可視分光光度計によるリナグリプチンのバルク定量のための新しい分析法の開発と検証

Mar 06, 2023

Scientific Reports volume 13、記事番号: 4083 (2023) この記事を引用

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リナグリプチン (LNG) を大量に測定および検証するための、シンプルで経済的かつ特異的な分析方法が開発されました。 この方法は、LNG 中の第一級アミンと P-ジメチルアミノベンズアルデヒド (PDAB) 中のアルデヒド基の間の縮合反応に基づいて、波長 407 nm の黄色のシッフ塩基を形成します。 着色複合体の配合に最適な実験条件が研究されています。 最適条件は、PDAB、LNG の両方の溶媒としてメタノールと蒸留水を含む 5% w/v 試薬溶液 1 mL、さらに酸性媒体として HCl 2 mL を加え、水上で 70 ～ 75 °C に加熱することでした。 35分間入浴。 さらに、反応の化学量論は、LNG と PDAB について 1:1 を表すジョブ法とモル比法に従って研究されました。 研究者は方法を修正しました。 結果は、濃度範囲 (5 ～ 45 μg/mL) の直線性が相関係数 R2 = 0.9989、回収率 (99.46 ～ 100.8%)、RSD が 2% 未満、LOD および LOQ が 1.5815 ～ 4.7924 μg/mL であることを示しています。それぞれ。 この方法は高品質を示すことができ、賦形剤や医薬品の形態に重大な影響を与えることはありません。 これまでこの方法の開発を示した研究はありませんでした。

リナグリプチンは新しいジペプチジルペプチダーゼ-4 (DPP-4) 阻害剤であり、この酵素はインクレチンホルモンであるグルカゴン様ペプチド-1 (GLP-1) およびグルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド (GIP) のダウングレードに関与します。 したがって、この作用により血中のインスリンレベルが増加し、グルカゴンのレベルが減少します1。 2 型糖尿病の治療において、食事や運動と組み合わせて、単独で、または他の経口血糖降下薬（エンパグリフロジン、メトホルミン）と組み合わせて使用​​されます2。 この薬は 2011 年 5 月に FDA の承認を受けました1。経口抗糖尿病薬として、この薬はキサンチンベースの構造を持っており、これが薬の消失半減期（100 時間以上）の重要な要因である可能性があります。 LNG の長い半減期は、時々薬を飲み忘れる患者にとって、より有益である可能性があります1。 LNG の化学構造は 8-[(3R)-3-アミノピペリジン-1-イル]-7-(ブト-2-イニル-3-メチル)-1-[(4-メチルキナゾリン-2-イル)メチル]です。プリン-2,6-ジオン。分子量 472.5 g/mol (図 1)2.

リナグリプチンの化学構造。

LNG の化学的および物理的特性: 色と形状: わずかに吸湿性があり、白色から黄色の固体。 融点: 190 ～ 195 °C。 溶解度: 水中、25 °C で 3.33 mg/L。 メタノールに可溶。 エタノールに溶けにくい。 安定性: 指示どおりに保管すれば安定です。 強力な酸化剤を避ける2.

リナグリプチンは、英国薬局方 (BP) または米国薬局方 (USP) では特定の分析方法として利用できません。 研究文献レビューでは、UV3,4,5 の分光光度計、NQS (1,2-ナフトキニーネ 4-スルホン酸ナトリウム塩) を使用した化学誘導による VIS など、医薬品形態の LNG の測定に関するいくつかの記事が示されています。 、バニリン 6 およびピクリン酸 7 を発色試薬として使用します。 キャピラリー電気泳動 (CE)8、および高速液体クロマトグラフィー (HPLC)9、10、11、12、13。 これらの方法は特異性と選択性が優れていますが、より多くの時間、大量の高価な溶媒と装置を必要とします。

可視分光光度計はシンプルで経済的な分析方法であるため、複数の分野 (臨床生化学、化学など) で使用されています。 また、他の方法である HPLC や CE に比べて高速であり、微量物質濃度の検出のための抽出の必要がありません。 LNG には発色団があまりないため、ある化学派生法を使用して、錠剤製品の LNG を測定するための新しい分光光度計法を開発しました。 この方法は時間がかからず、使用する溶媒もほとんどありません。 また、LNGの第一級アミンと407nmに極大吸収を持つ錯体の黄色を生成するPDABとして誘導剤を使用することにより、高い精度と正確性を備えています。

この論文で採用された研究方法は、研究目的を探求するために分析的アプローチを使用した実験計画でした。

紫外可視分光光度計 T80 + PG Instruments Ltd—英国。

ザルトリウス-ドイツの分析天びん。

水浴。

校正済みのガラスピペット。

分析グレードのリナグリプチン、純度は 99.25% (Simson Pharma Limited – 中国)、

メタノール (99.9%、ACROS)。

パラ-ジメチルアミノベンズアルデヒド (PDAB) 5% (w/v) (Scharlau-)

塩酸(HCl) 37% (SCPサイエンス)

ストック溶液 (1000 μg/mL): 50 mL の蒸留水中に 50 mg の LNG を秤量しました。

作業溶液 (100 μg/mL): 10 mL のストック溶液を蒸留水で 100 mL に希釈します。

ρDAB 5% (w/v): 1.25 gをよく振盪しながら25 mLのメタノールに溶解し、新たに調製しました。

作業溶液 LNG のアリコートを一連の 10 mL メスフラスコに移し、最終濃度を 5 ～ 45 ppm にしました。 各フラスコに 1 mL の ρDAB 5% (w/v) と 2 mL の HCl 37% を加え、密閉してよく振盪した後、70 ～ 75°の水浴に 35 分間入れ、その後、これらのフラスコを冷却し、蒸留水で 10 mL に希釈します。 黄色の最大吸収はブランク上で 407 nm でした。 リナグリプチンの量は検量線から計算した。

この研究はダマスカス大学薬学部長によって承認されました。

私たちの研究プロトコールは、シリアのダマスカスにあるダマスカス大学薬学部によって審査され、承認されました。

研究論文の過程で収集された結果の分析は、吸収スペクトル、反応条件の最適化、反応の化学量論、および開発された方法の検証の 4 つのレベルで継続されました。

LNG (20 μg/mL) の吸収スペクトルは、350 ～ 700 nm の波長領域で可視分光光度計で記録されました。 これは、図 2 の 407 nm における吸収極大曲線を示しています。

試薬ブランク (20 μg/mL LNG) に対する誘導体製品の吸収スペクトル。

蒸留水、メタノール、エタノール、アセトニトリルなどの多くの溶媒が、溶解した LNG と PDAB の両方の溶媒として、また潜在的な希釈媒体としてそれぞれ選択されました。 蒸留水とメタノールがそれぞれ LNG と PDAB の両方にとって最適な溶媒であることが判明し、最も高い吸光度値と配合されたシッフ塩基の安定性が得られました。

LNG とさまざまな PDAB 濃度 (1 ～ 7% w/v) の増加との間の反応が研究されました。 吸光度はPDAB濃度の増加とともに増加し、図3aに示す5% w/vの試薬を使用することでその最大値に達することがわかりました。

反応条件の最適化。 (a) LNG と PDAB の反応に対する PDAB 濃度 (破線) と体積 (点線) の影響。 (b) LNG と PDAB の反応に対する温度 (点線) と時間 (破線) の影響。 (c) LNG (20 μg/mL) と PDAB 5% の間の反応に対する HCl 量の影響。 (d) 反応生成物の安定性。

研究者は、PDAB 試薬 (5% w/v) の適切な量を見つけるために、0.5 ～ 3 mL の範囲で適切な PDAB 量を検討しました。 したがって、結果は、PDAB 容量 1 mL で最高の吸収強度が達成され、その後減少することを示しました (図 3b)。

研究者は、LNG と PDAB の反応に適切な酸性媒体の量を選択するために、さまざまな量の HCl 37% (1 ～ 3 mL) をテストしました。 最良の結果は、2 mL の 37% HCl で得られました (図 3c)。

研究の目的を達成できる最適な温度を選択するために、ウォーターバス内のさまざまな温度範囲 (25、60 ～ 65、70 ～ 75、80 ～ 85 °C) がチェックされました。 したがって、最適な温度範囲は 70 ～ 75 °C であると判断できます (図 3b)。

この反応に対する加熱時間の延長の影響は、70 ～ 75 °C で異なる時間間隔 (10 ～ 60 分) で発色を監視することで制御されました。 最大吸光度値は 35 分で得られました (図 3b)。

誘導体製品の安定性については、時間間隔 (5 ～ 130 分) でテストされました。 結果は、誘導体化合物が大きな吸収値に達するまでに 15 分を必要とし、その後値は 1 時間一定のままであることを示しました (図 3d)。

定量的反応速度は、ジョブの連続変動法およびモル比法によって記録されました14。

94.5 mg の LNG を 100 mL の蒸留水に溶かしてリナグリプチン標準溶液 (2 × 10-3 mol/l) を調製します。

よく振盪しながら 100 mL のメタノールに 29.8 mg を溶解することにより、ρDAB (2 × 10-3 mol/l) 溶液を調製しました。

図４ａの連続変化プロットは、モル分率０．５が、すべてのフラスコについて２ｍＬの３７％ＨＣｌを含むＬＮＧ：ＰＤＡＢ複合体の比率１：１を意味することを示した。 図 4b のモル比プロットでは、LNG:PDAB 複合体比 = 1 の場合に最も高い吸光度が得られました。つまり、1 モルの LNG は 1 モルの PDAB と相互作用します。

反応 LNG と PDAB の化学量論。 (a) LNG と PDAB の間の連続変動に関するジョブの方法。 [LNG]: 2 × 10−3 M; [PDAB]: 2 × 10−3 M; [LNG] + [PDAB]: 4 mL + [HCl]: 2 mL。 (b) LNG と PDAB 間の反応のスティコメトリーのモル比法。 (c): LNG と PDAB 間の提案された反応経路。

LNG と試薬間の反応スキームを図 4c に示します。

このメソッドは、直線性、精度、正確な定量限界、および検出限界を含む ICH ガイドラインに記載されている手順に従って検証されました 15。

最適条件を決定した後、濃度範囲 5 ～ 45 μg/mL でベールの法則を使用して直線性を評価しました。検量線は、R2 値 0.9989 の線形回帰分析を使用し、濃度対吸光度によって形成され、回帰式は y = でした。 0.0265x + 0.0602。

検出限界 (LOD) と定量限界 (LOQ) は、次の式に従って計算されました。

ここで、SD はブランクの標準偏差、b は傾きです。 LOD と LOQ は、それぞれ 1.5815 μg/mL と 4.7924 μg/mL であることがわかりました (表 1A)。

このメソッドの再現性は、1 日以内に 1 つの濃度 (20 µg/mL) の LNG の 6 つの反復サンプルを相対標準偏差 RSD \(\le \hspace{0.17em}2\%\) で測定することによって研究されました。

さらに、中間精度は、同じ日（日中）および連続する 3 日間（日中）に 3 つの異なる濃度（10 ～ 20 ～ 30 μg/mL）の LNG 溶液を 3 回分析することによって評価されました。日内と日内の精度値の間には有意差が観察され、RSD % 値は 2 未満でした (表 1B)。

精度については、LNG の 3 つの濃度 (10 ～ 20 ～ 30 µg/mL) 間の平均回収率と RSD % によってチェックされました。 表1B。

研究者は、提案された方法の特異性を判断するために、この方法を使用して医薬品投与量を形成する可能性のある賦形剤の干渉をチェックしました。

サンプルは、マンニトール 20 mg、トウモロコシデンプ​​ン 30 mg、アルファ化デンプン 30 mg、コポビドン 5 mg、およびステアリン酸マグネシウム 4 mg を混合することによって調製されました16。 これらの賦形剤を提案された方法により分析した。 結果は、良好な回収率 101.157% および RSD = 0.8387% でした。 これらは、賦形剤間の干渉がないことと、この誘導法による薬剤投与量中の LNG の決定を意味します。

提案された方法のロバスト性が検討され、その結果、実験条件（PDABの濃度∓ 0.2％（w/v）、PDABとHClの体積∓ 0.2 mL、加熱時間∓ 2 minの変動、測定波長 (nm) ∓ 2 nm、その他のパラメーターは一定であるため、RSD は 2% 未満でした。

リナグリプチンは、新しい経口抗糖尿病薬です。 LNG には薬局方における特定の分析方法がありません。 LNG については、HPLC による LNG の分析を目的とした論文が数多くありますが、この方法には高価な溶媒と特殊な装置が必要です。 そこで本論文は，バルクのＬＮＧと薬剤投与量を測定するための化学試薬としてのＬＮＧとＰＤＡＢとの縮合反応に依存する新しい簡単な分析法について述べた。 この分析研究の最適条件の条件が研究され、蒸留水とメタノールが LNG と PDAB の両方に最適な溶媒であることがわかりました。誘導体試薬として 5% PDAB 1 mL、酸性試薬として 37% HCl 2 mL です。培地を水浴上で 70 ～ 75 °C に 35 分間加熱して、波長 407 nm の黄色のシッフ塩基を形成し、1 時間形成されたシッフ塩基の安定性を確認します。 提案された方法の検証により、相関係数 R2 = 0.9989 によれば、この反応は 5 ～ 45 μg/mL の直線性があり、回収率 (99.46 ～ 100.8%) が許容基準内であり、RSD は 2% 未満であったことが示されました。提案された方法は、優れた正確性と正確性、および高い特異性を備えています。

さらに、この反応のモル比は、LNG と PDAB の間で選択され、連続変化とモル比の 2 つの方法に応じて (1:1) 複雑になりました。

提案された導出法は、多くの装置や材料を必要とする他の分析法と比較して、適用が容易で高価な材料を消費しないPDAB試薬を使用することが特徴でした。

データは、責任著者からの合理的な要求に応じて利用可能になります。

ρ-ジメチルアミノベンズアルデヒド

リナグリプチン

インクレチン ホルモン グルカゴン様ペプチド-1

グルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド

食品医薬品局

英国薬局方

米国薬局方

紫外線

見える

キャピラリー電気泳動

高速液体クロマトグラフィー

塩酸

重量/体積パーセント

国際調和会議

相対標準偏差

標準偏差

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ダマスカス大学薬学部分析・食品化学学科（シリア、ダマスカス）

ルジャイン・サルール & マイサム・サラミ

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LS: データのキュレーション。 調査; リソース; 検証; 原案。 執筆—レビューと編集。 方法論; プロジェクト管理。 MS: 調査。 リソース; 検証; 原案。 執筆—レビューと編集。 方法論; 監督; プロジェクト管理。 すべての著者は原稿を読んで承認しました。

ルジャイン・サフルル氏への通信。

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転載と許可

Sahloul, L.、Salami, M. 可視分光光度計による大量のリナグリプチンの定量のための新しい分析法の開発と検証。 Sci Rep 13、4083 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-31202-w

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受信日: 2022 年 7 月 21 日

受理日: 2023 年 3 月 8 日

公開日: 2023 年 3 月 11 日

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