4の生物変換

Mar 08, 2023

Scientific Reports volume 13、記事番号: 1835 (2023) この記事を引用

659 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

家畜の繁殖活動や医薬品廃棄物により、廃水中にステロイド ホルモンやエストロゲンがかなり蓄積されます。 ここで、エストロゲンは、水生動物の性的発達を妨げ、人間に有毒な影響を与える、発癌促進剤および内分泌かく乱物質として作用します。 環境細菌はエストロゲンの分解に重要な役割を果たします。 環切断ジオキシゲナーゼ (RCD) などの酵素の幅広い貯蔵庫はステロイド核を分解し、A、B、または D ステロイド環のメタ切断を触媒します。 この研究では、4 つのエクストラジオール環切断ジオキシゲナーゼ (ERCD)、PP28735、PP26077、PP00124 および PP00193 が海洋スフィンゴモナス属 Novosphingobium sp. から単離されました。 PP1Yと特徴的です。 酵素の速度論的パラメーターは、さまざまな合成カテコール基質で決定されました。 次に、カテコールエストロゲンの生物変換を評価しました。 PP00124 は、E2 の発がん性ヒドロキシル化誘導体である 4-ヒドロキシエストラジオール (4-OHE2) の分解に有効な触媒であることが示されました。 4-OHE2 の完全な切断は、可溶型および全組換え大腸菌細胞の両方で PP00124 を使用して得られました。 LC-MS/MS 分析により、A 環のメタ切断によるセミアルデヒド生成物の生成が確認されました。 私たちの知る限りでは、PP00124 は、メタ切断を介して 4-OHE2 を直接分解できることが最初に特徴付けられた酵素です。 さらに、組換え全細胞を使用した完全な 4-OHE2 生分解は、バイオレメディエーション目的での利点を強調しました。

エストロゲンは、女性の生殖器系の調節と二次性徴の発達に関与する主要なステロイドホルモンです1。 すべての脊椎動物において、エストロン (E1) と 17β-エストラジオール (E2) が主要な調節ホルモンです (図 1a)。 E2 は、哺乳動物のメスで最大 500 pg/mL の血漿濃度を示す主要なエストロゲン活性を有し、ヒトの生殖器系発達の主要なエフェクターの 1 つです 2。 エストロゲンは、水酸化またはスルホン化された後、尿中に排泄されます3。 いくつかの研究は、これらの化合物、特にそのヒドロキシル化形態（4-ヒドロキシエストラジオール 4-OHE2 および 2-ヒドロキシエストラジオール 2-OHE2、図 1a）が内分泌かく乱物質および発がん物質として作用する可能性があることを示しています 4,5。

主要なエストロゲン様化合物と E2 分解経路。 (a) エストロン (E1)、17 β-エストラジオール (E2)、エストラテトラエノール (E0)、4-ヒドロキシエストラジオール (4-OHE2) および 2-ヒドロキシエストラジオール (2-OHE2) の構造と分子量 (MW)。 ステロイドリングADは赤色で示されています。 (b) 主な E2 分解経路。 i) E2 A 環の水酸化 19. ｉｉ）Ｅ２ Ｂ環ヒドロキシル化１９． iii) E2 D 環脱水 20. iv) E2 の E1 への脱水素化、およびその後の D 環の脱水素化および切断 21。 iv.i) E2 の E1 への脱水素化、およびその後の A 環の脱水素化および切断 18。 NB 経路 iv.i) は、本質的に経路 i) と同じ A 環切断反応に従います。 切断基質は経路 iv.i) では 4-OHE1、経路 i) では 4-OHE2 であるため、ここでは分離されます。

廃水や水生生態系におけるこれらの有害な化合物の存在は、主に家畜の繁殖活動における家畜の排泄物によるものであり6、最近では大きな環境問題となっています7、8、9。 これらの分子は実際、哺乳類、魚類、両生類の個体群における発育、生殖能力、生殖機能障害の原因となっているようです。 実際、エストロゲンに汚染された生態系では、インターセックスの魚の個体群が世界中で観察されています[5、6、10、11、12およびその参考文献]。

環境への関心の高まりにより、最近、エストロゲン、特に E2 の分解に関与する生物学的プロセス、および新しい潜在的な分解物質と分解酵素活性の両方の同定に対する関心が高まっています 13。 芳香族 A 環構造の破壊によるエストロゲン核の分解は、これらの化合物と DNA の相互作用を妨げ、その活性とその結果としての発がん性効果を中和する鍵となります 13,14。 微生物の分解プロセスは、環境中のエストロゲンの運命と輸送を決定する上で重要な役割を果たします。 代謝または共代謝モードでステロイド核を完全に破壊するための特異的な触媒機構を持つ細菌は、エストロゲンから CO2 への変換において中心的な役割を果たします 13,14,15。

エストロゲンの生分解は、さまざまな異化経路を介して、さまざまなオキシゲナーゼおよびデヒドロゲナーゼによって触媒されます。 環切断ジオキシゲナーゼ (RCD) は、エストロゲン分解において基本的な役割を果たし、水酸化されたエストロゲン A 環の酸化的切断を触媒します。 これらの微生物酵素ファミリーは、単環式および多環式芳香族炭化水素および複雑な芳香族化合物の分解経路でも中心的な役割を果たします（たとえば、環境汚染物質や環境中のリグニン誘導体の切断を可能にします）。 オキシゲナーゼは通常、補因子を使用し、共試薬として酸素、電子供与体として NADH または鉄を使用して酸化還元反応を実行する酵素複合体です16。 細菌における芳香族化合物の分解経路は、一般に上部経路と下部経路として示される 2 つの段階に分けることができます17。 上部経路の反応には、隣接する 2 つの炭素原子に 1 つまたは 2 つのヒドロキシル基を付加することによる芳香環の活性化が含まれ、多くの場合モノオキシゲナーゼによって触媒されます。 次に、ジオキシゲナーゼがカテコール化合物の酸化的環開裂を操作します。 ジオキシゲナーゼは一般に、ジオール環内切断ジオキシゲナーゼ（IRCD）とジオール環外切断ジオキシゲナーゼ（ERCD）に分類されます18。 IRCD 酵素は 2 つのヒドロキシル基間の結合を切断し、ジカルボン酸化合物 (cis-ムコン酸の誘導体) を生成します。 ERCD は、カテコール誘導体への O2 酸素の取り込みを触媒し、ジオールに隣接する結合の 1 つを切断し、アルデヒド基またはケトン基を含むアルファ-ヒドロキシ酸 (シス-ムコン酸セミアルデヒドの誘導体) を生成します。 これらの酵素は、ジヒドロキシル化芳香族分子を、あらゆる種類の生物によって容易に代謝されるトリカルボン酸回路 (TCA) の中間体に変換します。 Yu ら 14 によれば、エストロゲンの微生物分解経路は 4 つの主要な経路に分かれており、図 1b にまとめられています。 これらの分解経路は、最初の分解ステップに関与するステロイド環に応じてグループ化することもできます。 i) A 環: C4 で E2 を直接水酸化して 4-OHE2 を形成し、その後、いわゆる 4,5-seco を介して 4-OHE2 が切断されます。 ERCD によって実行される経路 19。 ii) B 環: 飽和 B 環の水酸化とそれに続く切断から始まる E2 分解 19。 iii) D 環: D 環脱水による直接 E2 分解 20。 iv) D 環: この経路では、最初のステップは常に E2 から E1 への脱水素化を伴います。 続いて、i) で概説したのと同様に、E1 は脱水素化されて D 環上で切断される (経路 iv)21,22 か、またはヒドロキシル化されて 4-OHE1 になり、4,5-seco 経路を介して (経路 iv.i) A 環上で切断される可能性があります (経路 iv.i)。 4-OHE219,23の場合。

近年、さまざまな研究で、E2 を分解できる新しい微生物酵素の単離が記載されています。そのほとんどは、iv.i) 経路で説明されているように、最初の E2 の E1 への脱水素化に関与し、その後ヒドロキシル化されて切断されます。 24、25、26、27、28。

生物探査活動は、エストロゲンの生分解に関与する生化学的経路を解明し、これらの触媒のバイオテクノロジー応用のための酵素ツールボックスを拡大する上で最も重要です。

ノボスフィンゴビウム属 PP1Y は、他のエストロゲン分解細菌と同様、スフィンゴモナダレス目の海洋性アルファプロテオバクテリアのメンバーであり、ポッツオーリ (イタリア) の高度に汚染された水域から分離されました。 ディーゼルやガソリンなどの非極性相に溶解した芳香族分子の複雑な混合物上で増殖する可能性を含む、この株のいくつかの表現型特性は、独特の代謝多様性と複雑な多環芳香族炭化水素 (PAH) の生分解を触媒する能力を示唆しています。 29. ノボスフィンゴビウム属 PP1Y ゲノムは完全に配列決定され、注釈が付けられており 30、その分析により、モノオキシゲナーゼおよびジオキシゲナーゼをコードする 40 を超える推定 orf の存在が明らかになりました。これらは、オキシゲナーゼ活性の印象的な貯蔵庫であり、おそらくこの菌株が広範囲の微生物を分解する能力に関与していると考えられます。単環式、二環式、三環式、四環式および五環式芳香族化合物30、31。

この研究では、微生物 Novosphigobium sp. PP1Y は、カテコール エストロゲンに対して活性な ERCD を単離するための新規ソースとして使用されました。 4 つの ERCD をコードする遺伝子は大腸菌で組換え発現されました。 対応する酵素の特性が解析され、さまざまなカテコール基質の速度定数が測定されました。 次に、細胞抽出物または組換え細胞全体を使用して、カテコール エストロゲンの生物変換を評価しました。 ERCD PP00124 は、可溶型および組換え細胞全体の両方において、メタ切断を介して 4-OHE2 の完全な生物変換を触媒できることが確認され、特徴付けられました。

既知の ERCD の大部分は、いくつかのサブファミリーの存在を特徴とする異種タンパク質ファミリーに属しています 32。 各ファミリーは、特定の種類の置換カテコール（3-または 4-アルキルカテコール、3,4-ジヒドロキシフェニルアセテート、2,3-ジヒドロキシビフェニル、1,2-ジヒドロキシナフタレン、3,4-ジヒドロキシフェナントレン）の切断を最適化するために進化してきました。

PP1Y 株 30 のゲノム分析により、推定上の ERCD をコードする 7 つの orf の存在が明らかになりました (3 つは 100% 同一性の二重コピーで存在します)。 相同性モデリング分析によって裏付けられた徹底した系統学的研究により、単環式芳香族化合物および多環式芳香族化合物の代謝における 7 つの酵素の役割を仮説化することができました 30。 特に、orfs AT15671/AT31616、Mpl3065、AT15599/AT31688およびAT32663はそれぞれ、推定上の(ジ)(メチル)カテコールジオキシゲナーゼ、推定上のジヒドロキシビフェニルジオキシゲナーゼおよび2つのジヒドロキシナフタレン/ジヒドロキシフェナントレンジオキシゲナーゼをコードしているという仮説が立てられた。 本明細書では、これらの酵素をそれぞれ、ＰＰ００１９３、ＰＰ２６０７７、ＰＰ００１２４、およびＰＰ２８７３５と命名する。

D'Argenio et al.30 に記載されている相同性モデリング/ドッキング分析は、言及された ERCD の活性部位は 3 位および/または 4 位に置換基を持つカテコールをホストできるはずであるが、活性部位ポケットの寸法が徐々に増加することを示唆しました。 PP00193 < PP26077 < PP00124 < PP28735 の順で増加します。 非常に興味深いことに、PP00124 と PP28735 は、3 ～ 4 個の環を持つジヒドロキシル化多環芳香族炭化水素 (フェナントレン、アントラセン、ベンズ[a]アントラセン、クリセンなど) と 4-OHE2 をホストするのに十分な大きさの活性部位ポケットを示しました。 1,2-ジヒドロキシクリセンに似ています(補足図S1を参照)。 4-OHE2 を含む限られた基質パネルに対する 4 つの ERCD の比活性の測定により、PP1Y30 株における多環芳香族炭化水素 (PAH) の代謝におけるこれらのタンパク質の仮説上の役割が確認されました。

したがって、エストラジオールの生物変換をスクリーニングするための興味深い活性として 4 つの ERCD が選択されました。 組換え発現条件は、その構築が以前に記載されている対応する pET22b(+) ベクターで形質転換された大腸菌 BL21(DE3) 細胞で最適化されました 30。 活性酵素を得るために、さまざまな増殖温度、誘導時間、IPTG 濃度をテストすることで発現条件を最適化しました。 増殖条件を選択するために、大腸菌BL21（DE3）組換え全細胞の基質として2,3-ジヒドロキシビフェニル（2,3-DHBP）に対するERCDの触媒活性を、誘導期にわたって評価しました（補足図S2 a）。 IPTG。 補足図S2bに示すように、細胞溶解後の可溶性画分と不溶性画分のSDS-PAGE分析で強調されたように、主に不溶性画分に存在するタンパク質PP28735を除くすべての組換えERCDは可溶性画分で発現しました（補足）図S2 b)。 可溶型のタンパク質の発現レベル（補足表S1）は、PP26077、PP00124、PP00193ではそれぞれ培養液あたり120、40、100 mg/Lと推定されましたが、酵素PP28735ではわずか1〜2 mg/Lでした。

次に、ERCD を Q-Sepharose FF 樹脂での陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製しました。 Fe(NH4)2(SO4)2 を含まない緩衝液中ではすべての ERCD の顕著な不安定性が観察され、これは緩衝液中に外因性鉄が存在しない場合、活性部位の Fe(II) が容易に失われるか、Fe に酸化されることを示唆しています。 (III) したがって、酵素の不活性化につながります。 したがって、30% グリセロールおよび 0.1 mM Fe(NH4)2(SO4)2 を含む緩衝液の使用を伴う、迅速な「バッチ」クロマトグラフィーのプロトコルが設定されました。 補足図S3aに示すように、精製手順の収率は、細胞溶解物中の活性酵素の量（初期総単位）と比較した、精製された活性酵素（最終総単位）の評価に基づいて、44〜95％の範囲でした。 精製タンパク質の SDS-PAGE 分析 (補足図 S3 b) では、ERCD PP26077、PP00124、および PP00193 では総タンパク質の最大 10 ～ 20% の夾雑物の存在が明らかになりましたが、精製 PP28735 では夾雑タンパク質のより高い存在が示されました。誘導された培養物の可溶性画分中のタンパク質の初期量が低い。

すべての環切断ジオキシゲナーゼには活性部位の補因子として Fe(II) イオンが備わっており、成熟タンパク質への Fe(II) の取り込みの欠如、または Fe(III) への酸化により、完全な不活性化が引き起こされます。ジオキシゲナーゼ活性、フェレン S アッセイにより鉄含有量を測定しました。 補足表S1に報告された結果は、PP26077、PP00124、PP00193タンパク質の総Fe(II)がそれぞれ60%、100%、88%であることが判明したことを強調しました。 精製画分中のタンパク質 PP28735 の回収率は低すぎて、鉄の量を測定できませんでした。 さらに、鉄アッセイにより、PP26077 タンパク質と PP00193 タンパク質のそれぞれ 25% と 7% が鉄を含まない一方、残りの画分には Fe(III) が付与されており、酵素が不活性になっていることが推定されました。 精製された PP00124 タンパク質は発現および精製手順の終了時に 100% の Fe(II) を保持しており、したがって他の ERCD と比較してより高い酵素安定性を示していることは注目に値します。

次に、選択した 4 つのカテコール基質、2,3-DHBP、3-メチルカテコール (3MC)、4-メチルカテコール (4MC)、およびカテコー​​ル (CAT) に対する精製 ERCD の比活性 (SA) および速度論パラメーターを決定しました (「材料および方法」)。 精製された RCD の比活性は、対応するシス-ムコン酸セミアルデヒドの形成を経時的にモニタリングすることによって測定されました。 表 1 に示す結果は、タンパク質 PP28735、PP26077 および PP00124 が主に 2,3-DHBP に対して活性であり、試験した他の単芳香族基質に対して SA 値が低いことを示唆しました。 逆に、モデリング結果に基づいて予想されたように、PP00193 は CAT、3-MC、および 4-MC に対してより活性であり 30、この酵素の活性部位がより小さいことが示されました。

表 2 にまとめた 4 つの ERCD の速度論的特徴は、タンパク質 PP00124 および PP00193 がすべての基質に対して高い活性を備えていることを示し、KM 値は 30 ～ 1 μM の範囲でした。 予想通り、PP00193 は単芳香族化合物および 2,3-DHBP の変換に最適な酵素であると思われ、これらの基質に対してより高い kcat/KM 値を示しました。 逆に、タンパク質 PP28735 および PP26077 は、より大きな基質である 2,3-DHBP に対してのみ有意な活性を示しましたが、単芳香族カテコールに対しては 450 μM を超える KM 値を示しました。 実際、これらの酵素は、3-MC と比較して 80 ～ 200 倍低い 2,3-DHBP 変換の kcat/KM 値を示しました。 タンパク質 PP00124 は、試験したすべての基質に対して同等の活性を示し、2,3-DHBP に対してより高い効率を示しました。

PP1Y ERCD 株を使用したカテコール エストロゲンの生物変換をテストしました。 生物変換に使用した基質は 4-OHE2 および 2-OHE2 でした (図 1a)。 これらは E2 ヒドロキシル化に由来し、それぞれ芳香環の 3、4 位および 2、3 位に -OH 置換基を持っています。 以前に実行された分子ドッキング分析 30 から出発すると、4-OHE2 および 2-OHE2 は PP28735 および PP00124 の活性部位によりよく収容されるはずです。 したがって、これらの酵素は、選択されたカテコール エストロゲンに対してより高い親和性を示すはずです。 私たちの以前の研究で得られた予備データ 30 は、この仮説をさらに裏付けました。 この研究では、4 つの ERCD の SA が 4-OHE について決定されました (表 5 in30)。 データは、PP28735 および PP00124 タンパク質が 4-OHE2 の推定シスムコン性セミアルデヒドへの切断を触媒できるのに対し、PP00193 および PP26077 タンパク質は無視できる活性を示したことが示されました。

4-OHE2 変換に最適な酵素を選択するために、PP28735 および PP00124 タンパク質を用いて分光光度計分析による時間経過実験 (図 2) を実施しました。 100 μM 4-OHE2 の存在下、pH 7.5 で反応を行うと、298 nm で λmax を備えた反応生成物が形成されました (図 2)。 4 分 (PP00124) および 8 分 (PP28735) 分のインキュベーション時間内では、スペクトルのさらなる変化は観察されず、4-OHE2 の完全な変換が示唆されました。 切断生成物のスペクトル特性に基づいて、2 つの酵素が同じ反応を触媒するという仮説が立てられます。 ただし、カテコールのメタ開裂から得られるセミアルデヒドは、一般に、約 350 ～ 450 nm の λmax をもつ黄色の生成物として現れるのに対し、4-OHE2 からの開裂生成物は 298 nm の λmax をもつスペクトル UV 領域に吸収されることは注目に値します。 黄色の形態はセミアルデヒドのジアニオン形態を表し、一般に反応が行われた pH 7.5 で最も豊富であることはよく知られています 33。 PP28735 および PP00124 タンパク質による 4-OHE2 変換生成物の特性を確認するために、NaOH を添加して反応混合物をアルカリ化しました。 補足図S4で報告されたアルカリ性緩衝液中のスペクトル特性は、セミアルデヒドで予想される黄色の生成物（417 nmでのλmax）を強調し、したがって環切断反応を確認し、ジアニオン性黄色形態を得るにはより高いpH値が必要であることを示唆しています。

4-OHE2 酵素変換の時間経過の UV-vis スペクトル。 反応は、100μM 4-OHE2を含む1 mLの50 mM Tris/HCl pH 7.5緩衝液中でPP28735 (a)およびPP00124 (b)酵素を使用して実施した(黒い破線)。 反応は、精製酵素を添加することによって開始した。 セミアルデヒドの生成は、Cary 100 UV-VIS 分光光度計の Scanning Kinetics プログラムによって 230 ～ 500 nm の波長範囲で監視され、25 °C で 4 ～ 8 分間の吸収を記録しました (グレースケール線)。 黒い太線は、pH 7.5 (λmax 298 nm) での反応終了時のセミアルデヒドのスペクトルを表します。

また、最適な触媒を選択するために、ERCD による 4-OHE2 変換の速度論的分析も実行しました。 生成物の形成は、4-OHE2 基質の吸光度が記録されない波長である 298 nm で分光測光的に監視しました。 表 3 に報告されているように、タンパク質 PP00124 は、マイクロモル未満の KM 値で 4-OHE2 の生物変換に最適な速度論パラメーターを示しました。これにより、PP00124 を発現する大腸菌の細胞溶解物を使用した小規模生物変換プロトコルのセットアップが促進されました。触媒。

また、ERCD が 2-OHE2 を切断する能力もテストしましたが、どのタンパク質でも変換生成物は観察されず、したがって、これらの酵素の 4-OHE2 に対する選択性が示唆されました。

PP00124 タンパク質の興味深い速度論的特性に基づいて、HPLC 分析を実行して、PP00124 含有細胞抽出物による 4-OHE2 切断の速度論をさらに研究しました。

4-OHE2 の完全な変換は分光光度的に確認されました。 次いで、反応から得られた生物変換生成物をＨＰＬＣによって分析した。 図3に示す結果は、実験条件下では、4-OHE2（保持時間：12.7分およびλmax：279nm、パネル3a）のセミアルデヒド生成物（保持時間：11.4分およびλmax：305nm）への完全な変換が明らかになった。 、パネル３ｂ）が得られ、分光光度分析が確認された。 反対に、基質として 2-OHE2 を使用した場合 (保持時間: 13.4 分、λmax: 286 nm) (図 3、パネル c、d)、やはり分光光度分析によれば、反応のどの時点でも変換は観察されませんでした。 。 これらのデータは、芳香族 A 環の 3、4 位に置換基を持つ基質に対する PP00124 の高い特異性を確認しました。

触媒として組換え PP00124 を使用した 4-OHE2 および 2-OHE2 生物変換の HPLC 分析。 アッセイは、50 mM トリス/HCl 緩衝液 (pH 7.5) 中で 25 ℃、それぞれ 100 μM および 200 μM の 4-OHE2 および 2-OHE2 を用いて実行されました。 反応混合物のアリコートを、酵素の添加前に収集した。 サンプルを酸性化し、100 倍に希釈し、遠心分離し、陰性対照として HPLC で分析しました (ブランク反応としてパネル (a) および (c) に示されています)。 次に、PP00124 細胞溶解物を添加して反応を開始しました。 生成物の形成を分光測光法で15分間追跡した。 次に、サンプルを酸性化し、100 倍に希釈し、遠心分離し、HPLC パネル (b) および (d) で分析しました。 (a) 4-OHE2 ブランク反応の HPLC クロマトグラムと 4-OHE の UV-vis スペクトル。 (b) 4-OHE2 反応の HPLC クロマトグラム: セミアルデヒド反応生成物と対応する UV-vis スペクトル。 (c) 2-OHE2 ブランク反応の HPLC クロマトグラムと UV-vis スペクトル。 （ d ）2-OHE2反応のHPLCクロマトグラムおよび対応するUV-visスペクトル。 示されたすべてのクロマトグラムは 280 nm で取得されました。

変換生成物の高分解能質量分析を実行しました。 ブランク反応とエンドポイント反応のアリコートを収集し、酢酸エチルによる液液抽出に供しました。 得られた抽出物を、陰イオンモードの LC-MS/MS によって分析しました。 PP00124 触媒による 4-OHE2 の生物変換によって生成された 2 つの主要な反応生成物が検出されました。分子量 306.1839 (測定 m/z 305.1761、図 4b) および 324.1951 (測定 m/z 323.1873、図 4) の 2 つの共溶離剤種です。 .4c)、それぞれ。

4-OHE2 生物変換生成物の高分解能 MS スペクトル。 全質量 (MS1) スペクトルは陰イオン モードで取得されました。 (a) 4-OHE2 m/z スペクトル (m/z 287.1652)。 (b) 4-OHE2 メタ切断生成物の m/z スペクトル (m/z 323.1873)。 (c) 4-OHE2 環化生成物 (仮説) m/z スペクトル。 (m/z 305.1761)。

これらのデータは、基質への O2 分子の挿入を媒介する ERCD の触媒機構に基づいて予想されるように、4-OHE2 メタ開裂セミアルデヒド生成物 (理論分子量 324.1937) の存在を確認しました 34。 これは、メタ切断生成物として図４に示されている。 第 2 の反応生成物は、C4 上のヒドロキシルの C5 上のカルボニル基への自発的求核攻撃、その後の脱水によって、メタ切断生成物から生成できます (理論上の分子量 306.1831)。 これは、図 4c に環化生成物 (仮説) として示されています。 これらの化合物の仮説構造と提案された反応を図 5 に示します。

4-OHE2 は、PP00124 を使用して分解メカニズムを仮説化しました。 4-OHE2 メタ開裂セミアルデヒド生成物 (理論分子量 324.1951) の存在は、質量分析によって確認されました。 これは、基質への O2 挿入を通じて作用する ERCD の触媒機構と一致しています。 我々は、C4 上のヒドロキシルの C5 上のカルボニル基への自発的求核攻撃を伴うメタ切断生成物の環化を介して、同定された 2 番目の生成物の生成を仮定します。 この化合物の仮説構造 (理論上の分子量 306.1839) は、4-OHE2 環化生成物 (仮説) として報告されています。

PP00124 を使用した 100 μM 4-OHE2 の完全な変換が確認された後、細胞全体を生体触媒として使用して 4-OHE2 生体変換を得る可能性を評価しました。 この目的のために、PP00124を発現する大腸菌組換え細胞を使用した。

組換え発現後、細胞をアッセイして、2,3-DHBP に対する組換えタンパク質の活性を試験しました。 ０．７Ｕ２，３ＤＨＢＰ／ＯＤの比活性が測定された。 合計 3.5 単位の 2,3-DHBP (5 OD600) の PP00124 発現大腸菌細胞を 100 μM (28 mg/L) 4-OHE2 を含む最少培地中でインキュベートし、経時実験を実施しました。 この実験は、陰性対照として、空のpET22b(+)プラスミドで形質転換された大腸菌BL21(DE3)のOD600細胞10個を用いて行われた。 PP00124 細胞および大腸菌ネガティブコントロール反応の各時点で酢酸エチルで 2 回抽出し、HPLC-MS/MS で分析しました。 空のプラスミドで形質転換された大腸菌細胞を使用した場合、4-OHE2 の分解は観察されませんでした。 PP00124 発現細胞について得られた結果を図 6 に示します。精製酵素を使用して実施した反応で観察されたように、4-OHE2 (m/z 287) の急速な減少と、4-OHE2 によって生成される 2 つの化合物の経時的な形成が観察されました。 OHE2 の加水分解は明らかでした (m/z 305 および 323)。 興味深いことに、これら 2 つの化合物の反応速度論的蓄積はほぼ重ね合わせ可能であり、したがって、これら 2 つの種の間に平衡が生じていることが示唆されました。

組換えPP00124を触媒として使用した大腸菌全細胞の4-OHE2の生物変換。 P00124を発現する大腸菌組換え細胞を、最少培地中で100μMの4-OHE2とともに37℃でインキュベートした。 さまざまな時点で、上清のアリコートを収集し、酸性化しました。 酢酸エチルによる液液抽出を行った。 HPLC-MS/MS 定性定量分析を実施しました。 全質量 (MS1) スペクトルは、高分解能陰イオン モードで取得されました。 抽出されたイオンクロマトグラムのピーク面積を化合物ごとおよび時点ごとに登録しました。 4-OHE2 (m/z 287) およびその切断生成物 (m/z 305 および 323) の時間経過に伴う傾向を示します。 (a) 2 時間の時間経過による生物変換。 (b) 20 分間の生物変換の詳細。 データは、化合物の相対存在量を表す面積 (%) で報告されます。 各化合物について、登録されたより高いピーク面積を 100% 面積として設定しました。 サンプルは 3 回分析され、データは測定領域の平均として報告されました。

PP00124 発現細胞を使用して実行された生物変換速度は、精製酵素を使用して実行された生物変換速度 (上記で概説) よりも大幅に遅かった。 しかし、PP00124 kcat/KM では、5 OD600 で 3.5 ユニット 2,3-DHBP を使用して 15 分で 4-OHE2 の完全な変換が可能になりました。 注目すべきことに、私たちの知る限り、4-OHE2 全細胞の生分解の例はこれまで報告されていません。 Li らは、20 mg/L で 3 日間インキュベートした後、微生物コンソーシアムを使用して E2 が完全に分解することを示しました35。

ERCD は、エストロゲンおよびエストロゲン様化合物の生物変換における使用の可能性で注目されています。 新規酵素活性の同定と特性評価は、人間の健康に有害となる可能性があるこれらの分子を分解するために細菌細胞によって開発される生化学的経路を明らかにするために最も重要です。 さらに、ERCD は、これらの酵素によって実行される部位特異的な環切断を利用して、生合成用途にも実装することができます 36,37。 それらの基質特異性は、ファインケミカルの生合成のために微調整される可能性があります。

以前に発表されたNovosphingobium sp.のバイオプロスペクティング分析。 PP1Y ゲノムは、おそらく PP1Y 株が、この株の好ましい増殖基質であるいくつかの単環式および多環式芳香族炭化水素の同時酸化に由来するカテコールの複雑な混合物を代謝できるようにする、顕著な豊富な RCD を明らかにしました 29,30。

この研究では、以前にノボスフィンゴビウム属から単離された 4 つの ERCD の動態学的特徴付けについて説明します。 PP1Y30。 それらの基質特異性が調査され、組換え全細胞または細胞溶解物のいずれかを含むタンパク質 PP00124 を使用して、完全な 4-OHE2 生分解が得られました。

4 つの ERCD の CAT、3-MC、4-MC、および 2,3-DHBP の速度論的パラメーターを決定しました。 得られたデータは、D'Argenio et al.の酵素に対して以前に行われた相同性モデリング/ドッキング分析を確認しました。 （30およびその中の補足図S7）。 実際、タンパク質 PP00193 は単芳香族化合物の分解効率が高く、115 ～ 64 s-1 μM-1 の範囲の kcat/KM 値を示しました。 これらの値は、シュードモナス プチダ mt-2 およびバークホルデリア sp. 由来の同様の酵素について記載されている値と同等か、さらに高いようです。 LB40038,39,40。 タンパク質 PP00124 は、テストしたすべての基質に対して同等の活性を示しましたが、2,3-DHBP に対してはより高い効率を示しました。 全体として、この基質に対するタンパク質 PP00124 および PP00193 の kcat/KM 値は、他のビフェニル ジオキシゲナーゼ (Sphingomonas sp. RW1 および Burkholderia sp. LB400 由来のものなど) について記載されている値よりも高くはありませんでしたが、PP1Y 株由来のこれらのタンパク質は、いくつかの 3- および/または 4- 置換カテコールを切断する能力を持っていますが、これは文献ですでに特徴付けられている他の酵素については記載されていません 40,41。 逆に、タンパク質 PP26077 はこれらの基質に対して活性が非常に低く、予想通り、2,3-DHBP のように芳香環に垂直な置換基を 1 つ持つ分子に対してより高い親和性を持つようです。

4-OHE2 切断に関しては、PP00124 が最良の触媒となりました。 HPLC-MS/MS 分析により、15 分間の反応後の完全な基質生物変換が明らかになりました。 2-OHE2 の変換は観察されなかったため、この酵素の 2,3 置換 A 環構造に対する高い特異性が示唆されました。 ERCD の反応機構で予想されるように、3- または 4- 置換カテコール環が近位エストラジオールで切断されて、二原子 2 個の二酸素が挿入されて 2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒドが形成されることが、323.187 m/z の生成物 (287 + 36 = 323 m/z イオン)34,38。 しかし、結果は、305.176 m/z の化合物も生成したことを示しました。これは、おそらく 1 つの水分子の除去による自発的な分子内環化によって誘導されたものと考えられます。 図 5 に、環化生成物の仮説構造を示します。 2 つの生成物は同時に生成され、反応中に時間が経っても平衡状態を維持しているように見えました (図 6)。 環化生成物は、求核攻撃と脱水、および A 位での複素環の形成を介してセミアルデヒドのメタ開裂生成物から生成されるという仮説を進めることができます (図 5)。 他の研究では、培地中の窒素供与体の存在下での自発的な非生物反応による同様の複素環化合物であるピリジンストロン酸の形成が記載されています24。 したがって、環化生成物のような同様の二次生成物の生成は、以前に報告されたデータと一致します。 反応機構の完全な特性評価にはさらなる分析が必要ですが、我々のデータは、ノボスフィンゴビウム種由来の PP00124 を示唆しました。 PP1Y は 4-OHE2 生分解の効率的な生体触媒であると考えられます。 私たちの知る限り、ここではノボスフィンゴビウム属の単離と同定について説明します。 最初の ERCD の PP1Y は、メタ切断を介して 4-OHE2 を直接分解することができ、おそらく i) 4,5 seco 経路に関与します。 4-OHE2 の生分解は以前に報告され、ロドコッカス属の自然分解経路である可能性があると同定されていましたが、 ED6 および Sphingomonas sp. 栗巣らによる ED8 19、我々の知る限りでは、Novosphingobium sp. 由来の PP00124。 PP1Y は、この基質を切断することが最初に特徴付けられた ERCD です。 逆に、いくつかの最近の研究では、4-OHE1 のエストロゲン核の切断を含む、ii)、iv)、および iv.i) 分解経路 (図 1) に関与する微生物酵素の特性評価が記載されています。 ただし、これらの例では、E2 での最初の D 環の脱水素化と E1 での変換が常に最初のステップになります (図 1)24、26、27、28。

最後に、この研究では、全細胞生物変換実験により、生体触媒として天然細菌よりも組換え全細胞を使用することのいくつかの興味深い利点が強調されました。 いくつかの研究では、異なる環境株またはコンソーシアムを使用したエストロゲンの生分解が報告されています 35。 このアプローチはバイオレメディエーションの目的では非常に有益である可能性がありますが、ここでは特定の化合物の生分解を改善するために組換え株を使用する利点を強調します。 実際、PP00124 の組換え発現が誘導された大腸菌全細胞は、4-OHE2 を高効率かつ短時間で効果的に分解できました。したがって、全細胞生物変換プロトコルが、4-OHE2 を回避するための効率的なアプローチとして予見される可能性があることを示唆しています。時間とコストがかかるタンパク質精製のステップ。 さらに、野生型の環境株やコンソーシアムからはまだ代謝が不十分な、さまざまな難治性化合物の分解についても、同様のアプローチが仮説として立てられる可能性があります。

細菌培養、プラスミド精製および形質転換は、Sambrook et al.42 に従って実行されました。 タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミン (BSA) を標準として使用し、Bio-Rad プロテイン アッセイで測定しました。 変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) は標準的な技術を使用して実行され、クーマシー ブリリアント ブルー G-250 で染色されました。 4-OHE2 および 2-OHE2 標準は Cayman Chemicals から購入しました。 細菌の増殖を追跡し、OD600 と呼ばれる 600 nm での光学密度、OD/mL を測定しました。 LB リッチ培地 (Luria Bertani 培地) は、Sambrook et al.42 に記載されているように調製しました。

Sambrook et al.42 に従って、タンパク質 PP28735、PP26077、PP00124 および PP00193 をコードする orf を含むプラスミド pET22b(+) を使用して大腸菌 BL21(DE3) コンピテントセルを形質転換しました。 コロニーを、100 μg/mL アンピシリン (amp) を補充した 12.5 mL の LB 培地を含む滅菌 50 mL Falcon チューブに接種しました。 培養物を OD600 ～ 0.7 まで一定に振盪しながら 37 °C でインキュベートしました。 プレイノキュラムを 500 mL の LB/amp で 1:50 に希釈し、OD600 が 0.6 ～ 0.7 になるまで 37 °C で一定に振盪しながらインキュベートしました。 発現は、0.1 mM Fe(SO4)2(NH4)2 および 0.025 ～ 0.4 mM の IPTG を添加することによって誘導されました。 増殖は28℃または37℃でさらに2時間または4時間継続されました（補足図S2）。 次に細胞を遠心分離（5524 × g、4 °C で 15 分間）によって収集し、細胞ペレットを必要になるまで -80 °C で保存しました。 大規模発現実験から得られた細胞ペーストをまず溶解バッファー (50 mM Tris/HCl、pH 7.5、10% エタノール、30% グリセロール、5 mM DTT および 0.1 mM Fe(SO4)2(NH4)2) に懸濁しました。最終濃度 50 ～ 100 OD600 に調製し、超音波処理 (氷上で 15 インチのオンと 55 インチのオフのサイクルで 20 回) によって破砕しました。 誘導培養物の可溶性画分と不溶性画分を、22,100 × g、4 °C で 30 分間の遠心分離によって分離し、上清を収集し、0.45 μm PVDF Millipore 膜で濾過しました。

PP26077、PP00124およびPP00193タンパク質をQ-Sepharose FF陰イオン交換樹脂(Pharmacia Biotech)上でバッチ精製した。 サンプルを 4 °C で一定の​​振盪下で樹脂とともに 1 時間インキュベートし、未結合のタンパク質を遠心分離とその後の溶解バッファーでの 3 回の洗浄によって除去しました。 溶出は、0.2、0.4、0.6、および0.8 M NaClを含む溶解緩衝液中で段階的方法により実施した。 樹脂を 4 °C で一定の​​振盪下で 10 分間、各溶液で 3 回インキュベートしました。 遠心分離によって画分を収集し、窒素雰囲気下、-80℃で保存しました。 サンプルの純度は SDS-PAGE によって評価されました。 活性な組換えERCDの存在は、以下に記載するように、2,3-DHBPに対して酵素アッセイを行うことによって検出された。 さらに、過剰な鉄の酸化を防ぐために、すべての操作は一定の窒素流下で実行されました。

タンパク質 PP28735 を Q Sepharose FF カラムクロマトグラフィーによって精製しました。 タンパク質の溶出は、流速 15 mL/h で溶解バッファー中の 0 ～ 0.5 M NaCl の直線勾配によって実行されました。 活性な組換え ERCD の存在は、2,3-DHBP に対して酵素アッセイを行うことによって検出されました。 関連する画分をSDS-PAGEで分析し、プールし、窒素でパージし、使用するまで-80℃で保存しました。

総鉄含有量は、フェレン S43 (3-(2-ピリジル) -5,6-ビス [2-(5-フリルスルホン酸)] -1,2,4-トリアジン、二ナトリウム塩) との錯体形成により比色定量的に測定されました。 Fe (II) の特定のキレート剤。着色錯体の形成を引き起こし、その吸収は 593 nm (ε593nm = 34.32 mM−1 cm−1) の波長で測定されます。 Fe の総量 [Fe (II) + Fe (III)] を決定するために、ビタミン C (最終濃度 6 mM) の存在下でもアッセイを実行して、Fe (III) を Fe (II) に還元しました。 Ｆｅ（ＩＩＩ）の量は、Ｆｅの総量（ビタミンＣの存在下で測定）からＦｅ（ＩＩ）の量（ビタミンＣの非存在下で測定）を差し引くことによって計算した。 Fe (II) と Fe (III) の検量線は、既知の量 (5 ～ 20 nmol) の Fe(NH4)2(SO4)2 と FeCl3 をそれぞれ試験することによって得られました。 クロマトグラフィーのステップでは溶出バッファー中に Fe (II) と DTT が存在する必要があるため、これらの試薬を除去する必要がありました。 この目的のために、Pharmacia の PD-10 プレパックカラム (カラムサイズ: 0.8 cm × 5 cm、樹脂の総量は 9.1 mL に等しい) で低圧分子排除クロマトグラフィーを実行しました。 溶出は、５０ｍＭ ｐＨ７．５ トリス／ＨＣｌ緩衝液、１０％グリセロール、０．２Ｍ ＮａＣｌ中で室温で実施した。

ERCD の活性は、CAT、3-MC、4-MC、および 2,3-DHBP を使用して比活性 (SA) を測定することにより、25 °C で決定されました。 基質ストック溶液は、CAT、3MC、4MC の場合は水で 100 mM、2,3-DHBP の場合はジメチルホルムアルデヒド (DMF) で 100 mM に調製されました。 それらの濃度は、10 mM HCl中で分光光度法により測定されました。 サンプルは、最終濃度 1 mM の基質を含む総量 1 mL の 50 mM トリス/HCl pH 7.5 中で 25 °C でアッセイされました。 可変量の組換え細胞全体 (OD600 0.03 ～ 0.3)、細胞溶解物からの可溶性画分 (OD600 0.03 ～ 0.3)、または精製タンパク質 (1 ～ 50 μg) を添加することによって反応を開始し、対応するシス-ムコン酸セミアルデヒド生成物。 吸光度は、各基質製品の λmax で 5 秒ごとに記録されました (補足表 S2)。 得られる各生成物の量を計算するために使用されるλmaxおよび吸光係数(ε)は、補足表S2に報告されています。 酵素の 1 単位は、25 °C で 1 分あたり 1 μモルのシス-ムコン酸セミアルデヒドを放出する酵素の量として定義されました。

基質ストック溶液をエタノール中で100 mMに調製した。 それらの濃度は、4-OHE2 および 2-OHE2 のそれぞれ 276 nm および 286 nm に対応する λmax での吸光度を記録することにより、10 mM HCl 中で分光測光的に測定されました。 3-MC および 4-MC の ε (補足表 S2) をそれぞれ 4-OHE2 および 2-OHE2 に使用しました。 活性アッセイは、50 mM Tris/HCl 緩衝液 pH 7.5、25 °C 中で、さまざまな量の ERCD を含む全組換え細胞 (0.03 ～ 0.3 OD600)、細胞溶解物または精製タンパク質からの可溶性画分 (1 ～ 50 µg) を用いて実行されました。 、30 ～ 400 mU2,3-DHBP)、それぞれ 100 μM および 200 μM の 4-OHE2 および 2-OHE2 の存在下で、水性緩衝液における溶解度の限界を表します。

4-OHE2 (100 μM) および 2-OHE2 (200 μM) 変換の経時的実験は、Varian Cary 100 UV-Vis 分光光度計で実行されました。 精製した ERCD (1 ～ 50 μg) を添加することによって反応を開始し、生成物の形成を pH 7.5 で Scanning Kinetics プログラムにより 230 ～ 500 nm の波長範囲で監視しました。 4-OHE2 (λmax 285 nm) からセミアルデヒド (λmax 298 nm) への変換後、25 °C で 4 ～ 8 分間吸収スペクトルを記録しました。 4OHE2 切断の終了時に、セミアルデヒドを黄色のジアニオン型 (アルカリ性 pH での最大波長 417 nm) に変換するために、NaOH (最終濃度 100 mM) を添加し、スペクトルを記録しました。

さらに、HPLC 分析による 4-OHE2 基質およびその生成物の同定を簡略化するために、上記のように 10 分間インキュベートした後に得られたセミアルデヒドを含む反応液に 1% ギ酸を添加し、スペクトルを記録しました。 酸性pHでは、4-OHE2およびそのセミアルデヒドについて、それぞれ280および305nmのλmax値が見出された。

比活性および速度定数の決定を可能にし、pH 7.5 (反応インキュベーション時間中) および pH 12 (反応終了時) での ERCD によるセミアルデヒド生成を定量化するには、pH 7.5 での 4-OHE2 セミアルデヒド生成物のεおよびｐＨ１２は実験的に決定された。 簡単に説明すると、50 mM Tris/HCl、pH 7.5 緩衝液中の 400 mU2,3DHBP の ERCD PP00124 を使用して、さまざまなエストラジオール基質濃度 (20 μM、40 μM、60 μM、80 μM および 100 μM) の全変換を実行しました。 スペクトルは上記のように走査速度論プログラムによって記録され、吸光係数が決定されました（pH 7.5でのε298 nm = 9,1 mM-1 cm-1、pH 12でのε417 nm = 21,78 mM-1 cm-1）。最大波長。 酵素活性の 1 単位は、25 °C で 1 分あたり 1 μモルのセミアルデヒドを放出する酵素の量として定義されました。

反応速度パラメータは、1 ～ 50 μg の精製タンパク質と、基質として 0.5 μM ～ 16 mM の範囲の CAT、3-MC、4-MC および 2,3-DHBP を使用して、50 mM Tris/HCl pH 7.5 緩衝液中で得られました。 4-OHE2 は、0.5 ～ 100 μM (水の溶解度限界) の範囲の最終濃度で使用されました。 反応は、25 °C、375 nm (CAT; ε375nm = 33 mM-1 cm-1)、388 nm (3-MC; ε388nm = 13.8 mM-1 cm-1)、382 nm (4-MC) で 3 分間モニタリングされました。 MC; ε382nm = 28.1 mM−1 cm−1)、434 nm (2,3-DHBP; ε434nm = 13.2 mM−1 cm−1) および 298 nm (4-OHE2; ε298nm = 9.1 mM−1 cm−1) 。 使用した吸光係数は補足表 S2 に記載されています。 すべての速度パラメータは、GraphPad Prism 7 を使用した非線形回帰曲線によって決定されました。

4-OHE2 および 2-OHE2 の酵素変換は、PP00124 酵素を使用して実行されました。 反応は前の段落で概説したように実施した。 簡単に説明すると、アッセイは、それぞれ 100 μM および 200 μM の 4-OHE2 および 2-OHE2 の存在下、1 mL の 50 mM トリス/HCl 緩衝液 pH 7.5 中で 25 °C で実行されました。 反応混合物のアリコート（０．５ｍＬ）を酵素の添加前に収集し、最終濃度１％のギ酸を添加した。 サンプルを 100 倍に希釈し、22,100 × g で 5 分間遠心分離し、ネガティブコントロール (ブランク反応) として HPLC で分析しました。 次に、PP00124 細胞溶解物をサンプルに添加して反応を開始しました。 生成物の形成は、合計 15 分間にわたって 230 ～ 500 nm の間で分光測光的に追跡され、5 秒ごとにスペクトルを記録しました。 その後、１％ギ酸を加えて反応を停止した。 セミアルデヒドのスペクトルは酸性 pH で記録され、サンプルは 100 倍に希釈され、22,100 × g で 5 分間遠心分離され、HPLC で分析されました。

Ｃ１８ウルトラスフィアカラム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を備えたフォトダイオードアレイ検出器（Ｗａｔｅｒｓ ２９９６）を備えたＷａｔｅｒｓ １５２５バイナリポンプＨＰＬＣを使用した。 各サンプル 200 マイクロリットルを注入しました。 0.1% ギ酸水溶液 (溶媒 A) および 0.1% ギ酸メタノール溶液 (溶媒 B) から構成される移動相を使用して、流速 1 mL/min で直線勾配溶出を実行しました。 4-OHE2、2-OHE2、および対応する生成物の溶出は、以下の勾配を使用して実行されました: 10% 溶媒 B で 3 分間の定組成溶出、3 分間で 10 ～ 50% 溶媒 B、3 分間で 50 ～ 75% 溶媒 B 15 分、75 ～ 90% 溶媒 B で 1 分間、90% 溶媒 B で 1 分間定組成溶出、1 分間で 90 ～ 10% 溶媒 B、10% 溶媒 B で 3 分間定組成溶出。 溶出溶媒のスペクトルは、230 ～ 400 nm のフォトダイオード アレイ検出器で記録されました。 基質と生成物の両方がその波長での吸収を示すため、280 nm での吸光度を監視しながらクロマトグラムを作成しました。

最後に、LC-MS/MS 分析のためにブランクおよびエンドポイントの反応混合物のアリコートも収集されました。 アリコートを 22,100 × g で 30 秒間遠心分離しました。 上清を収集し、ギ酸を最終濃度 1% で添加して反応を停止させました。 次に、サンプルを-20℃で一晩保存しました。 次に、酢酸エチルで液液抽出を行い、4-OHE2 と反応生成物を精製しました。 5 倍量の酢酸エチルをサンプルに加え、20 秒間ボルテックスしました。 サンプルを 22,100 × g で 10 分間遠心分離し、有機相を収集しました。 次に、水相を同じプロトコールで 2 回目の液液抽出に供しました。 すべての有機相を真空乾燥し、LC-MS/MS 分析のために 60 μL の 50% MeOH に懸濁しました。

タンパク質 PP00124 の組換え発現は、前述のように誘導されました。 pET22b(+)空プラスミドで形質転換した大腸菌BL21(DE3)の250ミリリットル培養物も、陰性対照として増殖させた。 誘導の 2 時間後、細胞を遠心分離によって収集し、0.4% グルコースおよび 1 mM Fe(NH4)2(SO4)2 を補充した最少培地 (50 mM リン酸カリウム、pH 7.0) に 5 OD600 で懸濁しました。 最後に、100 μM 4-OHE2 を培地に添加し、細胞を一定の振盪下で 37 °C でインキュベートしました。 500μLのアリコートを以下の時点で収集した:0、1、2、3.5、5、7.5、10、15、30、60、および120分。 アリコートを 22,100 × g で 30 秒間遠心分離しました。 上清を収集し、ギ酸を最終濃度 1% で添加して反応を停止させました。 次に、サンプルを-20℃で一晩保存しました。 次に、前の段落で概説したのと同じ手順に従って、酢酸エチルによる液液抽出を実行して 4-OHE2 と得られた反応生成物を精製しました。 5 倍量の酢酸エチルをサンプルに加え、20 秒間ボルテックスしました。 サンプルを 22,100 × g で 10 分間遠心分離し、有機相を収集しました。 次に、水相を同じプロトコールで 2 回目の液液抽出に供しました。 すべての有機相を真空乾燥し、LC-MS/MS 分析のために 60 μL の 50% MeOH に懸濁しました。

さまざまな生物変換実験からの反応混合物の LC-MS/MS 定性定量分析は、Accela UHPLC システム (Thermo-Fisher Scientific) と組み合わせた LTQ-Orbitrap ESI 質量分析計 (Thermo-Fisher Scientific) で実行されました。 クロマトグラフィー分離は、移動相として 0.1% ギ酸水溶液 (A) およびメタノール (B) を使用し、B の 5 ～ 30% の直線勾配を使用して、Kinetex C18 カラム (150 × 2 mm、2.6 μm) (Phenomenex) で実行されました。流速200μL/分で10分以内。 全質量 (MS1) スペクトルは、125 ～ 500 の m/z 範囲にわたって高分解能陰イオン モードで取得されました。MS/MS スペクトルは、MS1 スペクトル (ディペンデント スキャン モード) で検出された最も強力なイオンについて取得されました。 -トラップの断片化。

4-OHE2 および反応生成物の相対存在量は、各化合物の抽出イオンクロマトグラムを生成することによって推定されました (4-OHE2 の m/z 287.2、4-OHE2 メタ開裂生成物の m/z 323.2、および 4-OHE2 環化生成物の m/z 305.2 (仮説)) 。

各化合物について、登録された最も高いピーク面積を 100% の面積とみなしました。 他の時点での面積%を最高ピーク面積と比較して計算しました。 さまざまな時点で得られた相対存在量を時間の関数としてプロットしました。

サンプルは 3 回分析され、データは測定領域の平均として報告されました。

ERCD タンパク質配列は UniProt データベースで入手できます。 アクセッション番号は次のとおりです: PP28735、PP26077、PP00124、および PP00193 タンパク質の場合、それぞれ F6IHX1、F6ID78、F6IHP2、および F6IHN4。

マクラクラン、JA、ニューボールド、RR エストロゲンと開発。 環境。 健康の観点。 75、25–27 (1987)。

記事 CAS Google Scholar

Carmina, E.、Stanczyk, FZ & Lobo, RA、第 34 章—Yen および Jaffe の生殖内分泌学におけるホルモン状態の評価 (Strauss, JF、Barbieri, RL 編)、887–915 (Elsevier、2019)。

Palme, R.、Fischer, P.、Schildorfer, H. & Ismail, MN 注入された 14C ステロイド ホルモンの家畜の糞便および尿による排泄。 アニム。 リプロド。 科学。 43(1)、43–63 (1996)。

記事 CAS Google Scholar

サウスカロライナ州パーク カテコール エストロゲン 4-ヒドロキシエストラジオールは、乳がんにおける究極の発がん物質です。 バイオメッド。 科学。 レット。 24、143–149 (2018)。

記事 Google Scholar

Jobling, S. et al. 英国の河川におけるステロイドエストロゲンへの曝露の予測は、野生魚個体群における広範な性的混乱と相関している。 環境。 健康の観点。 114(補足 1)、32–39 (2006)。

記事 Google Scholar

Gonsioroski, A.、Mourikes, VE & Flaws, JA 水中の内分泌かく乱物質とその生殖器系への影響。 内部。 Ｊ．Ｍｏｌ． 科学。 21(6)、1929年（2020年）。

記事 CAS Google Scholar

Zhang、H.ら。 中国北部における新鮮な家畜の排泄物中の遊離エストロゲン、結合型エストロゲン、ビスフェノールAの発生と堆肥化によるそれらの除去。 環境。 科学。 汚染。 解像度内部。 21(16)、9939–9947 (2014)。

記事 CAS Google Scholar

Tang、Z.ら。 11 種類の天然エストロゲンの測定を追跡し、都市の下水処理場や河川水でのそれらの発生から得た洞察を追跡します。 水耐性 182、115976 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Tang、Z.ら。 豚と牛の尿に含まれる 12 種類の天然エストロゲン: あまり研究されていない 8 種類の濃度プロファイルと重要性。 科学。 トータル環境。 803、150042 (2022)。

記事 ADS CAS Google Scholar

リー・パウ、CS 他一般的なスポーツフィッシュの水生系およびインターセックスにおける内分泌活性汚染物質。 環境。 有毒。 化学。 36(4)、959–968 (2017)。

記事 CAS Google Scholar

Derouiche, L.、Keller, M.、Duittoz, AH & Pillon, D. エチニルエストラジオールへの発育曝露は、雄マウスの世代を超えた性行動と神経内分泌ネットワークに影響を与えます。 科学。 議員第 5 号、17457 (2015)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Hogan, NS、Duarte, P.、Wade, MG、Lean, DR & Trudeau, VL エストロゲンへの曝露はキタヒョウガエル (Rana pipiens) の変態に影響を与え、性比を変化させる: 発育の極めて脆弱な時期を特定する。 Gen.Comp. 内分泌。 156、515–523 (2008)。

記事 CAS Google Scholar

アントニー、S.ら。 内分泌かく乱化学物質のバイオレメディエーション - 進歩と課題。 環境。 解像度 213、113509 (2022)。

記事 CAS Google Scholar

Yu、CP、Deeb、RA、Chu、KH ステロイド性エストロゲンの微生物による分解。 Chemosphere 91(9)、1225–1235 (2013)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Mishra, V.、Veeranna, S.、Jitendra, K. 細菌の芳香族ジオキシゲナーゼ遺伝子を操作してバイオレメディエーションを改善します。 汚染物質のバイオレメディエーション (Pandey, VC、Singh, V. 編)、161–185、(Elsevier、2020)。

Vaillancourt, FH、Bolin, JT & Eltis, LD 環切断ジオキシゲナーゼの詳細。 クリティカル。 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． モル。 バイオル。 41、241–267 (2006)。

記事 CAS Google Scholar

炭化水素とフェノール化合物の環境バイオレメディエーションにおけるシュードモナス属のメディッチ、AB およびカラジッチ、IM、重要な異化分解酵素と包括的な研究のための新しい分析プラットフォーム。 World J. Microbiol. バイオテクノロジー。 38(10)、165 (2022)。

記事 Google Scholar

harayama, S. & Rekik, M. 細菌の芳香環切断酵素は 2 つの異なる遺伝子ファミリーに分類されます。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 264(7)、15328–15333 (1989)。

記事 CAS Google Scholar

栗栖 文、小倉 正、斉藤 S.、山添 明、八木 O. 天然エストロゲンの分解とロドコッカス属の土壌分離株により生成される代謝産物の同定およびＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．．Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ． バイオエンジ。 109、576–582 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

中井 晋 ほか Nitrosomonas europaea による 17β-エストラジオール分解と 17β-エストラジオール由来のエストロゲン活性の低下の経路。 環境。 化学。 レット。 9、1–6 (2011)。

記事 CAS Google Scholar

Lee, HB & Liu, D. 下水細菌による 17β-エストラジオールとその代謝産物の分解。 水、空気、土壌汚染。 134、351–366 (2002)。

記事 ADS Google Scholar

Yu、CP、Roh、H.、および Chu、KH 活性汚泥から分離された 17β-エストラジオール分解細菌。 環境。 科学。 テクノロジー。 41(2)、486–492 (2007)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Coombe, RG、Tsong, YY、Hamilton, PB & Sih, CJ 微生物によるステロイド酸化のメカニズム。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 241、1587–1595 (1966)。

記事 CAS Google Scholar

チェン、YL 他細菌性エストロゲン分解経路に関与する生化学的機構と異化酵素。 細胞化学。 バイオル。 24(6)、712-724.e7 (2017)。

記事 CAS Google Scholar

ウー、Ｋら。 エストロゲンの A 環および B 環の好気性分解に関与する代謝産物。 応用環境微生物。 85(3)、e02223-e2318 (2019)。

記事 CAS Google Scholar

ワン、P.ら。 シュードモナス・プチダSJTE-1におけるエストロゲン分解に関与する17β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよび調節因子の特性評価。 応用微生物。 バイオテクノロジー。 103(5)、2413–2425 (2019)。

記事 CAS Google Scholar

Ibero, J.、Galán, B.、Rivero-Buceta, V. & García, JL Novosphingobium tardaugens NBRC 16725 の 17β-エストラジオール分解経路の解明。正面。 微生物。 11、588300 (2020)。

記事 Google Scholar

リー、Ｓ．ら。 Novosphingobium sp.による17β-エストラジオール分解に関与する新規異化遺伝子の同定 ES2-1。 環境。 微生物。 23(5)、2550–2563 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

ノトミスタ、E. et al. 海洋分離株Novosphingobium sp. PP1Y は、燃料の芳香族留分を唯一の炭素源およびエネルギー源として使用するための特異的な適応を示します。 微生物。 エコル。 61、582–594 (2011)。

記事 CAS Google Scholar

ダルジェニオ、V. et al. ノボスフィンゴビウム属の完全な配列決定 PP1Y は、バイオテクノロジー的に意味のある代謝パターンを明らかにします。 BMCジェノム。 15(1)、384 (2014)。

記事 Google Scholar

Cafaro, V.、Izzo, V.、Notomista, E. & Di Donato, A. 海洋炭化水素破壊細菌。 生体触媒のための海洋酵素、海洋酵素の供給源、生体触媒特性およびバイオプロセス (Trincone, A. 編) 373–402 (Woodhead Publishing Series in Biomedicine、Elsevier、2013)。

Spence, EL、Kawamukai, M.、Sanvoisin, J.、Braven, H. & Bugg, TD 大腸菌 (MhpB) およびアルカリゲネス ユートロファス (MpcI) 由来のカテコール ジオキシゲナーゼ: エクストラジオール ジオキシゲナーゼの 3 番目のファミリーの配列分析と生化学的特性。 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 178、5249–5256 (1996)。

記事 CAS Google Scholar

Riegert, U.、Heiss, G.、Fischer, P. & Stolz, A. エクストラジオール ジオキシゲナーゼによる 3-クロロカテコールの遠位切断による 3-クロロ-2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒド。 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 180(11)、2849–2853 (1998)。

記事 CAS Google Scholar

Fetzner, S. キューピンフォールドを持つ環切断ジオキシゲナーゼ。 応用環境。 微生物。 78(8)、2505–2514 (2012)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Li, M.、Zhao, X.、Zhang, X.、Wu, D. & Leng, S. 肥料から分離された細菌共培養による 17β-エストラジオールの生分解。 科学。 議員第 8 号、3787 (2018)。

記事 ADS Google Scholar

Fernandes, P.、Cruz, A.、Angelova, B.、Pinheiro, HM & Cabral, JMS ステロイド化合物の微生物変換: 最近の開発。 酵素微生物。 テクノロジー。 32(6)、688–705 (2003)。

記事 CAS Google Scholar

Fernández-Cabezón, L.、Galán, B. & García, JL ステロイドバイオテクノロジーに関する新たな洞察。 フロント。 微生物。 9, 958 (2018)。

記事 Google Scholar

北 明 ほか典型的なエクストラジオール切断カテコール ジオキシゲナーゼ: シュードモナス プチダ mt-2 由来のカテコール 2,3-ジオキシゲナーゼ (メタピロカテカーゼ) の結晶構造。 構造 7(1)、25 ～ 34 (1999)。

記事 CAS Google Scholar

Vaillancourt, FH、Labbé, G.、Drouin, NM、Fortin, PD & Eltis, LD カテコール基質による 2,3-ジヒドロキシビフェニル 1,2-ジオキシゲナーゼの機構に基づく不活性化。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 277、2019–2027 (2002)。

記事 CAS Google Scholar

Vézina, J.、Barriault, D.、Sylvestre, M. 家族による土壌 DNA のシャッフルによるバークホルデリア ゼノボランス LB400 ビフェニル ジオキシゲナーゼの位置特異性の変化。 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 189、779–788 (2007)。

記事 Google Scholar

Happe, B.、Eltis, LD、Poth, H.、Hedderich, R. & Timmis, KN​​ ジベンゾフランおよびジベンゾ-p-ダイオキシン分解細菌由来のエクストラジオール ジオキシゲナーゼである 2,2',3-トリヒドロキシビフェニル ジオキシゲナーゼの特性評価スフィンゴモナス属 RW1株。 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 175(22)、7313–7320 (1993)。

記事 CAS Google Scholar

分子クローニングにおける Sambrook J.、Fritsch EF、Maniatis T.。 実験室マニュアル (Cold Spring Harbor Laboratory Press、2000)。

Newman, LM & Wackett, LP Burkholderia cepacia G4 からのトルエン 2-モノオキシゲナーゼの精製と特性評価。 生化学 34、14066–14076 (1995)。

記事 CAS Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

イタリア、サレルノのサレルノ大学、医学部、外科、歯学部「Scuola Medica Salernitana」

フランチェスカ・メンシティエーリ、ファブリツィオ・ダル・ピアズ、ブルーノ・シャルリエ、ヴィヴィアナ・イッツォ

生物学部、フェデリコ 2 世ナポリ大学、モンテ サンタンジェロ大学キャンパス、Via Cinthia 4、ナポリ、イタリア

アンドレア・ボッソ、エウジェニオ・ノトミスタ、ヴァレリア・カファロ

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

FM と VC は作業を概念化し、実験的な作業のほとんどを行いました。 FDP と BC は、HPLC 分析と HPLC-MS/MS 分析を実行しました。 AB はタンパク質分析を実施しました。 VC、EN、VI、FDP は実験を修正し、重要なデータの解釈に貢献し、作業をレビューしました。 すべての著者は原稿の出版版を読み、同意しました。

ヴァレリア・カファロへの手紙。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Mensitieri, F.、Bosso, A.、Dal Piaz, F. 他ノボスフィンゴビウム種由来のエクストラジオール環開裂ジオキシゲナーゼによる 4-ヒドロキシエストラジオールの生物変換 PP1Y。 Sci Rep 13、1835 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-28908-2

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 7 月 7 日

受理日: 2023 年 1 月 27 日

公開日: 2023 年 2 月 1 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28908-2

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

コメントを送信すると、利用規約とコミュニティ ガイドラインに従うことに同意したことになります。 虐待的なもの、または当社の規約やガイドラインに準拠していないものを見つけた場合は、不適切としてフラグを立ててください。