並行マイクロスケールタンパク質標識と平均標識度 (aDoL) の正確な制御のための方法

Mar 22, 2023

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8961 (2023) この記事を引用

70 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

タンパク質の結合に広く使用されているアプローチは、NHS または他の活性エステルと反応するリジン残基によるものです。しかし、活性エステルの不安定性や反応効率のばらつきにより、標識度（DoL）を正確に制御することは困難です。ここでは、既存の銅を含まないクリックケミストリー試薬を使用して aDoL をより適切に制御するためのプロトコルを提供します。これは 2 段階の反応であり、間に 1 回の精製が行われます。簡単に説明すると、対象のタンパク質はまずアジド-NHS で活性化されました。未反応のアジド-NHSを除去した後、プロテイン-N3を限られた量の相補的クリックタグと反応させます。私たちの研究では、クリックタグは 24 時間のインキュベーション後にプロテイン N3 と完全に反応するため、追加の精製手順を必要としないことが示されました。したがって、aDoL はクリックタグとタンパク質の入力モル比に等しくなります。さらに、このアプローチは、マイクロスケールのラベル付けを並行して実行するための、より簡単で経済的な方法を提供します。タンパク質が N3-NHS で事前に活性化されると、2 つの成分を混合することによって、相補的なクリックタグを持つ蛍光色素または分子をタンパク質に結合させることができます。クリック反応で使用されるタンパク質の量は、任意の量であり得る。一例では、合計 0.5 mg の抗体を使用して、9 つの異なる蛍光団で抗体を並行して標識しました。別の例では、2 ～ 8 のターゲット aDoL 値で Ab を標識しました。安定性比較研究では、提案されたクリックプロトコルを使用した結合蛍光団は、標準的な NHS 蛍光団標識よりも長くタンパク質に結合したままであることがわかりました。

タンパク質は生物学において中心的な役割を果たしており、タンパク質を可視化または検出可能にすることは、研究者がタンパク質の機能と相互作用を研究するために不可欠です。 2001 年、シャープレスは、「クリック」によって 2 つの分子を結合させる簡単な戦略を説明した画期的な論文を発表しました1。その後、メルダルとベルトッツィはこの化学をさらに発展させ、広く応用できるようにしました 2,3 。20 年後、彼らの研究は評価され、ノーベル化学賞を受賞しました。生体直交化学またはクリックケミストリーは、複雑なシステムにおいて修飾された個々のタンパク質をプローブまたはタグで高い特異性で標的化するのに大きな利点があることが実証されています4、5、6、7、8、9、10。天然タンパク質に単一のタグを付加するための化学選択的および位置選択的標識法においては、他にも大きな進歩がありました 11、12。タンパク質のバイオコンジュゲーションに関する包括的なレビューと書籍については、13、14、15 を参照してください。システイン残基が部位特異的タンパク質結合のもう 1 つの一般的なターゲットであることにも言及する価値があります。ほとんどのタンパク質には、標的となる天然の遊離チオールが含まれておらず、ジスルフィド結合の減少は構造に悪影響を与える可能性があるため、点突然変異を介して単一のシステイン残基を導入することは、タンパク質の正確な位置に単一のタグを付加するための好ましいアプローチです。。上記のアプローチに関係なく、古典的な N-ヒドロキシスクシンイミド (NHS) エステルおよびその他の活性エステルは、依然として、リジン残基を介して蛍光団、発色団、ビオチンおよび DNA をタンパク質に結合させるための好ましい官能基です 16,17。ほとんどのタンパク質にはリジン残基が豊富に含まれているため、標識が容易であり、1 ステップの反応と 1 ステップの精製で済みます。それにもかかわらず、活性エステルの不安定性 (加水分解)、反応効率の不一致、およびタンパク質の機能に影響を与える過剰標識の懸念 18 により、依然として気の遠くなる作業です。

ここでは、すぐに入手できる銅を含まないクリックケミストリー試薬を使用して、標的aDoLを保証する標識方法について説明します。結合部位は確率論的にタンパク質表面のリジン残基を標的とし、aDoL は各タンパク質に結合したタグ (蛍光団) の平均数です。これは 2 段階の反応であり、間に 1 つの精製段階が含まれます (図 1 を参照)。最初のステップとして、タンパク質を N3-NHS で活性化し、反応後に過剰な N3-NHS を除去しました。第 2 ステップでは、タンパク質 N3 を、所望の aDoL と同等のモル比でフルオロフォア DBCO と混合しました。 24 時間のインキュベーション後、標識タンパク質は使用できる状態になります。

ターゲットを絞った aDoL によるクリックラベリングのスキーム。括弧内の数字は反応におけるモル比を表します。タンパク質に十分なリジン残基がある場合、15 倍モル過剰の N3-NHS を使用すると、通常、タンパク質あたり約 5 個の N3- が得られます。平均標識度 (aDoL) は、第 2 反応ステップでの試薬の投入モル比によって制御できます。タグは DBCO、または N3- に相補的な他のシクロオクチンであってもよい。

提案された標識プロトコールが成功するかどうかは、次の 2 つの条件に依存します: (1) 活性化ステップでは、タンパク質に結合する N3 の平均数が目的の aDoL よりも多くなければなりません。(2) 追加された蛍光色素 DBCO は完全に消費されなければなりません。このため、追加の精製が不要になります。このプロトコールは、アポミオグロビン (apoMb、17 kDa) と抗体 (150 kDa) という小さなタンパク質の 2 つのタンパク質システムでテストされました。両方とも AZ488-DBCO で標識されており、apoMb については 2 ～ 4 の aDoL、抗体については 2 ～ 8 の aDoL を達成しました。クロマトグラフィーと蛍光相関分光法 (FCS) を使用して、標識反応をモニタリングし、未反応の蛍光色素を検出し、複合体の輝度を特徴付けました。

FCS は、蛍光分子が明確に定義された照明ボリューム (約 1 fL) 内を自由に拡散するときに、蛍光分子の信号変動を測定します。この洗練された手法は 30 年以上前に導入されました 19 が、より高速なコンピューターと高度な機器が利用可能になる 90 年代半ばまでは頻繁に使用されませんでした。 FCS の基本原則と応用の包括的な概要は、他の場所で見つけることができます20。計算された自己相関曲線は、蛍光分子の拡散速度に関する情報を提供します。より小さい分子（例えば、遊離蛍光団）は、蛍光標識タンパク質と比較して拡散速度が速いため、標識反応中に右にシフトした自己相関曲線に反映されます。

アジド酢酸 NHS エステル (N3-NHS) およびすべてのフルオロフォア DBCO は、Click Chemistry Tool (アリゾナ州スコッツデール) から購入しました。 AlexaFluor 488-SDP (AF488-SDP) および Zeba スピン脱塩カラムは Thermo-Fisher Scientific (ワシントン州ウォルサム) から購入しました。 Cy5-NHS は GE ヘルスケア (バッキンガムシャー、英国) から購入しました。研究で使用された NGAL、抗 NGAL 抗体、および抗ビオチン抗体は、Abbott Laboratory21 (イリノイ州アボットパーク) によって社内で製造されました。アポミオグロビンは、Sigma-Aldrich (セントルイス、ミズーリ州) から購入しました。ヤギ抗マウス抗体 - Dylight 649 は、Jackson ImmunoResearch Inc (ペンシルバニア州ウェストグローブ) から購入しました。クロムリンクビオチンは、Vector Laboratories (カリフォルニア州ニューアーク) から購入しました。

ＰＢＳ緩衝液中の２ｍｇ／ｍＬの抗ＮＧＡＬＡｂ１を、８倍モル過剰のＡＦ４８８－ＳＤＰエステルと混合した。反応は 2 ～ 8 °C で一晩実行されました。過剰なAF488-SDPは、サンプルをZebaスピン脱塩カラムに2回通すことによって除去した。

1 ～ 2 mg の N3-NHS を DMSO に溶解し、最終濃度 10 mg/mL にしました。 N3-NHS の濃度は、加水分解生成物 NHS、ε260 nm = 9700/M/cm22 を正確に秤量または測定することによって決定されました。両方の方法を使用して、N3-NHS の濃度を測定しました。差異は 5% 以内でした。前活性化ステップでは、さまざまな IR を実現するために、広範囲のモル過剰 (4 ～ 5 倍過剰) の N3-NHS を 2 mg/mL の抗体または 1.2 mg/mL のアポミオグロビンと混合しました。室温で 2 時間インキュベートした後、未反応の N3-NHS は、サンプルを Zeba スピン脱塩カラムに 2 回通過させることによって除去されました。タンパク質へのアジド基の結合はタンパク質の吸収スペクトルに影響を与えないため、Ab-N3 または apoMb-N3 の濃度は Ab または apoMb の吸光係数 (Ab: ε280 = 217,500/M/cm、apoMb) によって決定されます。 : ε280 = 15,900/M/cm)。

N3- とタンパク質の取り込み率 (IR) を決定するために 2 つの方法を採用しました。 Ab-N3 は最初に過剰モルの Cy5-DBCO と反応し (すべての N3 タグには Cy5-DBCO が結合している必要があります)、24 時間のインキュベーション後にサンプルを分析用 HPLC に注入し、8.8 分の吸収スペクトルを使用して測定しました。以下の式を使用して、Ab に対する Cy5 の aDoL を計算しました ([Cy5] = A663/255,000/M/cm; [Ab] = (A280 − 0.05 × A663)/217,500/M/cm; aDoL = [Cy5] /[Ab])、これは Ab-N3 の IR の適切な推定値となります。標識されたＡｐｏＭｂを、ＥｋｓｉｇｅｎｔＭｉｃｒｏＬＣ２００ＨＰＬＣ（Ｓｃｉｅｘ、マサチューセッツ州フラミンガム）に接続されたＴｒｉｐｌｅＴＯＦ（登録商標）５６００質量分析計（Ｓｃｉｅｘ、マサチューセッツ州フラミンガム）によって分析した。 AB Sciex の Peakview ソフトウェアで利用可能な再構築機能を使用して、タンパク質サンプルの複数の荷電状態分布をデコンボリューションしました。平均 IR は、式: ∑(タンパク質に結合した N3 の数 x ピーク強度)/∑(ピーク強度) を使用して計算されます。

すべてのフルオロフォア-DBCO ストックを最終濃度 10 mg/mL になるように DMSO に溶解し、次に PBS バッファーで約 100 μM まで希釈しました。 2 mg/mL Ab-N3 (IR 7) を小さなアリコート (50 μL) に分割し、それぞれを 2 倍モル当量の AZ405-DBCO、AZ430-DBCO、AZ488-DBCO、AZ546-DBCO、AZ568-DBCO、 AZ594-DBCO、または Cy5-DBCO。生成物をＨＰＬＣで分析して、反応効率を測定した。

プロテイン N3 と AZ488-DBCO の反応速度は、Agilent Chemstation を使用した分析クロマトグラフィーによってモニタリングされました。 50 μL の混合物を分析用 SRT-C SEC 300 (HPLC カラム、Sepax) にさまざまな時間 (5 分～24 時間) で注入しました。溶出プロファイルの変化は反応の進行を反映しています。 2 mg/mL の Ab-N3 を 9 種類の異なるフルオロフォア DBCO と反応させる実験では、24 ± 1.5 時間のインキュベーション後に反応混合物を同じカラムに注入しました。最初と最後のサンプル注入の間には 3 時間の差がありました。検出器は、対応する蛍光団の吸収極大に設定されました。溶出プロファイルを使用して、未反応の蛍光色素 DBCO を検出しました。

FCS 実験は、倒立 Nikon Eclipse TE300 蛍光顕微鏡 (Nikon InsTech Co., Ltd.、神奈川県、日本) および Spectra-Physics Mai Tai Ti-Sapphire レーザーと統合された蛍光相関分光計 (ALBA、ISS、イリノイ州シャンペーン) を使用して実施されました。。このシステムは、使用前に分析的に調製された 20 nM AlexaFluor 488 で校正されます。すべてのサンプルを 10 mM HEPES 緩衝液 (pH 7.4、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、および 0.005% 界面活性剤 P20 を含む) で 50 ～ 100 nM に希釈し、FCS 測定のために 384 ウェルのガラス底プレートにロードしました。

この研究で使用される抗体は、抗 NGAL 抗体と抗ビオチン抗体です。 2 つの独立したプロトコールを使用して、抗体の結合活性を比較しました。 1 つのアプローチでは、3 つの異なる IR (IR 7、15、および 24) および未標識 Ab 1 を使用して抗 NGAL Ab 1 に対して連続滴定を実行しました。Ab を 10 mM HEPES 緩衝液で 100 pM に希釈しました。各 Ab を一連の 2 倍希釈 NGAL-Cy5 溶液で滴定しました。一晩インキュベートした後、抗体または抗体-NGAL-Cy5 複合体を二次抗体 (ヤギ抗マウス IgG Ab) でコーティングされた微粒子によって捕捉しました。研究で使用した抗 NGAL Ab はマウス抗体です。微粒子上に捕捉された NGAL-Cy5 からの蛍光シグナルを使用して、3 つの Ab-N3 の未標識 Ab に対する結合活性を比較しました。

2 番目のアプローチでは、4 つの異なる抗 NGAL 抗体と 1 つの抗ビオチン抗体を、2 ～ 6 の範囲の異なる IR を持つ N3-NHS で標識しました。すべての標識抗体とそれらに対応する無傷の抗体は、10 mM HEPES バッファーで 100 pM に希釈しました。。 100μLの各サンプルをまず5μLの0.1%固体NGALコーティング微粒子と30分間反応させ、次に50μLの30nMヤギ抗マウス抗体F(ab')2-Dylight649と15分間反応させた。各結合反応ステップの後に微粒子を洗浄し、オリンパス落射蛍光顕微鏡で画像化しました（機器のセットアップと画像分析は以前に説明しました 24、25）。ビオチン-NGALでコーティングされた微粒子は、10μLの15μMビオチン-NGALを1mLの0.1%固体ストレプトアビジン微粒子と混合することによって調製した。未結合のビオチン-NGALは、各実験の前にプレート洗浄機を使用して微粒子溶液から洗い流されました。ストレプトアビジンでコーティングされた微粒子は、0.15 mg/mL EDAC (1-エチル) の存在下で固形分 1% (w/w) に保たれた 5 μm 常磁性カルボキシル粒子 (Polymer Lab、カリフォルニア州パロアルト) に 0.1 mg/mL ストレプトアビジンをカップリングすることによって調製されました。 -3-(3-メチルアミンプロピル) カルボジイミド、塩酸塩ビオチン-NGAL でコーティングされていないストレプトアビジン微粒子を陰性対照として使用し、測定されたシグナルが抗体とその対応する抗原間の特異的結合であることを確認しました。

この研究では複数の標識条件と標識産物が説明されており、明確にするために次の命名法が使用されています: タンパク質-15×-N3-2×-AZ488。タンパク質が最初に 15 倍モル当量の N3-NHS と反応し、次に 2 モル当量と反応することを示します。 × AZ488-DBCO のモル当量。タンパク質に結合した N3 の数は、取り込み率 (IR) と呼ばれます。タンパク質に結合した最終的な蛍光色素分子の数は、平均標識度 (aDoL) と呼ばれます。中間生成物はプロテイン N3 と呼ばれ、フルオロフォアを含む最終生成物はコンジュゲートと呼ばれます。

最初の例では、抗体を 16 倍モル過剰の N3-NHS で活性化し、5.6 の IR を達成しました。次に、モル比 2:1 の AZ488-DBCO と Ab-16x-N3 を混合して、aDoL 2 を達成しました。反応混合物 (Ab-16x-N3、AZ488-DBCO) を分析用 HPLC カラムに注入しました。反応の進行をモニターするために何度も繰り返し、生成物Ab-AZ488をさらなる分析のために収集した。図 2a は、493 nm で監視されたクロマトグラムの例を経時的に示しています。複合体 Ab-16x-N3-2x-AZ488 は 8.8 分で溶出しますが、遊離 AZ488-DBCO は 16.5 分で溶出します。反応の開始時 (5 分)、コンジュゲートは微量しかなく、ほとんどの発蛍光団は遊離の AZ488-DBCO の形でした。 55 分では、50% を超える蛍光団が抗体に結合し、267 分では、遊離 AZ488-DBCO は微量しか存在しませんでした。 24 時間までに、遊離の AZ488-DBCO はカラムから溶出されなくなり、すべての AZ488-DBCO が Ab-N3 に結合したことが示されました。したがって、目標とする aDoL 2 を達成したと考えて間違いありません。図 2b は、 8.8分の溶出ピーク値から反応を抽出。次に、反応速度トレースを式(1)を使用して当てはめました。 (2) 二次反応の積分速度方程式 (式 1) から導出されます。

ここで、[A]0 および [B]0 はそれぞれ N3-DBCO および AZ488-DBCO の初期濃度です。 t は秒単位の反応時間、x はタンパク質に結合した AZ488-DBCO の濃度、K は反応速度定数です。当てはめられた K は 4.31 ± 0.13/M/s です。

(a) 2× AZ488-DBCO と反応する Ab-16x-N3 の時間の関数としてのクロマトグラム (493 nm で監視)。コンジュゲート Ab-16x-N3-2x-AZ488 は 8.8 分で溶出し、遊離 AZ488-DBCO は 16.5 分で溶出します。 (b) 4.31/M/s の近似 K 値を使用してクロマトグラムから抽出された反応速度曲線。 (c) HPLC 機器の PDA によって測定された、さまざまな反応時間からの複合体の吸収スペクトル。凡例は反応時間を示します。 (d) Ab-N3 と反応する AZ488-DBCO の時間の関数としての自己相関曲線。より多くのAZ488-DBCOがAb-N3に共有結合するにつれて、曲線は右にシフトします。

DBCO タグと N3 タグの最小濃度がそれぞれ 10 μM と 25 μM であれば、24 時間のインキュベーション後にクリック反応が 100% 完了することが理論的および実験的に確認されました。ただし、ペイロードのサイズとターゲットDoLに応じて、2番目のステップで反応速度定数の変化または不完全な反応が観察されました。これには、より長いインキュベーションまたはより低いaDoLでのターゲットが必要になる可能性があります（補足セクションを参照）。

図 2c は、8.8 分の溶出点での複合体の吸収スペクトル (さまざまなインキュベーション長から) を示しています。 495 nm ピークの増加は、時間の経過とともにより多くの AZ488 が抗体に結合していることを示しています。挿入表には、以下に説明する式を使用して各吸収スペクトルから計算された aDoL がリストされています。 24 時間のインキュベーション後、コンジュゲートは aDoL 1.8 を達成しました。これは、目標値 2 に近い値です。

並行して、FCS 測定も反応の進行状況を追跡するために使用されました。反応混合物は、精製ステップを行わずに顕微鏡で測定されました。図 2d は、さまざまな反応時間における反応混合物の自己相関曲線を示しています。右にシフトした自己相関曲線は、時間の経過とともにより多くの AZ488-DBCO がタンパク質に結合していることを示しています。 24 時間の時点で、未精製の反応混合物の自己相関曲線が HPLC 精製複合体の自己相関曲線と重ねられており、すべての AZ488-DBCO が Ab-N3 と反応したことが示されています。したがって、標識反応が 100% 完了したことを確認するために 2 つの独立した方法を使用しました。

0.5 mg の Ab-17x-N3 を 9 つのアリコートに分割し、それぞれを 2x モル当量の AZ405-DBCO、AZ430-DBCO、AZ488-DBCO、AZ546-DBCO、AZ568-DBCO、AZ594-DBCO および Cy5-DBCO と反応させました。。約24時間のインキュベーション後、すべての生成物を分析用HPLCカラムにロードし、対応する各蛍光団の最大吸収波長でモニタリングしました。未反応の残留物はサンプル AZ532-DBCO および AZ647-DBCO でのみ見つかりました。残りはすべてタンパク質と完全に反応しました (図 3)。 AZ532-DBCO と AZ647-DBCO の不完全な反応の原因は不明ですが、これら 2 つの化合物は避けるべきです。この実験の目的は、活性化ステップの後、追加の精製を必要とせずに、マイクロスケールで並行して DBCO タグを備えたフルオロフォア、ビオチン、または他の小さなペイロードとプロテイン N3 を結合できることを実証することでしたが、100% の反応性を確認する必要があります。初期テスト中の N3 タグを含む DBCO 試薬の使用。

(a) 約 24 時間のインキュベーション後のコンジュゲート (Ab-17X-N3-フルオロフォア) の HPLC 溶出プロファイル (正規化)。対応するフルオロフォア波長でそれぞれをモニターしました。 (b) 8.8 分の溶出点における複合体の吸収スペクトル。

以前は、AF488-SDP または AF488-NHS でタンパク質を標識する場合、わずか数日間保存しただけで、コンジュゲート溶液中に常に遊離蛍光団が検出されました。蛍光団は標識反応中にタンパク質に非共有結合し、その後時間の経過とともにタンパク質からゆっくりと解離し、精製されたタンパク質複合体中に遊離の蛍光団が存在することが示唆されています。この点では、N3-NHS はそれほど問題にならないはずだと私たちは考えています。結合体化Ａｂ−ＡＦ４８８（ＳＤＰエステル官能基を介して直接結合）およびＡｂ−１７ｘ−Ｎ３−２ｘ−ＡＺ４８８を同日に調製し、ＦＣＳ装置を使用して１日目と１００日目に測定した。 2 ～ 8 °C で 100 日間放置した後、Ab-SDP-AF488 コンジュゲートでは 15% の遊離 AF488 が検出されましたが、SPAAC 反応によって標識されたコンジュゲートでは遊離蛍光団は検出されませんでした (図 5 を参照)。この直接比較実験は、クリック標識アプローチがより安定した複合体を生成できることを示しました。これは、非共有結合した蛍光色素 DBCO (存在する場合) が時間の経過とともに常にタンパク質 N3 と反応できることで説明できます。

抗体は最初に17倍、34倍、および51倍モル過剰のN3-NHSと反応し、それぞれ7、15、および24のIRを達成した。次に、タンパク質 N3 を AZ488-DBCO とモル比 2、4、6、および 8 で反応させました。24 時間のインキュベーション後、サンプルを精製せずに蛍光相関分光法 (FCS) 測定用に希釈しました。予想どおり、AZ488-DBCO は aDoL ターゲット 2 および 4 で Ab-17x-N3 (IR 7) と 100% 反応しましたが、aDoL の Ab-17x-N3 (IR 7) では微量の AZ488-DBCO が検出されました。一方、Ab-34x-N3 (IR 15) は 1 分子あたり最大 6 つの AZ488 を収容でき、Ab-51x-N3 (IR 24) は 1 分子あたり最大 8 つの AZ488 を収容できます (図4を参照)。同様の反応プロトコールを apoMb に対して実行し、予想どおりに標的 aDoL を達成しました (図 3 を参照)。この研究は、クリック反応を確実に完了させるためには、プロテイン N3 の IR が標的 aDoL の 2 倍である必要があることを示唆しています。しかし、標識タンパク質の蛍光輝度は、自己消光、または濃度消光と呼ばれることがあるため、それに結合した蛍光色素分子の数に必ずしも直線的に比例するとは限らないことが知られています 26,27。 FCS測定により、標識タンパク質の予想される自己消光現象が観察されました。図 4 は、aDoL が 2 の場合、複合体の輝度が単一の蛍光団 AZ488-DBCO の輝度の 2 倍であることを示しています。 aDoL が高くなるほど明るさは段階的に増加しますが、線形傾向には従いません。 aDoL が 8 の場合、複合体の輝度は蛍光団 AZ488 の輝度のわずか 3 倍です。タンパク質の構造と機能に対する広範な標識の潜在的な悪影響と、aDoL28 が高くても輝度の増加が最小限に抑えられることを考慮すると、aDoL を低く保つ必要があることを強調することが重要です。抗体あたりの蛍光色素分子の数がポアソン分布に従うと仮定すると、aDoL が約 2 であっても、標識が 3 つあるタンパク質は約 18%、標識が 4 以上のタンパク質は約 15% になります。

FCS測定から計算されたコンジュゲートの蛍光輝度。 aDoL が 2 の場合、複合体の輝度は単一蛍光体 AZ488-DBCO の 2 倍であり、aDoL が高くなるほど輝度は徐々に増加しますが、線形傾向には従いません。

機能性タグである N3- は 260 nm でも 280 nm でも吸収しないため、タンパク質への N3- の結合は吸収スペクトルによって確認できません。異なる IR を持つタンパク質は、非常によく似た吸収スペクトルを持っています (S 図 1 を参照)。 N3- とタンパク質の取り込み比率を決定するために 2 つの方法を採用しました。 1 つのアプローチでは、プロテイン N3 は過剰モルの Cy5-DBCO と反応します。すべての N3 タグに Cy5-DBCO が結合している場合、プロテイン N3 に対する Cy5 の aDoL は Ab-N3 の IR を反映するはずであり、aDoL を決定できます。吸収スペクトルによる。このアプローチは、より高い吸光係数と発蛍光団を収容するのに十分なスペースを持つ、より大きなタンパク質 (Ab など) により適しています。補足表 1 には、Ab-N3-DBCO-Cy5 のピーク値と計算された aDoL がリストされています。別のアプローチは、ESI-MS を使用し、タンパク質の質量増加によって N3- の数を直接分解することです。これは、グリコシル化のない小さいサイズのタンパク質 (ApoMb など) に適しています。 apoMb-N3のESI-MSスペクトルは補足セクションに含まれています（S図2）。表 1 に Ab-N3 と apoMb-N3 の IR を示します。どちらの方法でも、反応効率が 25 ～ 47% の範囲にあることが示されています。過剰標識の場合を除くと、IR レベルが 5 未満の反応効率は約 30% です。

2 つの独立したプロトコールを使用して、-N3 修飾時の抗体の結合活性を比較しました。最初のアプローチでは、結合滴定曲線を抗 NGAL Ab1 の IR 0、7、15、および 24 で実行しました。各結合曲線には 10 個のデータポイントがあります。すべての結合曲線は重ね合わせることができ、抗体の機能に対する N3 修飾の影響がないことが示されています (図 5a)。 2 番目のアプローチでは、より簡単な方法を採用して、さまざまな IR でより多くの抗体を評価しました (「材料と方法」セクションを参照)。すべての試薬（NGAL コーティングされた微粒子、ヤギ抗マウス Ab-Dylight 649）の濃度と反応条件は同じに保たれました。図 5b は、対応する抗原に結合したときの元の抗体と N3 標識抗体の蛍光シグナルを示しています。 5 つの抗体は、標的抗原に対して固有の異なる親和性を持っており、それが各抗体のさまざまなシグナルレベルに反映されています。ただし、異なる IR で標識された同じ抗体からのシグナルの変化は、標識修飾の影響を反映しています。図 5c は、標識された Ab の無傷の Ab に対する正規化されたシグナルを示しています。抗 NGAL Ab1 および Ab4 は、N3 の結合がタンパク質の機能に悪影響を及ぼさないことを示しましたが、抗 NGAL Ab2、Ab3 および抗ビオチン Ab は、より高い IR で最大 30% の結合活性損失を示しました。また、IR の増加に伴い機能喪失も増加する傾向があります。ネガティブコントロール実験（ストレプトアビジンでコーティングされた微粒子）は、すべての抗体がNGALまたはビオチンに特異的に結合し、100 pM Abレベルでの非特異的結合シグナルは無視できることを示しました。

(a) Ab1-N3 とその抗原 NGAL-Cy5 の結合滴定。未標識のAb1およびAb1-N3は100pMに維持したが、NGAL-Cy5の濃度は10pMから5.5nMまで変化した。 3 つの Ab-N3 はすべてネイティブ Ab と同様の結合活性を有しており、N3 の Ab への結合の影響が最小限であることを示しています。 (b) 対応する抗原によって捕捉された抗体の蛍光シグナル。 (c) 対応する無傷の抗体に対する N3 標識抗体の相対的な抗体活性。

ここで紹介するラベル付け手法は簡単かつ正確です。化学療法または部位選択的標識を行わずに同じ機能を持つ既存の標識方法を私たちは知りません。冒頭で述べたように、タンパク質結合に活性エステルフルオロフォアを使用する主な欠点は、活性エステルフルオロフォアの不安定性と予測できない反応効率により、aDoL を正確に制御できないことです。すべての活性エステルタグが同じように作成されるわけではありません。 Alexa Fluor® 色素、DyLight® 色素、IRDye® などの高度にスルホン化された色素は特に吸湿性が高く、活性エステルの加水分解をさらに悪化させます。あるケースでは、LC-MS により、新たに開けたバイアル中に加水分解された Alexa Fluor® 488-NHS の 37% が検出されました (図 5 を参照)。製造マニュアルでは、活性試薬の割合が通常は 50% 以上であるが、30 ～ 40% 程度になる可能性があることも認めています。加水分解のレベルが不明であり、発蛍光団のサイズが大きいため、反応効率を予測することは困難です。私たちの経験に基づくと、AF488-NHS または AF488-SDP のタンパク質への標識効率は 5 ～ 50% の範囲で変化します。 N3-NHS は小さいですが、無傷の N3-NHS と加水分解された N3-NHS は異なる吸収スペクトルを持ち、標識試薬の完全性をチェックするために使用できる可能性があります 22。 N3-NHS と apoMb および抗体のさまざまな標識比をテストしました。反応効率は、IR が 5 未満の両方のタンパク質で約 30% でした。すべてのタンパク質およびすべての N3-NHS ロットで 30% の反応効率を期待しているわけではありません。 , しかし、一貫性と再現性は示されています。さらに、過剰標識の場合、追加の各 N3 結合はわずか 83 ダルトンであり、かさばる蛍光団と比較してタンパク質の機能への影響は少なくなります。

この方法の有用性は、バッチモードアプローチで同じタンパク質 N3 に対して 9 つの異なる蛍光色素を並行して標識することによってさらに実証されました。活性化ステップの後、プロテイン N3 は、追加の精製を必要とせずに、マイクロスケールで並行して DBCO タグを備えた蛍光色素、ビオチン、またはその他の小さなペイロードと結合できます。最近発表された論文 30 で、著者は 3 つの抗体に対してさまざまな長さのリンカーとさまざまな aDoL を使用して、イムノアッセイにおける抗体のビオチン化の影響を評価しようとしました。合計 150 の標識条件が実行され、それには 150 回の独立した精製が必要です。私たちのアプローチが使用された場合、3 つの抗体は最初に N3-NHS で活性化され、精製後に各抗体が 50 のアリコートに分割され、さまざまな比率の 5 つのリンカーと反応し、得られた生成物を直接使用できます。さらに精製せずに。精製の総数は 150 回から 3 回に減少します。

「結果」セクションに示すように、蛍光自己消光とタンパク質の機能への影響の可能性により、蛍光標識の aDoL が高くなると利益の利益は減少します。私たちは、異なる I.R を持つ 5 つの異なる抗体をテストし、タンパク質の機能に対する N3 の影響を比較しました。予想通り、一部の抗体はその結合活性を維持しましたが、他の抗体はより高い I.R で抗原への結合能力の 30% を失いました。一部のタンパク質は 20 個を超える N3 タグを収容できますが、すべてのタンパク質は異なるため、修飾後のタンパク質の特性を確認することが重要です。各タンパク質に 3 ～ 5 個の -N3 アタッチメントを導入することをお勧めします。これは、最終反応ステップで 2 つの DBCO 蛍光団を収容するには十分です。 DBCO と反応させた後、TCEP を使用してタンパク質の未反応のアジド基をアミンに還元することもできますが、TCEP がタンパク質のジスルフィド結合を切断しなかったことを確認することが重要です。

全体として、我々は広範な研究を実施し、我々のアプローチが、十分に制御されたaDoLを用いて少量のタンパク質を並行して標識する簡単な方法を提供することを実証しました。

データは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

平均的な標識度

配合比率

蛍光相関分光法

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この研究はアボット研究所の支援を受けました。著者らは、洞察力に富んだ議論をしてくれた Sergey Tetin に感謝します。 LC-MS による DBCO 蛍光体と AF488-NHS の特性評価を行った同僚の Rich Haack に感謝します。原稿を大幅に改善するコメントをくださった同僚の Patrick J. Macdonald に感謝します。フィギュアの高解像度画像を用意してくれた Ray Zhao に感謝します。

Applied Research and Technology、Abbott Diagnostics Division、AP-20、Abbott Laboratories、100 Abbott Park Road、Abbott Park、IL、60064-6016、USA

チャオチャオ・ルアン＆チェン・ジャオ

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QR は、原稿に記載されている実験のほとんどを設計し、実行しました。 QRさんが原稿を書きました。 CZ はいくつかの実験を実行し、原稿の草稿に参加しました。著者全員が原稿をレビューしました。

チャオチャオ・ルアンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Ruan, Q.、Zhao, C. 並行マイクロスケールタンパク質標識と平均標識度 (aDoL) の正確な制御のための方法。 Sci Rep 13、8961 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-36163-8

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受信日: 2023 年 1 月 30 日

受理日: 2023 年 5 月 30 日

公開日: 2023 年 6 月 2 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36163-8

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