熱帯園から収集しました。 2022 年 5 月 健康なバラの葉を水道水ですすぎ、75% アルコールで 30 秒間消毒し、滅菌水で 3 回洗い流し、滅菌濾紙上に置いて乾燥させました。 真菌ブロックを直径 5 mm の滅菌パンチでコロニーの端に打ち抜き、脇に置きました。 2 層の滅菌ろ紙を直径 9 cm のペトリ皿に置き、滅菌水で湿らせ、滅菌した健康なバラの葉をろ紙上に置き、複合葉を 1 枚ずつ各ペトリ皿に置き、その上に低侵襲の傷を付けました。滅菌メスで小さな葉を接種し、その後 5 mm の菌糸体ブロックを傷に接種し、接種部位を滅菌した湿った綿球で覆いました。3 枚の小さな葉を各複葉で処理し、対照接種 (5 mm の菌糸体ブロックを接種)直径 mm の PDA ブロック）をセットアップし、各実験グループを 3 回繰り返しました。 接種後、ペトリ皿をラップで密封し、室温に置き、葉に症状が現れたら、すぐに記録し写真撮影した。

生葉への接種：葉の大きさが比較的安定している対応する品種のバラの挿し木を選択し、健康なバラの葉の表面をまず75％アルコールに浸した脱脂綿球で消毒し、次に葉を滅菌水に浸して3回拭きました。 2回接種し、接種する部分を滅菌接種針で刺し、次に5 mmの菌糸体ブロックを傷に接種し、接種部位を滅菌した湿った綿球で覆った。各バラの品種について3回の反復を処理した。複葉ごとに葉を処理し、対照接種（直径5 mmのPDAブロックで接種）を設定し、接種した複葉全体をビニール袋で覆い、毎日観察および記録し、水を噴霧して接種葉を湿らせた。 症状が現れたらすぐに記録し、写真を撮りました。

コッホの法則に従って、病気の葉と健康なバラの葉の接合部にあるバラの葉の組織を再度分離および精製するために採取し、再分離した株を元の株と比較し、元の株と同じ同定方法を使用して試験した。それらが元の病原性真菌と一致するかどうか。

バラ黒斑病原菌をPDA培地に接種し、25℃で7〜10日間培養した。 コロニーの形態、色、成長速度を観察し、記録しました。 接種針で菌糸体を採取してスライドを作成し、菌糸体、色、胞子形成構造、分生子などの形態学的特徴を光学顕微鏡で観察し、写真撮影して記録した。

病原性真菌を PDA 培地に接種し、7 日間インキュベートし、菌糸体がディッシュ全体に成長した後、試験菌株の全ゲノム DNA を抽出し、真菌ユニバーサル プライマー ITS(ITS1/ITS4) を使用して PCR 増幅を実行しました。 、SSU(NS1/NS4)、LSU(LSU1Fd/LR5)、TEF(EF1-728F/EF1-986R)、TUB(T1/T2) (表 1)。 反応系を表２に示す。 PCR 増幅反応手順を表 3 に示します。増幅された PCR 産物は 1% アガロースゲルでの電気泳動によって検出され、単一の透明なバンドがある場合は、配列決定のために Biotech Bioengineering Ltd. に送られました。 配列決定結果は、BLASTツールを使用してNCBIウェブサイト上の配列比較によって分析され、Muhammad Farhan10およびNing Jiang11を参照して、GenBankで相同性の高い既知の配列をモデル株としてオンラインで検索しました。 rDNAITS、SSU、LSU、TEF1、およびLSUの複数の遺伝子の組み合わせの配列に基づいて、MEGA11.0ソフトウェアを使用した最尤法を使用して系統樹を構築し、バラの黒点病原菌株とモデルとの血縁関係を分析しました。株を抽出し、最終的にその分類学的ステータスを決定します12、13。

植物材料の収集を含む、植物 (栽培または野生) に関する実験研究および野外研究は、関連する制度的、国内的および国際的なガイドラインおよび法律に準拠する必要があります。 私たちは、IUCNの絶滅危惧種の研究に関する政策声明および絶滅のおそれのある野生動植物の種の取引に関する条約を厳格に遵守します。 すべての標本は昆明南熱帯園の許可を得て収集されました。植物に関する IUCN ポリシーへの準拠を確認しています。

中国昆明市の南熱帯園で行われたバラの病気の調査により、黒斑病が最も蔓延し深刻で、発生率は90％以上に達していることが判明した。 黒点病菌は主にバラの葉に感染します（図1）。 発病初期は葉の表側に褐色の斑点が現れ、徐々に斑点が円形または不規則に拡大し、紫褐色から暗褐色になります。 病気の後期になると、斑点の周囲の組織が黄色に変わり、植物の下葉と真ん中の葉がすべて落ち、上の数枚の葉だけが残ります。

バラの黒斑点の野外症状と病葉（この画像はYanjie Li撮影）。

5 つの異なるバラ種の発病した葉のサンプルから 18 の真菌株が分離および精製されました (「レッド レオナルド ダ ヴィンチ」は 4 分離され、「スイート プリティ」は 5 分離され、「ハッピー ケアフリー」は 4 分離され、「ベニータ」は 2 分離されました) DNA 抽出、ITS 増幅と配列決定、NCBI での予備比較の結果、これらの真菌は主に Gnomoniopsis、Alternaria、Nigrospora 属に属し、「ホームラン」が分離されました 3)。 すべての真菌は実験室で ex vivo の健康なバラの葉に別々に接種され、一部の葉は 5 日前後で症状を示し始めました。その中には、Alternaria 株と Gnomoniopsis sp. 株を接種した健康なバラの葉もありました。 は最も明白な症状を示しましたが（表 4）、他の株は接種 7 日後に ex vivo の葉にほとんど症状を示さなかったのです。 生体外で健康なバラの葉に黒点病を引き起こす、Gnomoniopsis 属の TMR3-3 (「Sweet Pretty」から分離) と Alternaria 属の KLWY1-6-2 (「Happy Carefree」から分離) を代表株として選択しました。生葉に接種すると、7日前後で葉に黒点症状が現れた(表5)。 接種したバラの葉の病原性部分を再度分離し、元の株と同じ同定方法を使用した。 得られた最終株はすべて元の株に対応する可能性があるため、TMR1-1-2、HSDFQ3-7-1、HSDFQ2-4、DDBX2-13、KLWY1-6-2; XP1～6、TMR3～3はいずれもバラの黒点病に寄生する病原性真菌です。

5株：TMR1-1-2（「Sweet Pretty」から分離）、HSDFQ3-7-1、HSDFQ2-4（「Red Leonardo da Vinci」から分離）、DDBX2-13（「Benita」から分離）、KLWY1- Alternaria sp. 6-2 (「Happy Carefree」から分離) PDA 培地上で 25 °C で 7 ～ 10 日間インキュベートしました。 形態と色は一致しており、最初のコロニーは表面が灰白色で、その後徐々に灰褐色、裏面が黒褐色となり、約10日間でシャーレ全体にコロニーが増殖しました（図2A、B）。 。 DDBX2-13 を代表株として選択し、顕微鏡で観察したところ、分生子は鎖状、卵形、逆洋ナシ形または逆托形、茶色がかっており、縦隔壁が 0 ～ 3 個、横隔壁が 2 ～ 5 個あり、分離部分でわずかに狭くなっていました。 、円柱状の短いくちばしを持つ個体、胞子サイズは（12.1〜41.0）μm×（7.0〜19.0）μmでした。 分生子柄は直立または湾曲しており、枝があり、セスピト状であった。 菌糸体は活発で絨毯状、無色、隔壁がなく、直径約 (2.1 ～ 3.0) μm でした (図 2C、D)。 これらの病原性真菌は、当初、形態学的特徴に基づいて Alternaria 属として同定されました 14。 Gnomoniopsis 属の 2 つの菌株：XP1-6 (「ホームラン」から分離)、TMR3-3 (「Sweet Pretty」から分離) を PDA 培地で 25 ℃の一定温度で培養し、形態学的特徴も調べた。一貫性のある。 それらはリング状に成長し、最初の菌糸体は純白で、その後、菌糸体の内側のリングは徐々に灰緑色になり、中央のリングは薄緑色になり、最も外側のリングは灰白色になります。 その後、コロニー全体は灰緑色になり、気菌糸はまばらになり、最終的にコロニー全体がリング状になり、基部が灰緑色から黒色の分生子柄を多数産生し、分生子が溢れると黄色がかっています。 (図3A、B); 分生子は紡錘形で隔壁がなく透明で、表面は滑らかで、液滴、液滴、胞子（7.5〜10×3.5〜4）μmがあります。 胞子生成細胞は瓶の柄または棍棒状で、分生子柄から変性し、透明で滑らかで、先端は底部よりも細い（図3C、D）。

Alternaria alternata のコロニーと胞子の形態。 A. alternata は PDA 培地上で 7 日間生育します ((A) 前、(B) 後)。 解剖顕微鏡下での子嚢果皮を7日間培養した(C、D)。

Gnomoniopsis rosae のコロニーと胞子の形態 G. rosae は PDA 培地上で 7 日間増殖します ((A) 前、(B) 後)。 解剖顕微鏡下で子嚢果皮を7日間培養した(C,D)。

Alternaria 属の 5 つの株 (TMR1-1-2、HSDFQ3-7-1、HSDFQ2-4、DDBX2-13、KLWY1-6-2) のゲノム DNA を、真菌ユニバーサル プライマー ITS1/ITS4、NS1 を使用した PCR によって増幅しました。 /NS4、LSU1Fd/LR5; 一方、Gnomoniopsis属の2株(XP1-6、TMR3-3)は、ITS1/ITS4、EF1-728F/EF1-986RおよびT1/T2のプライマーを使用して増幅されました。 1% アガロースゲルでの電気泳動検出後に単一の明確なバンドが得られました。 上記のPCR増幅産物は配列決定のために北京ダイナサイエンス生物技術有限公司昆明支店に送られ、配列決定結果はNCBIウェブサイトにアップロードされて登録番号を取得しました（図4、5）。 MEGA11.0 ソフトウェアを使用して最尤法を使用して系統樹を構築したところ、DDBX2-13、KLWY1-6-2、HSDFQ3-7-1、TMR1-1-2、HSDFQ2-4 の株がクラスター化されていることがわかりました。 Alternaria alternata の 1 つの枝に (図 4)。 XP1-6、TMR3-3 は Gnomoniopsis rosae とともに 1 つの枝にクラスター化されています (図 5)。 最後に、形態学的特徴の同定と組み合わせて、Alternaria alternata および Gnomoniopsis rosae がバラの黒点病の病原菌として同定されました。

Alternaria alternata とその近縁種の LSU、SSU、ITS データセットを組み合わせた最尤系統樹 (LSU、SSU、ITS 遺伝子のアクセッション番号を括弧内にこの順序で示します)。

Gnomoniopsis rosae およびその近縁種の TEF1、TUB、および ITS を組み合わせたデータセットからの最尤系統樹 (TEF1、TUB、および ITS 遺伝子のアクセッション番号はこの順序で括弧内に示されています)。

この研究では、バラの5品種(「レッドレオナルド・ダ・ヴィンチ」、「スイートプリティ」、「ハッピーケアフリー」、「ベニータ」、「ホームラン」)の黒斑のある葉のサンプルから、形態学的に異なる18株の菌株を分離した。形態学的同定、コッホの法則と組み合わせた分子生物学的同定を通じて、合計 7 つの黒点病原性株が得られました。 これら 7 つの病原菌株の菌糸体、胞子生成構造、分生子およびその他の構造を 40 倍の顕微鏡で形態学的に観察しました。 病原性 DNA は、真菌ユニバーサル プライマー ITS、SSU、LSU、TEF1、TUB を使用した PCR 増幅によって抽出および配列決定され、NCBI 配列比較と GenBank のパターン株の複数遺伝子関連のダウンロードによって系統樹が構築され、最後に TMR1 -1-2、HSDFQ3-7-1、HSDFQ2-4、DDBX2-13、および KLWY1-6-2 は Alternaria alternata として特定されました。 XP1-6 および TMR3-3 は Gnomoniopsis rosae として同定されました。

バラ黒点病に関するこれまでの研究結果のほとんどは、病原菌はマルシナ・ロサエであることが示されており、我々の研究結果とは異なっていました。 Peihong Fang et al. バラ黒斑病の病原性真菌は PDA プレート上で Alternaria sp であることを発見しました。コロニーは灰白色で始まり、徐々に黒または茶色になり、分生子は隔壁、卵形、洋ナシ形または棒形でした 15。この研究における A. alternata の形態。 この研究で分離・同定されたもう 1 つの病原性真菌である Gnomoniopsis rosae は、バラの黒点病に関しては報告されていません。この理由は、異なる地域で栽培されている異なるバラの品種の地理的位置や気候条件が異なるためと考えられます。黒点病原菌の種類の違いもあります。

G. rosae は、Ning Jiang らによって中国の新記録種として初めて報告されました 16。彼は、バラが G. rosae の新しい宿主記録であることも報告しました。 しかし、それは私たちの研究とは異なり、G. rosae は Ning Jiang らによってバラの健康な枝から分離されました。 そして、Gnomoniopsis 属の種の同定と特徴付けに関するその後の研究のための内部寄生菌として使用されました。 この研究では、2 つのバラ品種 (「スイート プリティ」と「ホームラン」) の黒点のある葉のサンプルから G. rosae が分離されました。これらはコッホの法則によって検証され、形態学および分子生物学によって同定され、最終的にバラ品種として同定されました。バラ黒点病の病原菌 Gnomoniopsis spp. の真菌の宿主は主に甲殻科およびバラ科の植物であり、Gnomoniopsis は 25 種報告されており、そのうち 10 種が中国に分布し、9 種が報告されている。甲殻科の植物について報告されており、バラ科の R. chinensis についても報告されています 11. Gnomoniopsis spp. 内のいくつかの種が重要な植物病原体として報告されています 17,18. Gnomoniopsis daii は葉の病原体として報告されています中国栗の斑点と固形腐敗19,20、Gnomoniopsis fragariae はイチゴの斑点病を引き起こした21、Gnomoniopsis chinensis は河北省で栗の重度の潰瘍病を引き起こし、地元で深刻な経済的損失を引き起こした22、Gnomoniopsis clavulata は北米でシラカシとアカヤドリギの斑点病を引き起こした23 , Gnomoniopsis smithogilvyi は、ヨーロッパ、オーストラリア、インドでヨーロッパ栗の深刻な固形腐敗を引き起こしました24,25,26。

本研究では、バラの黒点病の新たな病原菌である子嚢菌門、ディアポータレス目、グノモニア科、グノモニオプシス属に属するグノモニオプシス・ロサエを、バラの黒点病として同定した。 これは、R. chinensis の黒点病を引き起こす G. rosae の最初の報告です。 同定結果は、バラの黒点病のさらなる研究と管理のための参考根拠を提供できます（補足情報）。

この研究結果を裏付けるデータは、この記事の補足資料で公開されています。

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この研究は、教育省の中国南西部山脈における重要な実験室森林資源の保全と利用によって支援されました。 雲南省の大学、西南林業大学の森林災害警報と制御の主要研究室。 中国国家重点研究開発プログラム (2018YFD1000407) によって支援されました。 雲南省教育局科学研究財団 (補助金番号 2023Y0749)。

雲南省機能性花卉資源と産業化工学研究センター、西南景観建築工学研究センター（国家林業草原局）、雲南省南東南アジア共同研究開発センター経済森林フル産業チェーン森林災害警報・制御主要研究所雲南省の大学、南西林業大学、昆明、650224、雲南、中国

Yanjie Li、Meiying Pu、Yusi Cui、Ju Gu、Xi Chen、Louqin Wang、Chao Wang

雲南農業大学景観園芸学部、昆明、650201、中国

呉紅志

Kunming Yang Chinese Rose Gardening Co., Ltd、昆明、650503、雲南省、中国

ヤン・ユヨン

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著者全員が原稿をレビューしました。

王朝への対応。

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転載と許可

Li、Y.、Pu、M.、Cui、Y. 他中国昆明におけるロサ・キネンシスの黒点病の分離と同定に関する研究。 Sci Rep 13、8299 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35295-1

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受信日: 2022 年 12 月 21 日

受理日: 2023 年 5 月 16 日

公開日: 2023 年 5 月 23 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35295-1

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