サイトキメラGIL

Mar 24, 2023

Communications Biology volume 6、記事番号: 418 (2023) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

インターロイキン (IL-)6 ファミリーのサイトカインは 1 つを除いてすべて、共通の β 受容体鎖として糖タンパク質 (gp) 130 を共有しています。インターロイキン (IL-)11 は非シグナル伝達性 IL-11 受容体 (IL-11R) および gp130 ホモ二量体を介してシグナルを伝達しますが、白血病抑制因子 (LIF) は gp130:LIF 受容体 (LIFR) ヘテロ二量体をリクルートします。 IL-11をフレームワークとして使用して、IL-11のgp130結合部位IIIをLIFのLIFR結合部位IIIと交換します。得られた合成サイトキメラ GIL-11 は、gp130、IL-11R、LIFR からなる非天然受容体シグナル伝達複合体を効率的に動員し、因子依存性 Ba/F3 細胞のシグナル伝達と増殖を引き起こします。 LIFおよびIL-11のほかに、GIL-11は、それぞれgp130:LIFRまたはgp130:IL-11Rからなる受容体複合体を活性化しない。ヒト GIL-11 はマウスおよび部分肝切除後の救出 IL-6R-/- マウスに対して交差反応性を示し、gp130:IL-11R:LIFR シグナル伝達が効率的に肝臓再生を誘導することが実証されました。サイトキメラ GIL-11 の開発に伴い、我々は gp130:IL-11R:LIFR の非天然サイトカイン受容体複合体の機能的集合を考案しました。

サイトカイン受容体複合体形成に関する理解の進歩により、デザイナーサイトカインによって非天然サイトカイン受容体複合体を構築するためのさまざまなアプローチの実装が可能になりました。これらには、シンセカイン 1、ネオロイキン 2、キメラサイトカイン (サイトキメラ) 3 だけでなく、完全合成サイトカインシステム 4 も含まれます。シンセカインは、2 つのドミナントネガティブサイトカイン変異体の融合体であり、各変異体は 1 つの受容体サブユニットのみに結合します1。ネオロイキンは天然のサイトカインのいくつかの側面を再現していますが、全体的なデザインとアミノ酸配列は完全に無関係です2。サイトキメラは、密接に関連するサイトカインから交換された少なくとも 1 つの受容体認識部位を持つ天然サイトカインのフレームワークに基づいています 3。この概念は、IL-6 タイプのサイトカインであるインターロイキン (IL-)6 および毛様体神経栄養因子 ( CNTF) サイトカイン IC73 に含まれます。

IL-6 型サイトカインには、IL-6、IL-11、IL-27、IL-30、IL-31、白血病抑制因子 (LIF)、オンコスタチン M (OSM)、CNTF、カルジオトロフィン-1 (CT-1) が含まれます。、カルジオトロフィン様サイトカイン (CLC) およびニューロポエチン 5,6。 IL-31 を除けば、すべての IL-6 型サイトカインは共通の gp130 β 受容体 7,8 を介してシグナル伝達を誘導し、JAK/STAT、Ras/Map キナーゼ、ホスファチジルイノシトール 3-キナーゼ経路を含むシグナル伝達カスケードを活性化します 8,9。 IL-6およびIL-11はgp130ホモ二量体を介してシグナルを伝達しますが、他のサイトカインはgp130ヘテロ二量体を介してシグナルを伝達します。例えば、CNTF と LIF は gp130:LIF 受容体 (LIFR) をリクルートします 10、11、12。さらに、IL-6 型サイトカイン IL-6、IL-11、および CNTF は、β 受容体への結合を可能にするために、特定の α 受容体 (それぞれ IL-6R、IL-11R、CNTFR) と相互作用する必要があります 10、11、13。、14、15。

19993 年の画期的な論文で、Kallen et al. は、サイトカインの受容体認識部位が、原理的には異なるサイトカイン間で自由に交換可能であるはずの不連続なモジュールとして進化したことを示唆した。一般に、IL-6 タイプのサイトカインには、LIF の場合は 2 つ、IL-11 または CNTF の場合は 3 つの受容体結合部位があり、α 受容体にはサイト I、2 つのβ 受容体にはサイト II およびサイト III があります10,11。、12． CNTF16 の LIFR 結合部位 III を IL-6 の結合部位 III に移すことにより、この種の最初のサイトキメラ IC7 が 20 年以上前に記載されました 3。略語IC7は、7番目に試験されたキメラインターロイキン/CNTF変異体に由来しています。モジュール交換により、IL-6 の場合は IL-6R と gp130、または gp130、CNTFR、および LIFR に依存するのではなく、gp130、IL-6R、および LIFR を発現する細胞に対して IL-6R 依存活性を持つマッシュアップサイトカインが作成されました。 CNTF3の場合。最近、IC7 は耐糖能と高血糖を改善し、それによってマウスの体重増加と脂肪肝を防ぐことが示されました 17。 IC7 とは別に、IL-618、IL-2719、CNTF20 などの IL-6 サイトカインファミリーの他のサイトカインも肥満とインスリンに対する保護効果を示しました。しかし、IL-6 には顕著な炎症促進効果があるため、IL-6 を治療に使用することは問題外です。 CNTF バリアント Axokine は、中和 CNTF 抗体の早期開発により失敗しました 21。 IC7 は両方の長所を組み合わせたもので、ヒト以外の霊長類において安全性の問題は示されませんでした 17。

今回、我々は、gp130:IL-11R:LIFRからなる非天然受容体複合体に結合するサイトキメラGIL-11を開発した。我々は、IL-11をLIFからサイトIIIの転移のための骨格として使用し、サイトキメラGIL-11をもたらしました。高活性の GIL-11 は、LIF22、23 と IL-1124 の活性を 1 つの分子に組み合わせています。注目すべきことに、肝疾患における IL-11 の保護的寄与が最近疑問視されており 25,26 、IL-11 の治療への応用が望ましくないものになっています。 GIL-11の治療可能性を実証するために、我々は肝部分切除術（PHX）をチャレンジしたIL-6R-/-マウスを利用した。 PHX27後のIL-6R-/-マウスは、野生型マウスでは10％であるのに対し、最大80％という高い死亡率を示した。ここで我々は、GIL-11が肝部分切除術後のマウスの死を救ったことを示した。

IL-6 タイプのサイトカインは、2 つの長いクロスオーバーループ (AB、CD) と 1 つの短いループで接続された 4 本の逆平行アルファヘリックス (A、B、C、D) で構成される共通の 4 ヘリックスバンドル構造を共有しています。 (BC)28． IL-6、IL-11、およびCNTFは、C末端ABループおよびC末端Dヘリックスの残基を含む結合部位Iを介してα受容体に結合します10、11、13、14、15。 CNTF、LIF、およびIL-6のAヘリックスおよびCヘリックスの残基は、サイトII10、11、12と呼ばれるgp130結合部位を構成します。 IL-6 および IL-11 では、2 番目の gp130 結合部位 III は、N 末端 AB ループ、C 末端 CD ループ、および N 末端 D-ヘリックスのアミノ酸残基から構成されます10、11。 CNTFおよびLIFのサイトIIIはLIFRと接触するが、サイトIIはgp13012と接触する。 IL-11 の場合、サイト II およびサイト III は gp130 と接触していますが、3 番目のサイト (サイト I) は IL-11R11 をリクルートします。注目すべきことに、IL-11のIL-11Rへの一次結合は、gp13011への二次結合に必須である、29。 IL-11およびLIFの部位I、II、IIIパラダイムを図1a、bに示します。

四量体および六量体IL-11:IL-11R:gp130受容体複合体の可能性の概略図。 IL-11 は最初にサイト I を介して IL-11R に結合します。gp130 は、IL-11 のサイト III と gp130 の D1 (Ig 様) および IL-11 のサイト II と D2/D3 ( gp130のサイトカイン結合モジュール(CBM))。 b 三量体 LIF:gp130:LIFR 複合体の概略図。 LIFは、サイトIIIを介してLIFRのD3/D4に結合し、サイトIIを介してgp130のD2/D3に結合します。 c 四量体 GIL-11:IL-11R:gp130:LIFR 複合体の概略図。 GIL-11は、部位IIIを介してLIFRのD3/D4に結合し、部位IIを介してgp130のD2/D3に結合し、部位Iを介してIL-11RのD2/D3に結合する。 d 四量体 GIL-11:IL-11R:LIFR:gp130 (PDB 6O4P;11 2Q7N;83 1P9M10) の概略図 (左) と空間充填モデル (右)。 GIL-11は、サイトIを介してIL-11Rに結合し、サイトIIを介してgp130に結合し、サイトIIIを介してLIFRに結合します。 e GIL-11の透明スペースフィル/バンドモデルを組み合わせたもの、赤：IL-11、緑：LIFによる交換領域。 f hIL-11 (PDB 6O4O11)、hLIF (PDB 1PVH33)、および得られた GIL-11 の構造ベースの概略配列アラインメント。サイト IIIa、b、c 残基は緑と赤のボックスで強調表示されます。

注目すべきことに、IL-6およびIL-11は、1つのサイトカイン、1つのα受容体および2つのgp130、または2つのサイトカイン、2つのα受容体および2つのgp13010,30からなる四量体および六量体の受容体複合体を形成することができる（図1a）。四量体受容体複合体は主に生物学的に活性であるにもかかわらず 31、受容体複合体の構造は六量体集合体のみを示しました 10,11。しかし、LIFは、サイトIIを介して1つのgp130と結合したLIFと、サイトIIIを介して1つのLIFRと結合したLIFからなる三量体受容体複合体を介してのみシグナルを伝達します12,32（図1b）。注目すべきことに、LIFは、gp130とLIFR12のβ受容体の組み合わせに結合するためにα受容体を必要としません。しかし、LIF の LIFR への結合は、IL-11 の同じ位置にある gp130 への結合部位 III によって促進されます (図 1b)12。我々は、ヒトIL-11の分割結合部位IIIとヒトLIFの部位IIIの構造に基づく交換により、得られたキメラサイトカインが非天然サイトカイン受容体組成物gp130:IL-11R:LIFRの結合剤となるのではないかと仮説を立てた。これはサイトキメラ GIL-11 と呼ばれるサイトカインクラスです。 LIFのβ受容体結合はα受容体非依存性であるため12、キメラサイトカインGIL-11のgp130:LIFR動員がIL-11R依存性であるかどうかは不明であった（図1c、d）。 IL-11およびLIFのサイトIIIの構造検査は、IL-11のフレームワークおよびLIFからのサイトIIIの交換を備えたサイトキメラGIL-11の設計を導いた11,33。 IL-11は199個のアミノ酸で構成されており、IIIaの場合はアミノ酸58〜72、IIIbの場合は111〜128、IIIcの場合は162〜179から分割部位IIIを特定しました。 LIFには202個のアミノ酸があり、分割サイトIIIはIIIaの場合はアミノ酸64〜88、IIIbの場合は119〜138、IIIcの場合は172〜189に位置します（図1d〜f、補足図1A）。我々は、完全な結合部位をLIFからIL-11に移すことを決定したが、これにより、元のIL-11よりも211アミノ酸を有するいくらか長いGIL-11サイトキメラが得られた。分子モデリングは、サイト III アミノ酸ストレッチ全体の転移がサイトキメラ GIL-11 の全体的な構造とフォールディングを妨げないはずであることを示唆しました (図 1d、e)11,12。三量体 LIF:gp130:LIFR 複合体と比較して、GIL-11 は四量体 GIL-11:IL-11R:gp130:LIFR 受容体複合体のみを形成します。四量体アセンブリは、LIFR の GIL-11 の要件に基づきます。 gp130 は 1 つの受容体分子に 2 つのサイトカイン結合部位を持っていますが、LIFR には 1 つのサイトカイン結合部位しかありません。 LIFRはLIF/GIL-11の部位IIIとのみ相互作用するが、gp130はLIF/GIL-11の部位IIと接触する。この設定では、LIF / GIL-11のサイトIIIはgp130と相互作用できず（図1c）、六量体2xGIL-11：2xIL-11R：1xLIFR：1xgp130複合体の形成が可能であるため、gp130の2番目の接触部位は遊離したままになります。除外されます。

マウスのプレ B 細胞株 Ba/F3 の増殖は IL-3 依存性です 34。ヒト gp130 と追加のファミリー受容体 (IL-6R、IL-11R35、36、OSMR および LIFR (補足図 1B、C)) の導入後、増殖はそれぞれの IL-6 型サイトカイン受容体の組み合わせに移行しました。 Ba/F3-gp130 細胞の場合、増殖は IL-11 および可溶性 IL-11R、または対応する融合タンパク質 Hyper IL-11 (HIL-11)37 によって誘導され、IL-11R の追加導入によりこれらの細胞は IL になります。 -11依存。 gp130 と IL-6R の共発現により、これらの細胞は IL-6 に応答します。 gp130 および LIFR を発現する Ba/F3 細胞は LIF および OSM によって増殖しますが、gp130 および OSMR を発現する Ba/F3 細胞は OSM に応答します。 Ba/F3 細胞レパートリーと 8 つの異なる受容体の組み合わせ gp130、gp130:IL-11R、gp130:LIFR、gp130:OSMR、gp130:IL-11R:OSMR、gp130:IL-6R:LIFR、および gp130:IL-11R を使用する:LIFR、IL-11、HIL-11、OSM、LIF、および GIL-11 の添加後の定性的な増殖特性を決定しました。 500 ng/ml というやや高濃度を使用して、受容体の交差活性化の可能性を最初に評価します。 GIL-11は、Ba / F3-gp130:IL-11R:LIFR細胞の増殖のみを特異的に誘導し、他の試験した細胞株の増殖は誘導しなかった。これは、GIL-11がgp130:IL-11R:LIFRを介してシグナルを伝達していることを示唆している（図2a、補足データ））。予想通り、Ba/F3 細胞株はすべて gp130 を発現しているため、HIL-11 のみがすべての Ba/F3 細胞株の増殖を誘導しました。 gp130 および IL-11R を発現するすべての Ba/F3 細胞は、IL-11 とともに増殖しました。 gp130およびLIFRの発現はLIFおよびOSM誘導性の増殖をもたらしたが、gp130を発現する細胞およびOSMR細胞はOSM選択的であった。次に、Ba/F3 細胞ポートフォリオにおける IL-6 型サイトカイン JAK/STAT シグナル伝達の主要な特徴である STAT3 のリン酸化を分析しました。サイトカイン誘導性のBa / F3細胞増殖アッセイから予想されたように（図2a）、Ba / F3細胞におけるSTAT3リン酸化は、以下のサイトカイン：サイトカイン受容体の組み合わせによって誘導されました。 gp130経由のIL-11:IL-11R; gp130:OSMR 経由の OSM; gp130:LIFRを介したOSMおよびLIF（図2b;補足図2、3）。重要なことに、GIL-11の持続的なSTAT3リン酸化は、受容体の組み合わせgp130、IL-11RおよびLIFRを発現するBa / F3細胞でのみ観察されました（図2b、補足図2、3）。まとめると、我々のデータは、GIL-11 が gp130:IL-11R:LIFR からなる非天然受容体複合体を介してシグナル伝達を特異的に活性化することも示しました。

a Ba/F3-gp130、Ba/F3-gp130-IL-11R、Ba/F3-gp130:LIFR、Ba/F3-gp130:OSMR、Ba/F3-gp130:IL-11R:OSMR、Ba/F3の増殖-gp130:IL-6R:LIFR、Ba/F3-gp130:LIFR:IL-11R 細胞 (サイトカインなし (-)、50 ng/ml HIL-11、50 ng/ml IL-11、50 ng/ml IL あり) 6、10 ng/ml LIF、10 ng/ml OSM、500 ng/ml GIL-11。データは、それぞれ 3 回の技術的反復による 3 回の独立した実験のうちの 3 回の独立した実験の±SEM を表します。統計には、ダネット補正を含む二元配置分散分析が使用されました。 b Ba/F3、Ba/F3-gp130、Ba/F3-gp130_IL-11R、Ba/F3-gp130:LIFR、Ba/F3-gp130:OSMR、Ba/F3-gp130:IL-11R:OSMRにおけるSTAT3活性化、 Ba/F3-gp130:IL-6R:LIFR、Ba/F3-gp130:LIFR:IL-11R 細胞、サイトカインなし (-)、および 50 ng/ml HIL-11、50 ng/ml IL-11 で刺激後、10 ng/ml LIF、10 ng/ml OSM、500 ng/ml GIL-11で15分間。等量のタンパク質 (50 μg/レーン) を、ホスホ STAT3 および STAT3 を検出する特異的抗体を介して分析しました。ウェスタンブロットデータは、3 つの実験のうちの 1 つの代表的な実験を示しています。

GIL-11 の転写プロファイルを評価するために、Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR 細胞を EC50 濃度 100 倍の GIL-11、IL-11、または LIF で 40 分間刺激し、シグナル伝達と比較性を最大限に高めました。トランスクリプトーム解析用。ベン図は、37 個の遺伝子が GIL-11、IL-11、および LIF によって少なくとも 1.5 倍上方制御されたことを示しています (図 3a、b)。興味深いことに、31 個の遺伝子は IL-11 および LIF によって少なくとも 1.5 倍上方制御されましたが、GIL-11 によっては上方制御されませんでした。合計で 52 個の遺伝子が IL-11 および/または LIF によって上方制御されましたが、GIL-11 によって上方制御されなかったことは、GIL-11 が IL-11 または LIF と比較して転写の減弱を引き起こすことを示唆しています。遺伝子オントロジー濃縮分析は、炎症反応または造血に関与するいくつかの遺伝子がGIL-11、IL-11およびLIFによって上方制御されていることを示しています（図3c、d）。総合すると、我々のデータは、GIL-11 の転写パターンが天然のサイトカイン IL-11 および LIF とはわずかに異なることを示しています。

ベン図は、天然または合成サイトカインによって活性化される遺伝子の重複を示しています。フィルター:誤検出率補正を含む p < 0.05。 |FC| 1.5以上。 b ヒートマップは、GIL-11 対未処理、IL-11 対未処理、および LIF 対未処理によって有意に増加した遺伝子を示します。スケールバーは対数倍数の変化を示します。フィルター:誤検出率補正を含む p < 0.05。 |FC| ≥ 1.5 GIL-11、LIF、IL-11 (c) および天然サイトカインのみ (d) によって活性化される一般的な遺伝子経路の遺伝子オントロジー分析。フィルター:誤検出率補正を含む p < 0.05。 |FC| 1.5以上。 X 軸: 共通の遺伝子経路に関与する遺伝子の数。遺伝子発現アクセッションコード: GSE226064。

次に、GIL-11 の品質と能力を決定するために用量依存的な増殖を実行しました。再度、GIL-11 は、500 ng/ml の最高適用濃度でも、gp130、gp130:IL-11R、gp130:LIFR、gp130:OSMR、gp130:IL-11R:OSMR を発現する Ba/F3 細胞の増殖を誘導しませんでした。一方、Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR細胞の増殖は明らかに用量依存性であり、EC50は1.44ng/mlであった(図4a;補足データ)。比較のために、LIFおよびIL-11のEC50は、Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR細胞上で0.074 ng/mlおよび0.72 ng/mlであると決定しました（図4b、c;補足データ）。 STAT3 および ERK のリン酸化を分析するために、Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR 細胞を、GIL-11、IL-11、および LIF の量を増加させて刺激しました。ウェスタンブロット法では、STAT3 および ERK のリン酸化を最大にするには 10 ～ 100 ng/ml の GIL-11 および IL-11 が必要であるのに対し、LIF の生物学的活性はより高く、STAT3 のリン酸化を最大にするには 0.1 ～ 1 ng/ml が必要であることが示されました（図.4d、補足図4）。 Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR 細胞における他の STAT の活性化に関しては、HIL-11、IL-11、OSM、LIF、およびGIL-11。 gp130 を介して、すべての IL-6 型サイトカインは STAT3 を効率的に活性化しますが、STAT1 と STAT5 はわずかな程度にすぎません。 LIF と OSM、STAT3 と STAT1、および STAT5 の場合、活性化が観察されました 38。ここで、すべてのサイトカインが持続的な STAT3 リン酸化を誘導しました。興味深いことに、HIL-11およびIL-11はSTAT1およびSTAT5リン酸化を誘導しませんでしたが、LIF、OSM、およびGIL-11もSTAT1リン酸化を誘導しました（図4e、補足図6;2c、d）。 STAT5 リン酸化は GIL-11 でのみ見られました。予想通り、どのサイトカインも STAT6 リン酸化を誘導しませんでした。次に、Ba/F3-gp130:LIFR:IL-11R 細胞を IL-11、LIF、GIL-11 で 5 ～ 240 分間刺激しました。 STAT3 のリン酸化はサイトカイン刺激の 5 分後に始まり、30 ～ 60 分後にピークに達します。 IL-11 および LIF で典型的に見られるように、STAT3 リン酸化は 120 ～ 240 分後に低下します。これはおそらく SOCS3 アップレギュレーションによるものと考えられます 39 (図 3b、トランスクリプトーム解析、10.5 倍の GIL-11、18.4 倍の IL-11 による SOCS3 アップレギュレーションを比較) 11、14.5倍LIF）、STAT3リン酸化の同じ制御がサイトカインGIL-11でも見られました（図4f、補足図7）。総合すると、GIL-11 の活性は前駆体サイトカイン IL-11 と同じ濃度範囲にあり、サイト III 転移による受容体要件の拡大が全体的な生物学的サイトカイン活性に影響を及ぼさないことが示されています。

a Ba/F3、Ba/F3-gp130、Ba/F3-gp130:IL-11R、Ba/F3-gp130:LIFR、Ba/F3-gp130:OSMR、Ba/F3-gp130:IL-11R:OSMRの増殖、Ba/F3-gp130:IL-6R:LIFR、Ba/F3-gp130:LIFR:IL-11R 細胞を、増加する濃度の GIL-11 (0.0005 ～ 500 ng/ml) の存在下および非存在下で観察しました。 b 増加する濃度のLIF（0.000025〜200 ng/ml）の存在下および非存在下でのBa/F3-gp130:IL-11R:LIFR細胞の増殖。 c 増加する濃度のIL-11（0.000025〜500 ng/ml）の存在下および非存在下でのBa / F3-gp130：IL-11R：LIFR細胞の増殖。 a – c エラーバーは±SEMを定義します。 3 つの生物学的複製のうち 3 つを使用した 1 つの代表的な実験を示します。 d サイトカインなし (-) および増加量の GIL-11 (1、10、100、1000 ng/ml)、LIF (0.1、 1、10、100 ng/ml）およびIL-11（1、10、100、1000 ng/ml）を15分間添加した。等量のタンパク質 (50 μg/レーン) を、ホスホ STAT3、STAT3、ERK、およびホスホ ERK を検出する特異的抗体を介して分析しました。ウェスタンブロットデータは、3 つの実験のうちの 1 つの代表的な実験を示しています。 e サイトカインなし (-) および 50 ng/ml HIL-11、50 ng/ml IL-11、10 ng/ml で刺激した後の Ba/F3-gp130:IL-11R:LIFR 細胞における STAT1,3,5,6 の活性化ml LIF、10 ng/ml OSM、500 ng/ml GIL-11で15分間。ホスホSTATおよびSTATを検出する特異的抗体を介して、等量のタンパク質(50μg/レーン)を分析しました。ウェスタンブロットデータは、3 つの実験のうちの 1 つの代表的な実験を示しています。 f サイトカインIL-11（200 ng / ml）、LIF（20 ng / ml）およびGIL-11（200 ng / ml）によるBa / F3-gp130：IL-11R：LIFR細胞の時間依存的なSTAT3活性化。示された時間。等量のタンパク質 (50 μg/レーン) を、ホスホ STAT3 および STAT3 を検出する特異的抗体を介して分析しました。

α受容体依存性サイトカイン IL-6 および IL-11 は、それぞれシグナル伝達受容体 gp130 および非シグナル伝達膜結合型 IL-6R または IL-11R を介して細胞を活性化します 37,40。ここで、ヘテロ二量体 gp130:LIFR 複合体と複合体を形成した膜結合 IL-11R を介した GIL-11 シグナルを示しました。膜結合型 IL-11R を介したシグナル伝達は、古典的シグナル伝達と呼ばれます。 IL-11R は、IL-11 と複合体を形成して、トランスシグナル伝達と呼ばれるプロセスで膜結合α受容体の発現を欠いている細胞を活性化する可溶性受容体としても存在します 37,40。ここでは、GIL-11がgp130およびLIFRを発現する細胞上で可溶性IL-11R（sIL-11R）と複合体を形成してトランスシグナル伝達をどの程度誘導するかを分析した。 Ba/F3-gp130:LIFR 細胞を、100 ng/ml の固定濃度の sIL-11R と漸増濃度の GIL-11 (2 ～ 2000 ng/ml) で刺激しました。比較のために、同じ固定濃度の sIL-11R と増加するサイトカイン濃度の IL-11 を使用しました。 IL-11のEC50は、100 ng/ml sIL-11Rでは71.6 ng/mlであったが（図5a；補足データ）、GIL-11はsIL-11Rを介して増殖をほとんど誘導しなかった。 2000 ng/mlのGIL-11濃度でさえ最大の細胞増殖に達するのに十分ではなかったため、EC50値を計算することはできませんでした（図5b;補足データ）。したがって、我々は、比較的高濃度の 1 μg/ml GIL-11 および 2 μg/ml sIL-11R で刺激した Ba/F3-gp130:LIFR 細胞における細胞内シグナル伝達を評価しました。ここで、GIL-11:sIL-11R 複合体は持続的な STAT3 活性化をもたらしました。 sgp130Fc は選択的 IL-6/IL-11 トランスシグナル伝達阻害剤であり、IL-6/IL-11 トランスシグナル伝達よりも少なくとも 100 ～ 1000 倍低い効率で LIF シグナル伝達を阻害します 40,41。次に、sgp130FcがGIL-11トランスシグナル伝達を阻害するかどうかを試験しました。図5c、補足図8に示すように、sgp130Fc（10μg/ml）は、BaにおけるGIL-11（1μg/ml）：sIL-11R（2μg/ml）トランスシグナル伝達によって誘導されるSTAT3リン酸化を阻害しなかった。 /F3-gp130：LIFR細胞（図5c、補足図8）。 Ba/F3-gp130:LIFR 細胞の場合、GIL-11 (0.5 μg/ml) または IL-11 (0.5 μg/ml) と sIL-11R (1 μg/ml) の濃度は、トランス結合による細胞増殖を可能にするように選択されました。合図中。濃度を増加させながらsgp130Fcの滴定を行うと、IL-11トランスシグナル伝達が阻害されました（IC50 = 22.5 ng/ml、図5d;補足データ）が、最高濃度の10μg/ml sgp130FcでさえGILを阻害できませんでした。 -11 トランスシグナリング。原則として、GIL-11 は、IL-11 と比較して効率ははるかに低いものの、トランスシグナル伝達を介してシグナル伝達することができます。 LIF と同様に、GIL-11 トランスシグナル伝達は、少なくとも IL-11 トランスシグナル伝達をブロックするのに十分な条件下では、sgp130Fc によって阻害されません 37,40,41。図2aに示すように、Ba/F3-gp130:LIFRおよびBa/F3-gp130:IL-11Rの増殖は、それぞれLIFおよびIL-11によって誘導されましたが、GIL-11によって誘導されませんでした。しかし、GIL-11がBa/F3-gp130:IL-11R細胞上のIL-11R:gp130に結合してIL-11シグナル伝達をブロックすること、またはBa/F3-gp130:LIFR細胞上のLIFRに結合してLIFをブロックすることを除外することはできなかった。合図中。 Ba/F3-gp130:IL-11R と IL-11 および GIL-11、および Ba/F3-gp130:LIFR と LIF および GIL-11 に対してサイトカイン共インキュベーションを使用しても、20 ℃でも細胞増殖の阻害は生じませんでした。 GIL-11の質量濃度はIL-11の4倍過剰であり、GIL-11はLIFの200倍過剰であった（図5e；補足データ）。我々は、GIL-11は少なくとも試験した濃度範囲ではIL-11およびLIFシグナル伝達を干渉しなかったと結論づけた。

a 固定濃度のsIL-11R（0または100 ng/ml）および漸増濃度のIL-11（1〜2000 ng/ml）の存在下および非存在下でのBa/F3-gp130:LIFR細胞の増殖。 3 つの実験のうちの 1 つの代表的な実験を示します。 b 固定濃度のsIL-11R（0または100 ng/ml）および増加濃度のGIL-11（1〜2000 ng/ml）の存在下および非存在下でのBa / F3-gp130:LIFR細胞の増殖。 3 つの実験のうちの 1 つの代表的な実験を示します。 c サイトカインなし (-) および HIL-11 (50 ng/ml)、GIL-11 (1 μg/ml)、GIL-11 (1 μg/ml) による刺激後の Ba/F3-gp130:LIFR 細胞における STAT3 活性化:sIL-11R (2 μg/ml)、GIL-11 (1 μg/ml):sIL-11R (2 μg/ml):sgp130Fc (10 μg/ml) を 15 分間。等量のタンパク質 (50 μg/レーン) を、ホスホ STAT3 および STAT3 を検出する特異的抗体を介して分析しました。ウェスタンブロットデータは、3 つの実験のうちの 1 つの代表的な実験を示しています。 d 固定濃度のIL-11（0.5μg/ml）：sIL-11R（1μg/ml）またはGIL-11（0.5μg/ml）の存在下および非存在下でのBa/F3-gp130：LIFR細胞の増殖： sIL-11R (1 μg/ml) および増加する濃度の sgp130Fc (1 ～ 10,000 ng/ml)。 3 つの実験のうちの 1 つの代表的な実験を示します。 e 固定濃度のLIF（10 ng/ml）および増加濃度のGIL-11（1〜2000 ng/ml）の存在下および非存在下でのBa / F3-gp130:LIFR細胞の増殖（緑色）。固定濃度の IL-11 (100 ng/ml) および増加濃度の GIL-11 (1 ～ 2000 ng/ml) の存在下および非存在下での Ba/F3-gp130:IL-11R 細胞の増殖 (赤)。エラーバーは±SEMを定義します。 3 つの生物学的複製のうち 3 つを使用した 1 つの代表的な実験を示します。

ヒト IL-11 と LIF はマウスと男性の間で交差反応性があります 42、43、44。我々は、ヒト GIL-11 がマウス gp130:IL-11R:LIFR 鎖を発現するマウス細胞も活性化するかどうかを分析しました。我々はマウス筋芽細胞株 C2C12 を選択しました。 C2C12細胞をヒトHIL-11(200ng/ml)、ヒトIL-11(200ng/ml)、ヒトLIF(10ng/ml)およびGIL-11(200ng/ml)で刺激した。 HIL-11およびLIFは持続的なSTAT3リン酸化を誘導しましたが、IL-11およびGIL-11は誘導しませんでした。これは、C2C12細胞がgp130およびLIFRを発現しているが、IL-11Rの発現が欠如していることを示唆しています（図6a、補足図9）。マウスIL-11R cDNAをコードするプラスミドをC2C12細胞にトランスフェクトしました。その結果、mIL-11R発現が生じ、STAT3リン酸化によって示されるように、これらの細胞がIL-11およびGIL-11に応答するようになります（図6a、補足図9）。また、マウス胎児線維芽細胞系NIH/3T3を1、10、100、および1000 ng/mlのヒトGIL-11、IL-11および0.1、1、10、および100 ng/mlのLIFで刺激しました。これらの細胞はgp130、LIFR、およびIL-11R45を発現するため、ウェスタンブロッティングで示されるように、LIFおよびIL-11はNIH / 3T3でSTAT3リン酸化を誘導しました（図6b、補足図10）。用量依存的な細胞刺激により、マウス NIH/3T3 で持続的な STAT3 リン酸化を達成するには 10 ～ 100 ng/ml の GIL-11 と IL-11 が必要であることが示されました。次に、5、10、20 μg の GIL-11 を野生型マウスに腹腔内注射しました。注射の30分後、マウスを屠殺し、心臓、肝臓および脾臓の組織を取り出した。ウェスタンブロッティングによるSTAT3リン酸化の分析により、少なくとも10μg/マウスのGIL-11が心臓、肝臓および脾臓における持続的なSTAT3リン酸化を誘導するのに十分であることが示された（図6c、補足図11）。総合すると、我々のデータは、ヒト GIL-11 がマウス受容体の組み合わせ gp130:IL-11R:LIFR を活性化することを実証しました。

a トランスフェクトされていないマウス IL-11R をコードする cDNA でトランスフェクトされたマウス筋芽細胞 (C2C12) でサイトカインなし (-)、および HIL-11 (200 ng/ml)、IL-11 (200 ng/ml) で刺激した後の STAT3 活性化）、LIF（10 ng/ml）、GIL-11（200 ng/ml）を15分間。等量のタンパク質 (50 μg/レーン) を、ホスホ STAT3 および STAT3 を検出する特異的抗体を介して分析しました。ウェスタンブロットデータは、3 つの実験のうちの 1 つの代表的な実験を示しています。 b サイトカインなし (-) および増加量の GIL-11 (1、10、100、1000 ng/ml)、LIF (0.1、1、10、100 ng/ml) による刺激後のマウス線維芽細胞 NIH/3T3 における STAT3 活性化IL-11 (1、10、100、1000 ng/ml) を 20 分間添加。等量のタンパク質 (50 μg/レーン) を、ホスホ STAT3 および STAT3 を検出する特異的抗体を介して分析しました。ウェスタンブロットデータは、3 つの実験のうちの 1 つの代表的な実験を示しています。 c 5、10または20μg/mlのGIL-11注射後の心臓、肝臓および脾臓におけるSTAT3活性化。腹腔内サイトカイン注射の30分後にマウスを屠殺した。等量のタンパク質 (50 μg/レーン) を、ホスホ STAT3 および STAT3 を検出する特異的抗体を介して分析しました。ウェスタンブロットデータは、3 つの実験のうちの 1 つの代表的な実験を示しています。

インターロイキン-6 (IL-6) は、肝部分切除術 (PHX) 後の肝臓の再生に決定的に関与しています。 IL-6-/- および IL-6R-/- マウスの死亡率は、野生型マウスの 10% に対して 40 ～ 80% と高く、STAT3 リン酸化の減少と肝細胞の増殖の減少を伴います 27,46,47,48,49 ,50はPHXに続きました。我々は以前、手術の24時間前と直後にハイパーIL-6（HIL-6）を注射すると、肝部分切除術後のマウスが死亡から救われたことを示した51。ここでは、IL-6R-/- マウスに PHX の 24 時間前と直後に 10 μg/マウスの GIL-11 を注射しました。 PHX 9 日後の IL-6R-/- マウスの全生存率は約 40% でしたが、GIL-11 を 2 回注射した IL-6R-/- マウスの生存率は 90% でした（図 7a; 補足）データ）。以前に見られたように27、PHXの9日後の体重は、GIL-11またはPBSを注射されたかどうかに関係なく、生存しているIL-6R-/-マウスで変化しなかったが、体重に対する肝臓重量の比はわずかに減少した（図7b、c；図7b、c;補足データ）。しかし、本発明者らは、未治療のIL-6R-/-マウスはGIL-11治療IL-6R-/-マウスと比較して脾臓重量が大きいことに気づいた(図7d;補足データ)。遺伝子発現分析により、PHX直後の未治療のIL-6R-/-マウスと比較して、GIL-11で治療されたIL-6R-/-マウスでは線維化マーカーαSMAおよび急性期応答遺伝子SAA1の発現の増加が示されました（図7e;補足データ）。。総合すると、我々のデータは、GIL-11が肝部分切除後のIL-6R-/-マウスを死から救ったことを示した。

a IL-6R-/- マウスに 70% PHX を施し、手術の 24 時間前および直後に PBS (n = 11) または GIL-11 (n = 11) を各 20 μg 注射し、生存率を 9 日間モニタリングしました。日々。 b 70％PHX後にGIL-11の有無で処理したIL-6R-/-マウスの体重を、PHXの12日後に測定した（n = 4未処理、n = 5 GIL-11）。 c 70％PHX後にGIL-11の有無で処理したIL-6R-/-マウスの肝臓/体重比を、PHX後9日目に決定しました（n = 5未処理、n = 7 GIL-11）。 d 70％PHX後にGIL-11の有無で処置したIL-6R-/-マウスの脾臓重量をPHX後9日目に測定した（n = 未処置、n = 7 GIL-11）。 e GIL-11の有無にかかわらず事前に処理したIL-6R-/-マウスのPHX直後に肝臓から総RNAを抽出し、aSMA、SAA1、Ki67、EGF、CycA2およびG0S2のmRNAレベルを定量的PCRによって決定しました（n = 6)。 b–e 各ドットは 1 匹のマウスから得られたデータを表します。エラーバーは±SEMです。

私たちの実験により、マウスからヒトへの種間特異性を持つ非天然gp130:IL-11R:LIFR複合体を介して、家族に典型的なJAK/STATシグナル伝達と細胞増殖を誘導するヒトキメラデザイナーサイトカインが明らかになりました。サイトIIIがLIFからIL-11に交換されると、これまで自然界では見られなかった受容体結合特性を備えたサイトキメラGIL-11が生成されます。 CNTF のサイト III を含む IL-6 足場に基づくプロトタイプのサイトキメラ IC7 は、GIL-113 の青写真として機能しました。 IC7 および GIL-11 は、IL-6 型サイトカインファミリー内の全体的な足場が、一般的なモジュール構造により交換可能であることを明らかにしました。移転はサイトIIIに限定されているため、サイトIとサイトIIの移転も実現可能かどうかはまだ分からない。この種のものとしては 2 番目の GIL-11 には、IC7 とは異なる独自の機能があります。まず第一に、IC7 は受容体複合体 gp130:IL-6R:LIFR をリクルートしますが、GIL-11 は gp130:IL-11R:LIFR を組み立てます。これは、IL-11R を発現する細胞のみが GIL-11 の標的となることを意味します。これは、生体内での細胞特異性に関して重要な問題である可能性があります。一般的なβ受容体 gp130 は遍在的に発現しますが、LIFR およびα受容体の発現は制限されているため、より細胞型に特異的です。主に免疫細胞や肝細胞に見られる IL-6R とは異なり 52,53、膜結合型 IL-11R の分布は心筋細胞 55、線維芽細胞 56 および上皮細胞 57 を含めてよりバランスがとれているようです 54。

α 受容体 IL-6R、IL-11R、および CNTFR は発現プロファイルが限られているため、細胞特異性の第 2 層を与えます 6。我々は、合成複合体の動員により最終的に細胞特異性の機能獲得がもたらされ、それによって合成生物学におけるデザイナーサイトカインの生体内応用において有益な効果が促進され、悪影響が軽減される可能性があると仮説を立てています。注目すべきことに、IC7Fcは代謝経路を選択的に活性化し、マウスの脂肪変性の予防を伴う脂肪酸酸化の増加、体重減少を伴うエネルギー散逸の増加、筋肥大および除脂肪体重の維持と骨安定性の向上をもたらします17。 IL-6 や CNTF とは対照的に、IC7 注射は、過剰な炎症反応を促進することなく、マウスと非ヒト霊長類マカクの両方において安全であることが証明されています 3,17,58。

さらに、IL-11はgp130ホモ二量体を動員するのに対し、両方ともgp130およびLIFRヘテロ二量体を動員して活性化するため、GIL-11のトランスクリプトームプロファイルはLIFでカバーできると想定された。興味深いことに、GIL-11 は IL-11 と LIF の間でより作用しましたが、程度は弱められました。リガンド-受容体複合体の幾何学的形状と親和性が、特定のIL-6型サイトカインの機能的多様性を説明している可能性があることが提案されている59。一部の遺伝子発現に対する GIL-11 の能力の欠如は有益である可能性があります。 Smad7 は TGF-β シグナル伝達の負の制御因子であり、クローン病 (CD) や潰瘍性大腸炎 (UC) を含む炎症性腸疾患 (IBD) の病因に関与していると考えられ、腸の炎症を媒介します 60。 MyD88 の過剰発現は心機能を低下させ、心血管性自己免疫疾患の一因となることが示されています 61,62,63。 Arid5a はサイトカインストームに寄与すると考えられています。それとは別に、Arid5a-/- マウスはエンドトキシンショック、ブレオマイシン誘発性肺損傷、および炎症性自己免疫疾患に対して抵抗性です64。

第二に、天然サイトカイン IC7、IL-6、および CNTF は、gp130 および LIFR3 に結合する前にα受容体結合に依存しています。これは、IC7 における CNTF 由来の結合部位 III の形成が、次のように IL-6R 結合の直接的な結果であることを意味します。 CNTF が CNTFR に結合した後。この状況は GIL-11 では異なります。ここで、我々は、LIFのα受容体非依存性結合部位IIIをα受容体依存性IL-11に導入した。ここに示すように、GIL-11 は、非シグナル伝達性 IL-11R に結合した後にのみ gp130:LIFR 受容体複合体を活性化します。さらに、GIL-11は、Ba/F3-gp130:LIFR細胞上のLIFシグナル伝達を阻害できなかったが、IL-11Rの非存在下でGIL-11がLIFRに結合できるのであれば、そうなるはずである。まとめると、私たちの実験は、LIF-サイトIIIのLIFRへの元の結合部位コンテキストはα受容体非依存性であるにもかかわらず、IL-11足場へのLIF-サイトIIIの再フォーマットによりLIF-サイトIIIの結合がα受容体依存性になることを示しました。。したがって、正確な結合部位 III のアミノ酸組成ではなく、部位 I と部位 III のαヘリックスシフトによって媒介される相互結合によって、サイトカインがα受容体依存性か非依存性かを定義します65。

生物学的活性に関して、GIL-11 (EC50: 1.44 ng/ml) は IL-11 (EC50: 0.72 ng/ml) に匹敵しますが、LIF (EC50: 0.074 ng/ml) よりも有効性が劣ります。これは、LIF からのマイナーなサイト III 交換効果ではなく、IL-11 の主要な足場効果に基づいている可能性があります。しかしながら、このアミノ酸交換はIL-11R66に対するIL-11の親和性を高めることが知られているため、GIL-11の生物活性は部位I D186A変異によって増加する可能性がある。 α受容体へのサイトカインの結合を改善することは、CNTFからCNTFR67へ、およびIL-6からIL-6R68についても示されているように、このサイトカインファミリーの全体的な活性を改善するための一般的な戦略です。

GIL-11の生物学的活性および独特の受容体組成を特徴付けた後、IL-6R-/-マウスにおけるPHX後の肝臓再生中にIL-6を機能的に置換するGIL-11の能力を調査した。我々および他の研究者は、IL-6 および IL-6R が PHX 後の肝臓再生に決定的に関与しており、その結果、IL-6R-/- マウスの死亡率が高くなるということを以前に示しました 27、46、47、48、49、50。重要なことに、HIL-6 は肝部分切除術後のマウスを死から救い出しました 51。さらに、野生型マウスでは、IL-6 単独ではなく、IL-6 と可溶性 IL-6R (sIL-6R) を組み合わせて注射すると、PHX69 後の肝臓再生が促進されます。おそらく肝細胞は IL-6R よりも多くの gp130 を発現するため、IL-6 と sIL-6R の存在が増加すると、IL-6 単独と比較して gp130 の活性化が増加し、IL-6 シグナル伝達が強力になります 70。最後に、sgp130Fc による IL-6 トランスシグナル伝達の遮断により、PHX27 後の死亡率が増加します。機構的には、IL-6 トランスシグナル伝達が肝星細胞による肝細胞増殖因子 (HGF) 産生を誘導し、PHX27 後の肝臓再生に直接寄与しました。この研究で使用したIL-6R-/- マウスはIL-6Rの発現が欠如しているため、古典的シグナル伝達とトランスシグナル伝達の両方が無効になっています。したがって、野生型マウスの死亡率は 10% であるのに対し、マウスは 90% です 27。 GIL-11 治療と HIL-6 の決定的な違いは、GIL-11 は gp130:IL-11R:LIFR を発現する細胞のみを標的とするため、体内の潜在的な標的細胞の範囲が制限されるのに対し、HIL-6 はほぼすべての細胞を標的とすることです。なぜなら、IL-11R や LIFR とは異なり、gp130 は遍在的に発現していると考えられているためです 71。しかし、IL-11R、LIFR、およびgp130は肝細胞上で発現しているため、GIL-11はIL-6トランスシグナル伝達を補うことができ、PHX後のIL-6R-/-マウスを死亡から救った。興味深いことに、体、肝臓、脾臓の重量を含むほとんどのパラメータは、生存しているGIL-11治療マウスと未治療マウスで変化しませんでした。しかし、GIL-11 は、PHX 後 9 日でも SAA1 を 300 倍以上増加させます。 SAA1 は肝星細胞の増殖を誘導し 72、GIL-11 適用後の肝再生に寄与する可能性があります。

一般的な in vitro および in vivo 活性を示したので、IC7 を含む IL-6 型サイトカインが有益な効果を示す症状に対して GIL-11 が共通の関心を引くと考えられます 73。最近、当初記載されていたヒト疾患のマウスモデルにおけるヒト IL-116 の有益な効果が疑問視されています。マウスに注射されたヒト IL-11 の作用機序は、実際には内因性 IL-11 シグナル伝達の競合阻害に依存していると述べられています 26。 IL-11 は、非アルコール性脂肪性肝炎、心血管線維症、特発性肺線維症、線維性肺疾患などのさまざまなマウス疾患モデルにおいて、有益な効果よりむしろ有害な効果があると結論付けられました 26。興味深いことに、IL-11 は ERK シグナル伝達を優先的に誘導し、同じ gp130 ホモ二量体である STAT3 リン酸化を介して作用する IL-6 とは異なり、優先的に誘導すると考えられていました 26。したがって、マウス筋芽細胞 (C2C12 細胞) をマウス IL-11R の存在下および非存在下で組換え HIL-11、IL-11、および GIL-11 で処理しましたが、結果として IL-11R 依存性の STAT3 リン酸化が持続しました。 GIL-11をマウスに注射すると、心臓、肝臓、脾臓の組織でもSTAT3リン酸化が持続し、ヒトサイトカインとGIL-11がSTAT3リン酸化を特徴とする標準的なgp130およびgp130:LIFRシグナル伝達経路を活性化することが実証されました。理由は不明であり、IL-11とは異なり、GIL-11はGIL-11:sIL-11R複合体を介したトランスシグナル伝達の誘導が弱いだけであり、sgp130Fcによって阻害されない。線維性疾患のマウスモデルに GIL-11 を適用するとどのような結果が得られるかを見るのは興味深いでしょう。

LIF は生殖能力や多発性硬化症を含む一連の神経疾患に関連していますが、組換え LIF は治療法としては使用されていません 74,75。 gp130:LIFR複合体を介してLIF様シグナル伝達を誘導するGIL-11の能力は、組換えhLIFの潜在的な代替物としてLIF様の応用を開く可能性がある。 GIL-11 の活性には LIFR だけでなく IL-11R を発現する細胞も必要であるため、GIL-11 の活性は LIF と比較して限られた数の標的細胞に限定され、これにより潜在的な望ましくない負の副作用が軽減される可能性があります。

結論として、我々の研究は、我々の知る限りでは、GIL-11を、非天然受容体gp130:LIFR:IL-11R複合体の特異的高親和性活性化を有する新規で有望なサイトキメラであると定義している。サイトキメラのモジュール構造は一般に、広範囲の標的受容体の組み合わせと細胞の標的化を可能にします。

GIL-11 をコードする cDNA は、BioCat GmbH によって注文されました。これは、コドンが最適化され、ヒト IL-11 および LIF に基づいています。次に、GIL-11 cDNA を、ヒト IL-11R の 5' シグナルペプチド (Q14626、aa 1 ～ 24)、続いて myc タグの配列 (EQKLISEEDL) および GIL-11 をコードするフラグメントを含む pcDNA3.1 発現ベクターに挿入しました。 Gly4Ser リンカー、TEV 認識サイト、およびツインストレプトタグ。

タンパク質モデルは、Phyre2 Web ポータルを介して生成されました76。複雑なモデルと構造ベースの配列アラインメントは、NIH P41-GM10331177 の支援を受けて、カリフォルニア大学サンフランシスコ校のバイオコンピューティング、可視化、および情報学のリソースによって開発された UCSF キメラバージョン 1.13.1 を使用して生成されました。

Ba/F3-gp130、Ba/F3-gp130:IL-6R、および Ba/F3-gp130:IL-11R 細胞の生成は、他の場所に記載されています 35,36。パッケージング細胞株 Phoenix-Eco は、Ursula Klingmüller (DKFZ、ハイデルベルク、ドイツ) から入手しました。 NIH/3T3 細胞は、Leibnitz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Culture (ブラウンシュヴァイク、ドイツ) から購入しました。すべての細胞は、10% ウシ胎児血清 (GIBCO) を含むダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) 高グルコース培地 (GIBCO®、Life Technologies、ダルムシュタット、ドイツ) 中で水飽和雰囲気中、5% CO2、37 °C で増殖させました。 ®、Life Technologies）、60 mg/l ペニシリンおよび 100 mg/l ストレプトマイシン（Genaxxon Bioscience GmbH、ウルム、ドイツ）。マウス Ba/F3-gp130 細胞は Immunex (シアトル、ワシントン州、米国) から入手し、HIL-6 の存在下で増殖させました。上清中に HIL-6 を分泌する CHO-K1 細胞の安定したクローンからの 0.2% (10 ng/ml) ならし培地 78。 Expi-293F™ 細胞 (ThermoFisher Scientific) は、125 rpm のオービタルシェーカー上、8% CO2 を含む 37 °C インキュベーター内で、抗生物質を含まない Expi293™ 発現培地で 3 ～ 5 × 106 c/ml の密度に達するまで培養されました。合成リガンドは、記載されているように発現および精製されました79。組換えヒト OSM (カタログ番号 295-OM) および組換えヒト LIF (カタログ番号 7734-LF) は、R&D Systems (米国ミネソタ州ミネアポリス) から購入しました。 IL-11の発現には、IL-11の発現プラスミドpET22-IL-11-His6を使用した。 IL-11 は大腸菌内で可溶性タンパク質として発現され、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製されました。 Sgp130FCをExpiCHOTM細胞(ThermoFisher Scientific)で発現させた。細胞を ExpiCHOTM 培地で培養し、販売元のマニュアル (カタログ番号: A29133) に従ってトランスフェクトしました。タンパク質は前述のように精製されました80。

Ba/F3-gp130 細胞株を PBS で 3 回洗浄してサイトカインを除去し、無血清 DMEM 中で 3 時間飢餓状態にしました。阻害剤 sgp130Fc または sIL-11R を刺激の 5 分前に添加しました。細胞を精製タンパク質（濃度は示したとおり）で15分間（または示したとおり）刺激し、回収し、液体窒素中で凍結し、その後溶解した。 C2C12およびNIH/3T3細胞の場合、細胞をPBSで刺激後1回洗浄した後、0.05%トリプシン、0.1%EDTA(Genaxxon、カタログC4261.0100)で5分間処理して剥離し、再度洗浄した。細胞を、10 mM Tris-HCl、pH 7.5、150 mM NaCl、0.5 mM MgCl2、および cOmplete、EDTA フリープロテアーゼ阻害剤混合錠剤 (Roche Diagnostics、マンハイム、ドイツ) を含む緩衝液で 45 分間溶解しました。タンパク質濃度は、製造業者の指示に従ってBCAタンパク質アッセイ(Thermo Fisher Scientific)によって測定した。次に、タンパク質の発現と経路の活性化をウェスタンブロッティングによって分析しました。

50 マイクログラムの総タンパク質を各レーンにロードし、還元条件下で SDS-PAGE によって分離し、ニトロセルロース膜 (Amersham Protan; Cytiva; LC, UK; カタログ番号 10600016) に転写しました。膜のブロッキングは、TBS (10 mM Tris-HCl pH 7.6、150 mM NaCl) で 1:3 に希釈したブロッキングバッファー (Intercept® Blocking Buffer; LI-COR; USA; カタログ番号 927-60001) で 1 時間実行しました。一次抗体 (Phospho-STAT3; Tyr-705; D3A7; カタログ番号 9145、STAT3; 124H6; カタログ番号 9139、Erk1/2; L34F12; カタログ番号 4696、Phospho-Erk1/2; D13.14.4E; カタログNo. 4370、Cell Signaling Technology、USA を、0.2% Tween-20 (Sigma-Aldrich; USA; カタログ番号 P1379-1L) を含むブロッキング緩衝液で 1:1000 に希釈し、周囲温度で少なくとも 90 分間、または 4°で一晩処理しました。 C. メンブレンを TBS-T (0.1% Tween-20) で洗浄し、蛍光団結合二次抗体 (IRDye® 800CW Donkey anti-Rabbit、カタログ番号 926-32213 および IRDye® 680RD Donkey anti-Rabbit) と 1:10,000 でインキュベートしました。マウス;カタログ番号 926-68072、LI-COR; USA) を 1 時間シグナル検出は、LI-COR Odyssey; USA; Model 2800) を使用して達成されました。二次抗体は異なるチャネルで同時に検出されました。データ分析は Image Studio Lite 5.2 を使用して実行されました。肝臓、脾臓および心臓組織を溶解バッファー (50 mM Tris-HCl pH 7.5、150 mM NaCl、2 mM EDTA pH 8.0、2 mM NaF、1 mM Na3VO4、1% NP-40、1% Triton X-100) で溶解しました。、cOmplete プロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット 1 個）。溶解後、BCA アッセイによりタンパク質含有量を測定しました。次いで、総タンパク質量50マイクログラムを各ラインにロードし、続いて免疫ブロッティングを行った。溶解した動物臓器のブロッティングに使用した抗体は次のとおりです:抗p-STAT3 (カタログ番号9145)、抗トータルSTAT3 (カタログ番号9139)。

Ba/F3-gp130細胞株をPBSで3回洗浄して、培地からサイトカインを除去した。 5 × 104 細胞/ml の密度の細胞を、10% ウシ胎児血清、60 mg/l ペニシリン、および 100 mg/ml ストレプトマイシンを含む DMEM に懸濁しました。示された濃度のサイトカインまたは阻害剤の存在下または非存在下で、細胞を 100 μl の容量で 3 日間培養しました。 CellTiter Blue Viability Assay (Promega、カールスルーエ、ドイツ) を使用して、Infinite M200 Pro プレートリーダー (Tecan、Crailsheim、ドイツ) を使用して蛍光 (λex560 nm/λem590 nm) を測定することにより、生存細胞のおおよその数を決定しました。 20 μl/ウェルの CellTiter Blue 試薬を添加した後 (時点 0)、60 分後に 20 分ごとに最長 2 時間蛍光を測定しました。実験の各条件について、3 つのウェルが測定されました。すべての値は、最終測定値から時点 0 の値を差し引くことによって正規化されました。

Ba/F3-gp130 細胞株に、記載されているように pMOWS 発現プラスミドをレトロウイルスで形質導入しました 34。形質導入された細胞を、10ng/mlのHIL-6を補充した上記のDMEM培地中で増殖させた。形質導入されたBa/F3-gp130細胞の選択は、ピューロマイシン(1.5μg/ml)またはハイグロマイシンB(1mg/ml)(Carl Roth、カールスルーエ、ドイツ)を用いて少なくとも2週間実施した。その後、生成された Ba/F3-gp130 細胞株をフローサイトメトリーによって受容体細胞表面発現について分析しました。 C2C12細胞を、mIL-11R cDNAをコードする7.5μgのpcDNA3.1プラスミドおよび15μlのTurboFectによってトランスフェクトし、48時間インキュベートした。

安定的にトランスフェクトされたBa/F3-gp130細胞株の細胞表面発現は、特異的抗体によって検出されました。 5 × 105 個の細胞を FACS バッファー (PBS、1% BSA) で洗浄し、指定された特定の一次抗体 (抗 LIFR または –OSMR; 1:20; カタログ番号 BAF249 および BAF4389、 R&D Systems、米国ミネソタ州）。室温で少なくとも1時間インキュベートした後、細胞を洗浄し、二次抗体(NorthernLights 493結合抗ヤギIgG 1:200)を含む50μlのFACS緩衝液に再懸濁し、室温で30分間インキュベートした。細胞を洗浄し、500μlのFACS緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリー(FACSDivaソフトウェアを使用するBD FACSCanto IIフローサイトメーター、BD Biosciences)によって分析した。データ分析は、FlowJo Version 10 (Tree Star Inc, USA) を使用して実施されました。

C57BL/6 マウスと IL-6R-/- マウス 52 は、それぞれ、ジャクソン研究所とデュッセルドルフのハインリッヒハイネ大学の動物施設から入手しました。この研究の実験は、承認番号 84-02.04.2019.A303 を持つドイツの LANUV-NRW の要件に従って実施されました。

Ba/F3-gp130-IL-11R:LIFR 細胞を、GIL-11、IL-11、または LIF で 37 °C で 40 分間刺激しました。 mRNAは、ベンダーのマニュアルに従ってNucleoSpin RNA (Macherey-Nagel、デューレン、ドイツ; カタログ番号740955.250) で単離しました。 3'-RNA-Seq 分析に使用される DNase 消化されたトータル RNA サンプルは定量され (Qubit RNA HS アッセイ、Thermo Fisher Scientific)、フラグメントアナライザーと「トータル RNA 標準感度アッセイ」(Agilent Technologies, Inc) を使用したキャピラリー電気泳動によって品質が測定されました。 .米国サンタクララ）。この研究のすべてのサンプルは、非常に高品質の RNA 品質数値 (RQN; 平均 = 10.0) を示しました。ライブラリーの調製は、Lexogen(登録商標)のQuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit FWDを使用して、製造業者のプロトコールに従って実施した。投入量は 200 ng の全 RNA でした。ビーズ精製ライブラリーは正規化され、最終的に SR 1 × 100 bp の読み取り設定を備えた NextSeq2000 システム (Illumina Inc. サンディエゴ、米国) で配列決定されました。 Illumina DRAGEN FASTQ Generation ツール (バージョン 3.8.4) は、アダプターのトリミングと逆多重化のために、bcl ファイルを fastq ファイルに変換するために使用されました。遺伝子オントロジー分析は、r パッケージclusterprofiler および r バージョン 4.1.3 を使用して実行されました。

すべてのマウスは特定の病原体のない条件下で飼育され、FELASA および国家動物福祉団体 GV-SOLAS (www.gv-solas.de) によって定められた規制に従って扱われました。すべてのトランスジェニック動物は、C57BL/6 N バックグラウンドを持っていました。マウスには標準的な実験食を与え、オートクレーブ処理した水道水を自由に与えた。それらは、温度（20〜24℃）、湿度（45〜65％）、昼夜サイクル（12時間明、12時間暗）が制御された空調された部屋に保管されました。開腹術は、イソフルラン吸入ナルコーシス 1.5 ～ 2% イソフルランと 1 l/min 酸素を使用して、主に少なくとも 10 ～ 12 週齢の雄マウスに実施されました 81。 70％部分肝切除術を行うために、肝臓の右上葉、左上葉、および左下葉を胆嚢とともに、5-0ポリエステル縫合糸（B. Braun Surgical、SA、Rubi）を使用したワンステップ結紮により切除しました。、スペイン）。その後、腹腔と皮膚の外層を 5-0 ポリグリコール酸 (HR13、B. Braun Surgical、SA、Rubi、スペイン) と 4-0 ポリプロピレンモノフィラメント (DS16、B. Braun Surgical、SA、Rubi、スペイン）それぞれ。手術による軽度の痛みを軽減するために、手術後にマウスを5 mg/kgのカルプロフェン(Rimadyl; Pfizer、Wurselen、Germany)で処理した。 IL-6R-/- マウスに70%の部分肝切除術を施した。手術後の特定の時点 (0、12、および 24 時間) でマウスの体重を量り、麻酔をかけました (100 mg/kg ケタミン、10 mg/kg キシラジン; Vetoquinol GmbH、ラーベンスブルク、ドイツ)。さらなる分析のための血清を生成するために、麻酔時にマウスから採血した。肝臓組織の場合、肝臓をリン酸緩衝食塩水（PBS）ですすぎ、体重に対する肝臓重量の比を計算するために重量を測定し、組織サンプルは組織学およびRNAおよびタンパク質の抽出のために-80℃で保存しました。

GIL-11は、製造業者のマニュアルに従ってExpi293細胞(Thermo Fisher)によって産生および分泌され、Strep-Tagアフィニティークロマトグラフィー(Strep-TactinXT 4flow; IBA、カタログ番号2-5023-001)によって精製された。サイトカインシグナル伝達を強制するために、手術の24時間前および直後にマウスに20μgのGIL-11を腹腔内(ip)注射した。

Trizol (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を使用して、肝臓と脾臓から全 RNA を抽出しました。 RNA 濃度は NanoDrop 2000c 分光光度計 (Thermo Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム、カタログ番号 172-5140) で測定し、すべてのサンプルで 100 ng/μl に調整しました。特定の遺伝子の発現を測定するために、iTaqTM Universal SYBR green One-Step Kit (BioRad、カリフォルニア、米国、カタログ番号 1725151) を使用しました。マスターミックスは製造業者の指示に従って調製されました。 5μlのiTaqユニバーサルプローブ反応ミックス(2×)、0.125μlのiScriptアドバンスト逆転写酵素、0.125μlのプライマーおよび200ngのRNAを使用した。次に、ヌクレアーゼフリーの H2O を加えて混合物の総量を 10 μl に調整しました。分析のために、すべての標的遺伝子の発現レベルをグリセルアルデヒド 3-リン酸デヒドロゲナーゼ (gapdh) 発現 (ΔCT) に対して正規化しました。遺伝子発現値はΔΔCt法に基づいて計算した。相対量 82 は、RQ = 2−ΔΔCt という式を使用して決定されました。標的遺伝子の発現レベルは、ABI 7500 リアルタイム PCR システム (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) によって測定されました。この研究では次のプライマーペアを使用しました: GAPDH fw 5' TCCCACTCTTCCACCTTCGA、GAPDH rev 5' AGTTGGGATAGGGCCTCTCTT、SAA1 fw 5' GACACCATTGCTGAGCAGGAA、SAA1 fw 5' GGGAGTCCAGGAGCTCTGTAG、Ki67 fw 5' GCCGAGTCTGGCATTGAA、Ki67 rev 5' TTTTCTT TCTTCTTTTGCTGAGG、EGF fw 5' TTCTCACAAGGAAAGAGCATCTC、EGF rev 5' GTCCTGTCCCGTTAAGGAAAAC、Cyclin A2 fw 5' GAGGTGGGAGAAGAATATAA、Cyclin A2 rev 5' ACTAGGTGCTCCATTCTCAG、G0S2 fw 5' TCTCTTCCCACTGCACCCTA、G0S2 rev 5' TCCTGCACACTTTCCATCTG、asMA fw 5' CTGACAGAGGCACCACTGAA、aSMA rev 5' CATCTCCAGAGTCCAGCACA。

データは、GraphPad Prism バージョン 8 を使用した算術平均 ± SEM として提供されます。2 つのグループ間の統計的有意差は、指示があればウェルチ補正を含むスチューデントの t 検定で決定されました。いくつかのグループ間の統計分析は、Tukey または Dunnet の補正を含む二元配置 ANOVA を使用して決定されました。有意性は次のように計算されました。p > 0.05: ns; p < 0.05: *; p < 0.01: **; p < 0.001: ***; p < 0.0001: ****。インビトロアッセイは、少なくとも 3 つの独立した実験で実施されました。インビボ実験では、同腹子マウスを独立した個々の標本として使用した。

fastq ファイルのデータ分析は、CLC Genomics Workbench (バージョン 22.0.2、QIAGEN、Venlo、NL) を使用して実行されました。 UMI (Unique Molecular Identifier) フィルタリング後、すべてのプローブの残りのすべてのリードをアダプターでトリミングし、品質をトリミングしました (デフォルトのパラメーターを使用: Q13 より下の塩基はリードの末端からトリミングされ、あいまいなヌクレオチドは最大 2 つ)。マッピングは、ハツカネズミ (mm39; GRCm39.107) (2022 年 7 月 20 日) のゲノム配列に対して行われました。それぞれの実験条件に従ってサンプル (生物学的複製ごと) をグループ分けした後、Differential Expression for RNA-Seq ツール (バージョン 2.7) を使用して統計的な差次的発現を決定しました。結果として得られる P 値は、FDR 補正によって複数のテスト用に補正されました。 AP 値 ≤0.05 は有意であるとみなされました。遺伝子セット濃縮テスト (バージョン 1.2) は、デフォルトのパラメーターを使用し、GO 用語「生物学的プロセス」に基づいて行われました (M. musculus; 2021 年 12 月 16 日)。各グループについて、n = 4 の生物学的に独立したサンプルを使用しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

著者らは、この研究の結果を裏付けるデータは原稿内で入手可能であり、要求に応じて著者から入手できることを宣言します。 3'-RNA-Seq の遺伝子発現データは、NCBI Gene Expression Omnibus で入手できます。アクセッションコード: GSE226064。 GIL-11 をコードするプラスミドは、Addgene に寄託されています。プラスミド ID: 199627 はご要望に応じて提供されます。

モラガ、I. et al. シンセカインは、非天然受容体二量体を介してシグナル伝達を強制するサイトカインおよび成長因子アゴニストの代替品です。 Elife 6、e22882 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

シルバ、D.ら。 IL-2 および IL-15 の強力かつ選択的な模倣物の新規設計。 Nature 565、186–191 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

カレン、K.ら。サイトカインの受容体認識部位は交換可能なモジュールとして組織されています。白血病抑制因子受容体結合部位の毛様体神経栄養因子からインターロイキン-6への転移。Ｊ．Ｂｉｏｌ．化学。 274、11859–11867 (1999)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Engelowski、E. et al. 合成サイトカイン受容体は、人工リガンドを使用して生物学的シグナルを伝達します。ナット。共通。 2034年9月（2018年）。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Garbers, C. et al. インターロイキン 6 型サイトカインの可塑性とクロストーク。サイトカイン増殖因子 Rev. 23、85–97 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Garbers, C. & Scheller, J. インターロイキン 6 とインターロイキン 11: 同じですが異なります。バイオル。化学。 394、1145–61 (2013)。

Grötzinger, J.、Kernebeck, T.、Kallen, KJ & Rose-John, S. IL-6 型サイトカイン受容体複合体: 六量体、四量体、あるいはその両方? バイオル。化学。 380、803–813 (1999)。

論文 PubMed Google Scholar

Heinrich, PC、Behrmann, I.、Müller-Newen, G.、Schaper, F. & Graeve, L. gp130/Jak/STAT 経路を介したインターロイキン 6 型サイトカインシグナル伝達。生化学。 J. 334、297–314 (1998)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Taga, T. & Kiyomoto, T. Gp130 とインターロイキン 6 ファミリーのサイトカイン。アン。イミュノール牧師。 15、797–819 (1997)。

記事 CAS Google Scholar

Boulanger, M.、Chow, D.、Brevnova, E. & Garcia, K. インターロイキン 6/IL-6 α-受容体/gp130 複合体の六量体構造と集合。サイエンス 300、2101–2104 (2007)。

記事 Google Scholar

メトカーフ、R. et al. ヒトインターロイキン 11α 受容体の細胞外ドメインの構造は、サイトカイン結合のメカニズムを明らかにします。Ｊ．Ｂｉｏｌ．化学。 295、8285–8301 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Skiniotis, G.、Lupardus, P.、Martick, M.、Walz, T. & Garcia, K. 全長 gp130/LIF-R サイトカイン受容体膜貫通複合体の構造組織。モル。細胞。 31、737–748 (2008)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McDonald, N.、Panayotatos, N. & Hendrickson, W. MAD フェーズによって決定された二量体ヒト毛様体神経栄養因子の結晶構造。 EMBO J. 14、2689–2699 (1995)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Saggio, I.、Gloaguen, I.、Poiana, G. & Laufer, R. 生物学的効力と受容体選択性が向上した CNTF 変異体は、受容体相互作用の機能部位を定義します。 EMBO J. 14、3045–3054 (1995)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wagener、E. et al. 毛様体神経栄養因子（CNTF）のアミノ酸交換R28Eは、インターロイキン-6受容体依存性を無効にするが、糖タンパク質130（gp130）/白血病抑制因子受容体（LIFR）を介したCNTF受容体依存性シグナル伝達を保持する。Ｊ．Ｂｉｏｌ．化学。 289、18442–18450 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

リー、Ｙら。 gp130 心筋細胞の増殖と心臓の再生を制御します。回覧 142、967–982 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Findeisen、M. et al. デザイナーサイトカインIC7Fcによる2型糖尿病の治療。ネイチャー 574、63–68 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

キャリー、A.ら。インターロイキン-6 は、ヒトにおけるインスリン刺激性のグルコース処理と、インビトロでの AMP 活性化プロテインキナーゼを介したグルコース取り込みおよび脂肪酸酸化を増加させます。糖尿病 55、2688–2697 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Wang, Q. et al. IL-27 シグナル伝達は、脂肪細胞の熱産生とエネルギー消費を促進します。 Nature 600、314–318 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ワット、M.ら。 CNTFは骨格筋AMPKを活性化することにより、肥満誘発性のインスリン抵抗性を逆転させます。ナット。医学。 12、541–548 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

エッティンガー、M.ら。肥満成人の体重減少に対する毛様体神経栄養因子の組換え変異体：ランダム化された用量範囲研究。 JAMA 289、1826 ～ 1832 年 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アローラ、G. et al. 腫瘍分泌性白血病抑制因子によって誘発される悪液質関連脂肪減少は、レプチンの減少によって相殺されます。 JCI インサイト 3、e121221 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Guo, T. et al. 肥満におけるLIFR-α依存性脂肪細胞シグナル伝達は、脂肪肝疾患の一因となる脂肪の拡大を制限します。 iScience 24、102227 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

尾花正人らインターロイキン 11 によるシグナル伝達物質および転写活性化因子 3 の治療的活性化は、心筋梗塞後の心線維症を改善します。回覧 121、684–691 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Viswanathan, S. et al. インターロイキン 11 シグナル伝達を in vitro で研究し、実験的アーチファクトを回避するための重要な条件。カー。プロトック。 1、e251 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Widjaja, A.、Chothani, S.、Cook, S. 肝臓におけるインターロイキン 6 とインターロイキン 11 の異なる役割: 治療への影響。ハム。ワクチン。免疫力のない人。 16、2357–2362 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

モダレス、N. et al. IL-6 トランスシグナル伝達は肝部分切除後の肝臓再生を制御します。肝臓学 70、2075–2091 (2019)。

記事 Google Scholar

Bazan, J. 造血受容体とらせんサイトカイン。イムノール。今日、11、350–354 (1990)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ヒルトン、D. et al. マウスIL-11受容体α鎖のクローニング。高親和性結合とシグナル伝達には gp130 が必要です。 EMBO J. 13、4765–4775 (1994)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barton, V.、MA, H.、Hudson, K. & Heath, J. インターロイキン 11 は、六量体受容体複合体の形成を通じてシグナルを伝達します。Ｊ．Ｂｉｏｌ．化学。 275、36197–36203 (2000)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Pflanz, S.、Kurth, I.、Grötzinger, J.、Heinrich, P. & Müller-Newen, G. シグナルトランスデューサー gp130 の 2 つの異なるエピトープは、IL-6 誘導性受容体の活性化において連続的に協力します。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 165、7042–7049 (2000)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zhang、J.ら。溶液中での白血病抑制因子とその受容体サブユニットとのヘテロ三量体複合体の形成の証拠。生化学。 J. 325、693–700 (1997)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boulanger, M.、Bankovich, A.、Kortemme, T.、Baker, D. & Garcia, K. 共有シグナル伝達受容体 gp130 による多様なサイトカインの認識のための収束機構。モル。細胞。 12、577–589 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Baran, P. et al. インターロイキン (IL)-6、IL-6・可溶性 IL-6 受容体 (sIL-6R)、および IL-6・sIL-6R・sgp130 複合体のバランスにより、古典的シグナル伝達とトランスシグナル伝達の同時発生が可能になります。Ｊ．Ｂｉｏｌ．化学。 293、6762–6775 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Monhasery, N. et al. IL-11 のトランスサイトーシスと gp130 の頂端方向転換は、IL-11α 受容体によって媒介されます。 Cell Rep. 16、1067–1081 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Chalaris, A. et al. アポトーシスは、IL6R 脱落の自然な刺激であり、好中球の炎症促進性トランスシグナル伝達機能に寄与します。 Blood 110、1748–1755 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ロカウ、J.ら。タンパク質分解による切断は、インターロイキン 11 のトランスシグナル伝達を制御します。 Cell Rep. 14、1761–1773 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ハインリッヒ、P. et al. インターロイキン (IL)-6 型サイトカインシグナル伝達とその制御の原理。生化学。 J. 374、1–20 (2003)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

CA, W. & NA, N. SOCS3: インターロイキン 6 および G-CSF ファミリーのサイトカインによるシグナル伝達の必須の生理学的阻害剤。 JAKSTAT 2、e25045 (2013)。

Google スカラー

ジョストック、T. et al. 可溶性 gp130 は、可溶性インターロイキン 6 受容体のトランスシグナリング応答の天然阻害剤です。ユーロ。Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． 268、160–167 (2001)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Scheller, J.、Schuster, B.、Hölscher, C.、 Yoshimoto, T. & Rose-John, S. 可溶性 gp130 による IL-27 シグナル伝達の阻害なし。生化学。生物物理学。解像度共通。 326、724–728 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Wang, X.、Fuhrer, D.、Marshall, M. & Yang, Y. インターロイキン 11 は、3T3L1 細胞において Grb2、Fyn、および JAK2 の複合体形成を誘導します。Ｊ．Ｂｉｏｌ．化学。 270、27999–28002 (1995)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Owczarek, C. et al. 白血病抑制因子受容体アルファ鎖の異常な種交差反応性は、主に免疫グロブリン様ドメインによって決定されます。Ｊ．Ｂｉｏｌ．化学。 272、23976–23985 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

エルンスト、M.ら。 STAT3 および STAT1 は、gp130 受容体変異マウスにおける IL-11 依存性および炎症関連の胃腫瘍形成を媒介します。Ｊ．クリン．調査します。 188、1727–1738 (2008)。

Google スカラー

ジェイコブ、L.ら。マウスのオンコスタチン M は、OSMR を介してシグナル伝達する OP9 骨髄間質細胞と NIH/3T3 線維芽細胞の増殖に対して相反する効果をもたらします。内部。Ｊ．Ｍｏｌ．科学。 22、11649 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

クレスマン、DE et al. インターロイキン 6 欠損マウスにおける肝不全と肝細胞再生不全。サイエンス 274、1379–1383 (1996)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ピーターズ、M.ら。インターロイキン 6 と可溶性インターロイキン 6 受容体の組み合わせは、マウスの肝臓の再生を促進します。消化器病学 119、1663–1671 (2000)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ブリンデンバッカー、A. et al. インターロイキン 6 は、マウスの部分肝切除後の生存に重要です。肝臓学 38、674–682 (2003)。

記事 CAS Google Scholar

Nechemia-Arbely、Y. et al. 肝切除後の初期肝細胞 DNA 合成応答は、IL-6 トランスシグナル伝達および PI3K/AKT 活性化によって調節されます。Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ． 54、922–929 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

立花晋ほかインターロイキン 6 は、マウスの肝部分切除術後の細胞周期停止と DNA 修復酵素の活性化に必要です。細胞生物科学。 4、6 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Behnke, K. et al. B 細胞を介した CD169+ 細胞の維持は肝臓の再生にとって重要です。肝臓学。 https://doi.org/10.1002/hep.30088 (2018)。

マクファーランド・マンシーニ、MM 他。 IL-6受容体欠損マウスとIL-6受容体欠損マウスにおける創傷治癒の違い。 J イムノール 184、7219–7228 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Schumertl, T.、Lokau, J.、Rose-John, S. & Garbers, C. 健康と病気における可溶性インターロイキン 6 受容体の機能とタンパク質分解生成。ビオチム。生物物理学。アクタモル。細胞。解像度 1869年、119143年（2022年）。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ウーレン、M.ら。プロテオミクス。ヒトプロテオームの組織ベースのマップ。サイエンス 347、1260419 (2015)。

論文 PubMed Google Scholar

木村良也ほか心臓保護サイトカインであるインターロイキン 11 の標的としての心筋細胞の同定。サイトカイン 38、107–115 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

シェーファー、S.ら。 IL-11 は心血管線維症の重要な決定因子です。ネイチャー 552、110–115 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ropeleski, M.、Tang, J.、Walsh-Reitz, M.、Musch, M. & Chang, E. インターロイキン 11 誘発熱ショックタンパク質 25 は、酸化ストレスから腸上皮に特異的な細胞保護を与えます。消化器病学 124、1358–1368 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Donath, MY 糖尿病治療用サイトカインのデザイナー。ナット。メタブ。 1、933–934 (2019)。

論文 PubMed Google Scholar

Moraga, I.、Spangler, J.、Mendoza, J. & Garcia, K. サイトカイン受容体シグナル伝達特異性のさまざまな決定要因。上級イムノール。 121、1–39 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ガロ、L.ら。 Smad7 は、腸の炎症および自己免疫における免疫調節 PDL2/1-PD1 シグナル伝達を制御します。 Cell Rep. 28、3353–3366 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

マーティ、R. 他 MyD88 シグナル伝達は自己免疫性心筋炎の誘導を制御します。回覧 113、258–265 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ポポビッチ、Z.ら。プロテオグリカンビグリカンは、潜在的に MyD88 および TRIF 経路を介して抗原特異的 T 細胞の活性化を促進し、自己免疫性心筋膜炎を引き起こします。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 187、6217–6226 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Blyszczuk、P. et al. 骨髄分化因子 88/インターロイキン 1 シグナル伝達は、炎症性拡張型心筋症における心線維症と心不全の進行を制御します。円解像度 105、912–920 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

増田 K. & 岸本 T. 異常なサイトカイン発現に関連する炎症性疾患の治療のための潜在的な治療標的 RNA 結合タンパク質、Arid5a。カー。薬局。デス。 24、1766–1771 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ボビー、R. 他インターロイキン 6 の糖タンパク質 130 結合エピトープの大きなバックボーン振幅運動の機能的意味。 FEBS J. 281、2471–2483 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Harmegnies, D. et al. 強力なヒトインターロイキン 11 アゴニストの特性評価。生化学。 J. 375、23–32 (2003)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

バッティスタ、MR 他食餌誘発性肥満マウスにおけるPEG化毛様体神経栄養因子スーパーアゴニスト変異体の有効性。 PLoS ONE 17、e0265749 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

トニアッティ、C. et al. ヒトインターロイキン 6 を操作して、生物活性が大幅に強化された変異体を取得します。 EMBO J. 15、2726–2737 (1996)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ピーターズ、M.ら。インターロイキン 6 と可溶性インターロイキン 6 受容体の組み合わせにより、マウスの肝臓の再生が促進されます。消化器病学 119 1663–71 (2000)。

ファゼル・モダレス、N. 他 IL-6 トランスシグナル伝達は肝部分切除後の肝臓再生を制御します。肝臓学 70、2075–2091 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Garbers, C. & Rose-John, S. 炎症と癌におけるインターロイキン 6 の古典的シグナル伝達とトランスシグナル伝達を分析。方法Ｍｏｌ．バイオル。 1725、127–140 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ジークムント、SV 他。血清アミロイド A は、活性化された肝星細胞の炎症、増殖、細胞死を誘導します。 PLoS ONE 11、e0150893 (2016)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Giraldez, M.、Carneros, D.、Garbers, C.、Rose-John, S. & Bustos, M. 代謝、肝臓学、消化器病学における IL-6 ファミリーサイトカインに関する新たな洞察。ナット。胃腸ロール牧師。ヘパトール。 18、787–803 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

グナワルダナ、DH et al. 進行がん患者を対象とした組換えヒト白血病阻害因子の第I相研究。クリン。がん研究所 9、2056 ～ 2065 年 (2003)。

PubMed Google Scholar

Pinho, V.、Fernandes, M.、da Costa, A.、Machado, R. & Gomes, AC 白血病阻害因子: バイオテクノロジーにおける最近の進歩と影響。サイトカイン増殖因子改訂版 52、25–33 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kelley, L.、Mezulis, S.、Yates, C.、Wass, M. & Sternberg, M. タンパク質のモデリング、予測、分析のための Phyre2 Web ポータル。ナット。プロトック。 10、845–858 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pettersen、E. et al. UCSF Chimera – 探索的研究と分析のための視覚化システム。 J コンピューティング。化学。 25、1605–1612 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

フィッシャー、M.ら。 I. ヒト造血前駆細胞増殖のための生理活性デザイナーサイトカイン。ナット。バイオテクノロジー。 15、142–145 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

モスナー、S.ら。高活性合成サイトカイン受容体リガンドの効率的な生産と精製のための多量体化戦略。 PLoS ONE 15、e0230804 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ジョストック、T. et al. インターロイキン-6 および IL-6/可溶性 IL-6R 融合タンパク質ハイパー IL-6 のイムノアドヘシン。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．方法 223、171–183 (1999)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Greene, AK & Puder, M. マウスの部分肝切除術: 技術と周術期管理。Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．外科。 16、99–102 (2003)。

記事 Google Scholar

キム、JW 他新規のIL-6ファミリーサイトカインリガンドから強力な受容体スーパーアゴニストまたはアンタゴニストを操作する。手順国立アカデミー。科学。 USA 117、14110–14118 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ハイトン、T.ら。異常なサイトカイン:Ig ドメイン相互作用が、LIF 受容体と複合体を形成した白血病抑制因子 (LIF) の結晶構造で明らかになりました。 PNAS 104、12737–12742 (2007)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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技術的な支援をしていただいた Yvonne Arlt に感謝します。計算インフラストラクチャとサポートは、デュッセルドルフのハインリッヒハイネ大学の情報およびメディア技術センターによって提供されました。この研究は、ドイツ政府機関 (SFB1116) からの助成金によって資金提供されました。

Projekt DEAL によって実現および組織されたオープンアクセスの資金調達。

生化学・分子生物学研究所 II、医学部、ハインリッヒ・ハイネ大学、40225、デュッセルドルフ、ドイツ

プヤン・ラフィー、クリスティアーヌ・セイベル、ヘンドリック・T・ワイツ、ジュリア・エティッヒ、アンナ・リタ・ミナフラ、ドリーン・M・フロス、クリスティーナ・ベンケ、イェンス・M・モール、ユルゲン・シェラー

生物学・医学研究センター (BMFZ)、ハインリッヒ・ハイネ大学医学部、Universitätsstraße 1、40225、デュッセルドルフ、ドイツ

パトリック・ペチュ

心臓血管研究室、医学部、デュッセルドルフ大学病院、40225、デュッセルドルフ、ドイツ

アレクサンダー・ラング & カール・ケーラー

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PR はほとんどの実験、データキュレーション、PR、CS、AM、HTW、DMF、KB、JM、JS 形式分析、検証、調査、方法論、原稿の修正を実行しました。 KBとHTWは肝部分切除術を行った。 JEはクローニングと細胞培養をサポートしました。 CSはsgp130Fcを発現および精製した。 PP と KK はトランスクリプトーム解析を手伝ってくれました。 AL はベン図と遺伝子オントロジーを支援しました。 PR および JS 執筆 - 原案。 JSプロジェクト運営、資金獲得。

ユルゲン・シェラーへの通信。

JS、PR、および JM は GIL-11 の発明者であり、この分子の特許を所有しています (EP22214005.5)。他のすべての著者は、競合する利益を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。主な担当編集者: Joao Valente。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Rafii、P.、seibel、C.、Weitz、HT 他。サイトキメラ GIL-11 は、非天然 gp130:LIFR:IL-11R 複合体を介したシグナル伝達により、IL-6R 欠損マウスを部分肝切除誘発死から救出しました。 Commun Biol 6、418 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04768-4

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受信日: 2022 年 6 月 30 日

受理日: 2023 年 3 月 27 日

公開日: 2023 年 4 月 15 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04768-4

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