D の異種生産

Mar 20, 2023

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8551 (2023) この記事を引用

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結核（TB）は、単一感染症による死亡原因としては、新型コロナウイルス感染症（COVID-19）に次ぐ第2位です。 1世紀にわたる努力にもかかわらず、現在の結核ワクチンは肺結核を効果的に予防したり、集団免疫を促進したり、伝染を予防したりすることはできません。したがって、別のアプローチが必要です。私たちは、結核感染に反応して効果的な抗生物質を生成する細胞療法の開発を目指しています。 D-サイクロセリン (D-CS) は、細菌の細胞壁合成を阻害する結核に対する第 2 選択の抗生物質です。我々は、結核に対する有効性、生合成経路が比較的短いこと、耐性発生率が低いことから、D-CS が抗結核細胞療法の最適な候補であると判断しました。 D-CS合成に向けた最初のステップは、L-セリンとアセチル-CoAをO-アセチル-L-セリン（L-OAS）に変換するL-セリン-O-アセチルトランスフェラーゼ（DcsE）によって触媒されます。 D-CS 経路が結核の効果的な予防となり得るかどうかをテストするために、我々はヒト肺モデルとして A549 細胞で機能的な DcsE を発現することに努めました。蛍光顕微鏡を使用して DcsE-FLAG-GFP の発現を観察しました。 HPLC-MS で観察されたように、A549 細胞から精製された DcsE は L-OAS の合成を触媒しました。したがって、ヒト細胞は、L-セリンおよびアセチル-CoAをL-OASに変換できる機能的なDcsEを合成し、これはヒト細胞におけるD-CS産生への最初のステップを示しています。

結核（TB）は、結核菌（Mtb）1によって引き起こされる主に呼吸器感染症です1。TBは依然として世界中で感染症による主な死亡原因の1つであり、2021年には1,000万人が感染し、150万人が死亡しています12。結核に対するカルメット・ゲラン桿菌 (BCG) ワクチンの肺結核に対する予防率は一定ではなく、成人になるまで持続せず、副作用を引き起こす可能性があります (レビューについては参考文献 3 を参照)。 MVA85A ワクチンなど、他のワクチンの試みは BCG を補うために開発されましたが、第 IIIb 相試験では失敗したため、結核の予防は依然として困難です4。

効果的な結核予防法の開発は、代替アプローチの重要な機会をもたらします。化学予防法の成功の歴史と新たな遺伝子治療は、ヒトの細胞内で抗生物質を生成する遺伝子予防法 (遺伝子化学予防法) を開発する可能性の基礎を築きました。イソニアジドは、2 年以上にわたって結核を発症する確率を 40% 減少させる化学予防薬として使用されています5。最近、遺伝子治療が癌に対して有効であることが発見されました。キメラ抗原受容体 T 細胞 (CAR-T) 療法は、キメラ抗原受容体を含むように T 細胞を遺伝子改変します。これは、T 細胞ががん細胞、特に急性リンパ芽球性白血病や大細胞型 B 細胞リンパ腫を標的にするのに役立ちます6。 B型急性リンパ芽球性白血病の小児をCAR T-22治療に登録する臨床試験では、参加者20人中17人が少なくとも1年の寛解を達成した7。 CAR-T 療法により、がん細胞を標的とするように細胞を遺伝子組み換えできることが実証されてから、多数の代替送達法や細胞ベースの治療法が開発されました 8。化学予防法の有効性と遺伝子治療の出現により、我々は結核を予防する抗生物質を生成する遺伝子化学予防法の実現可能性を探求しようとしている。

すべての第一選択および第二選択の結核抗生物質を評価した後、遺伝的化学予防の最適な候補として D-シクロセリン (D-CS) 生合成経路を選択しました。この研究では、L-セリンとアセチル-CoA9からO-アセチル-L-セリン（L-OAS）を生成する生合成経路の最初の酵素、L-セリン-O-アセチルトランスフェラーゼ（DcsE）に焦点を当てました（図1）。 . 1）。我々は、機能的な DcsE がヒト II 型肺細胞のモデルである A549 細胞で発現できるかどうかをテストしようとしました10。 FLAG および緑色蛍光タンパク質 (GFP) でタグ付けされた DcsE を A549 細胞にトランスフェクトし、蛍光顕微鏡を使用して DcsE-FLAG-GFP の高レベルの産生を観察しました。 HPLC-MS を使用して、特に精製 DcsE による L-OAS の in vitro 合成を観察しました。我々は、予防的 D-CS 合成の最初のステップとして、機能的な DcsE がヒト細胞で合成できるという証拠を提供します。

D-CS9,14の生合成経路。 DcsE によって触媒されるボックス反応。 D-サイクロセリンは、6 つの酵素 DcsA-G (太字) と生物学的に入手可能な試薬 (L-セリン、L-アルギニン、アセチル CoA12) を使用して生合成的に生成できます。

ヒト細胞での合成に最適な抗生物質を特定するために、耐性プロファイルが低く、生合成経路が短く、ヒト細胞内に存在する前駆体を備えた既知の結核抗生物質を選択しました。結核に対する有効性が知られているため、我々は検索を 12 種類の第一選択および第二選択の抗結核薬に限定しました (表 1)。化学療法剤および生合成で製造できない半合成抗生物質は除外しました (表 1)。たとえば、イソニアジドは有機合成によって生成されますが、生成のための生合成経路は知られていません 11。同様に、半合成化合物であるアミカシンは、ヒトのメタボロームでは検出されない L-(-)-4-アミノ-2-ヒドロキシ酪酸とのアシル化反応を介してカナマイシン A から誘導されます 12。したがって、アミカシンは、L-(-)-4-アミノ-2-ヒドロキシ酪酸を追加合成しない限り生合成で生成できないため、除外されます。 12種類の第一選択療法と第二選択療法のうち、カプレオマイシンIA/IB、D-CS、カナマイシンA、ストレプトマイシン、およびリファマイシンSVのみがヒト細胞で生成できます。これは、それらの前駆体がヒト細胞内に存在し、それらの経路が完全に生合成されているためです。これらの経路のうち、D-CS は合成に 6 ステップのみを必要とする最短経路です (表 1)。対照的に、カプレオマイシン IA/IB には 14 ステップ、カナマイシンには 8 ステップ、ストレプトマイシンには 25 ステップ、そしてリファマイシン SV には 27 ステップが必要です。 D-CS は、多剤耐性結核を治療できる第 2 選択の抗生物質であり、いくつかの Streptomyces 種によって産生されます 13。 S. lavendulae は、L-セリン、アセチル-CoA、L-アルギニン、および DcsABCDEG によってコードされる 6 つの酵素を使用して D-CS を生成します (図 1)。この生合成経路は大腸菌で異種的に再現されており、マイクロモル濃度の D-CS14 を合成することが示されています。さらに、D-CS は細菌の細胞壁合成に必須の 2 つの酵素、アラニンラセマーゼと D-アラニル-D-アラニンリガーゼ 15 を阻害し、これが D-CS に対する耐性発生率の低さに寄与しています 16。 D-CS は比較的短い経路で合成され、前駆体がヒト細胞内に存在し、耐性発生率が低いため 16、D-CS 経路は提案されている遺伝的化学予防に最適です。

私たちは、S. lavendulae D-CS 生合成経路の最初の酵素である DcsE がヒト細胞内で合成されたときに機能するかどうかをテストしようとしました。ヒト肺 (A549) 細胞で DcsE-FLAG-GFP を発現させるために、陰性対照として DcsE-FLAG-GFP または FLAG-GFP を含むプラスミド DNA を細胞にトランスフェクトしました。 GFP 蛍光は、DcsE が発現しているかどうか、および細胞内でのその位置の尺度として使用できます。トランスフェクションの 12 時間後、FLAG-GFP トランスフェクト細胞で拡散 GFP 蛍光が観察されました (図 2a)。対照的に、DcsE-FLAG-GFP トランスフェクト細胞では拡散 GFP 蛍光と点の両方が観察されました (図 2b)。これらの観察に基づいて、我々は、DcsE-FLAG-GFP が A549 細胞で発現すると結論付けます。

A549 細胞は FLAG-GFP と FLAG および GFP でタグ付けされた DcsE を発現します。 (a) FLAG-GFP トランスフェクト A549 細胞 (ネガティブコントロール) の GFP は、GFP-FLAG およびより拡散したタンパク質の発現を示します。 (b) DcsE-FLAG-GFP でトランスフェクトされた A549 細胞における GFP は、DcsE-FLAG-GFP のより点状の発現を示します。光学顕微鏡 (LM)、緑色蛍光タンパク質 (GFP)。スケールバーは100μmです。

HPLC-MS/MS を使用して、DcsE に適した反応バッファー中の L-OAS と反応物質を検出する方法を開発しました。 L-セリンとL-OASに対応する質量を持つL-セリンの特定の保持時間は0.9分（図3a）、L-OASは1.1分（図3b）、アセチルCoA（図S1）を観察しました。 (図3c～f)。 L-セリン標準の親イオンは106.049 m/zの質量を生成し、88.0396 m/zの質量に断片化しますが、これはアルコール基の喪失と一致します（図3e）。 L-OAS 標準の親イオンは、130.05 m/z (L-OAS からのアルコール基の損失と一致)、106.049 m/z (損失と一致) の 3 つのフラグメントイオンを含む 148.06 m/z の質量を生成しました。 L-OAS 上のアセチル基の値）、および 88.0396 m/z（脱アセチル化セリンからのアルコール基の喪失と一致します。図 3f）。

HPLC-MS を使用した反応バッファー中の L-セリンと L-OAS の保持時間、MS、MSMS 結果、標準曲線。 (a) 500 μM L-セリンの保持時間対カウントを示す HPLC クロマトグラム (0.9 分)。 (b) 純粋な 125 µM L-OAS 標準の HPLC クロマトグラム。 L-OAS (黒) および L-OAS から L-セリンへの断片化 (赤) は、1.1 分の保持時間で表示されます。 (c) L-セリン 106.05 m/z (L-セリンの分子量 (MW) 105.09) の ESI-TOF ポジティブモードピーク。 (d) L-OAS 148.0581 m/z (L-OAS の MW 147.13) および L-セリン 106.0499 m/z への断片化 L-OAS の ESI-TOF ポジティブモードピーク。 (e) 5 V での L-セリンのタンデム MS は、88.0396 m/z の単一フラグメントと 106.0499 m/z の無傷の L-セリンを示します。（ f ）5 VでのL-OASのタンデムMSは、88.0396、106.0499、130.0500のフラグメント、および148.0602 m/zで無傷のL-OASを示します。 (g) 標準曲線からの L-OAS のピーク面積と L-セリンへの断片化された L-OAS のピーク面積の間の直線関係。 (h) L-OAS の標準曲線 (濃度範囲は 1 mM ～ 7.8 μM)。挿入図の化学図は、観察されたフラグメントイオンと一致するフラグメント化を示しています。

純粋な L-セリン標準では、0.9 分の時点での L-セリンの質量のみが明らかになります (図 3c)。純粋な L-OAS 標準では、1.1 分の保持時間で L-セリンと L-OAS の両方の質量が明らかになり、0.9 分のセリンピークはありません (図 3b、d)。この観察は、HPLC 溶出後のエレクトロスプレーイオナイザーによる L-OAS 標準の L-セリンへの脱アセチル化と一致しています。元の L-OAS 標準にセリンが存在すると、別の保持時間が観察されたでしょう。

ESI による脱アセチル化が L-OAS の定量に影響を与えるかどうかをテストするために、L-セリンのピーク面積 (1.1 分) と L-OAS ピーク面積 (1.1 分) の比を L-OAS 標準曲線全体で比較しました。 L-OASのL-セリンへの断片化は濃度に比例することが観察されました（図3g）。したがって、私たちの方法はL-OASの検出と定量に適しています（図3h）。

A549 細胞における DcsE-FLAG-GFP の発現を観察した後、トランスフェクション培地から L-OAS が検出できるかどうかを調べました。 DcsE-FLAG-GFP およびネガティブコントロールとして FLAG-GFP を発現する A549 細胞の培地を HPLC-MS を使用して分析し、L-OAS を検出しました。 L-OASは、FLAG-GFPと比較して、DcsE-FLAG-GFPでトランスフェクトされた細胞の培地からは検出されなかった(図4)。両方のサンプルで、148.058 m / zの質量が同様の相対存在量で検出されました（図4b、c）が、L-OAS標準（図3f）に関連する不十分なフラグメントイオンが特定されました（図4d、e））。 FLAG-GFP トランスフェクション培地から 130 m/z のフラグメントが検出されました。これは、質量 148 m/z の化合物からアルコール基が失われたことを示しています。ただし、セリンピーク (106 m/z) とセリンフラグメントイオンは検出されませんでした (図 4d)。 DcsE-FLAG-GFPトランスフェクション培地からはフラグメントイオンは検出されず、質量148 m/zの化合物がL-OASではないことが示されました（図4e）。総合すると、L-OAS はトランスフェクション培地からは検出できなかったと結論付けられます。

DcsE-FLAG-GFP または FLAG-GFP でトランスフェクトされた A549 細胞の培地からは L-OAS は検出されません。 (a) FLAG-GFP (赤) および DcsE-FLAG-GFP (黒) トランスフェクション培地から検出された疑わしい L-OAS (148 m/z) のクロマトグラム。 (b、c) FLAG-GFP (b) および DcsE-FLAG-GFP (c) トランスフェクション培地からの 1.14 分の L-OAS の疑いを表す 148.058 m/z の ESI-TOF ピーク。 (d、e) (b) および (c) の 148 m/z のタンデム MS は、それぞれ、5 V で 84.0444、102.0545、130.0497、および 148.06 m/z のフラグメントを示します。 L-OAS 標準は検出されませんでした。

A549 細胞で産生された DcsE-FLAG-GFP が L-セリンとアセチル CoA の反応を触媒して L-OAS を形成できるかどうかを理解するために、FLAG タグを使用して細胞から酵素を精製しました。 FLAG-GFPおよびDcsE-FLAG-GFPが免疫沈降後に精製されたかどうかを確認するために、全細胞溶解物に対して免疫ブロット分析を実行し、免疫沈降から画分を選択しました（材料と方法および図5を参照）。予想どおり、DcsE-FLAG-GFP (67 kDa) および FLAG-GFP (28 kDa) がそれぞれの溶解物中に観察されます (図 5)。 FLAG-GFP および DcsE-FLAG-GFP はフロースルーまたは洗浄液では検出されず、FLAG アフィニティーゲルで発現タンパク質が捕捉されたことを示しています。 3 × FLAG ペプチドによる溶出後、FLAG-GFP および DcsE-FLAG-GFP の存在は、3 × FLAG ペプチドが標的タンパク質を溶出したことを示します。濃縮された溶出液中に余分なバンドが存在する場合は、タンパク質が部分的に分解されていることを示します。ライセートおよびフロースルー画分中のチューブリンの存在、および溶出液中のチューブリンの欠如は、FLAG-GFP および DcsE-FLAG-GFP が他の細胞タンパク質から精製されていることを示します (図 5)。これらの結果を総合すると、FLAG の沈殿と溶出により FLAG-GFP および DcsE-FLAG-GFP が精製されることがわかります。

DcsE-FLAG-GFP は、FLAG 免疫沈降後に精製および濃縮されます。トランスフェクトされた A549 細胞からの DcsE-FLAG-GFP (67 kDa) または FLAG-GFP (28 kDa) の精製からの示された画分のウェスタンブロット分析。レーンごとに 7 μl の指定された画分をロードしました。材料と方法で詳述されているように、膜は最初に抗 FLAG 抗体でプローブされ、次に剥離され、抗チューブリンを使用して再プローブされました。フルサイズのブロットとラダー画像が補足データとして提供されます（図S2）。

A549 細胞で産生された精製 DcsE が L-セリンとアセチル CoA の L-OAS への反応を触媒できるかどうかをテストするために、精製 DcsE-FLAG-GFP または FLAG-GFP の存在下で L-セリンとアセチル CoA を反応させました。コントロールを使用し、HPLC-MS を使用して予想される生成物 L-OAS を検出しました。 DcsE-FLAG-GFPを含むサンプルではL-OASが観察されましたが、FLAG-GFPは含まれませんでした（図6a）。 DcsE-FLAG-GFPによって生成されたL-OASの保持時間は1.117分（図6a）、m/zは148.0606（図6c）でした。タンデム MS は、DcsE-FLAG-GFP フラグメントによって 131.0335、106.0498、および 88.0395 m/z フラグメントに生成された L-OAS を示し (図 6d)、L-OAS 標準のタンデム MS データと一致します (図 3f)。 FLAG-GFP反応ではL-OASは検出されませんでした（図6b）。同時に、L-OASの標準曲線を実行し（図3h）、DcsE-FLAG-GFPによって生成されるL-OASを計算しました。 30 °C で 1 時間反応させた後、DcsE-FLAG-GFP が 40.3 μM L-OAS を生成することが観察されました。このことから、本発明者らは、A549細胞におけるDcsE-FLAG-GFPの活発な異種産生を結論付けた。

異種精製DcsE-FLAG-GFPによるD-CS中間体、L-OASの合成。 L-セリンおよびアセチル-CoAと反応した精製DcsEは、MassHunterで分析したHPLC-MSを使用して酵素生成物L-OASの存在によって決定されたように機能的でした。 (a) 1.117 分で DcsE-FLAG-GFP によって生成された L-OAS の HPLC クロマトグラム (黒色)。 FLAG-GFPを含む反応からはL-OASは検出されませんでした（赤色）。 (b) FLAG-GFP を含むサンプルは、1.117 分で 148.06 m/z の検出可能なピークを生成せず、L-OAS が生成されていないことを示唆しています。 (c) DcsE-FLAG-GFP を含むサンプルは、L-OAS の質量に対応する 1.117 分で 148.06 m/z の ESI-TOF ピークを生成します。 (d) DcsE によって生成された L-OAS のタンデム MS は、88.04、106.05、および 131.03 m/z のフラグメントを作成します。

この研究では、DcsE-FLAG-GFP をトランスフェクトしたヒト肺細胞が、D-CS 合成への最初のステップを触媒する機能的な DcsE を合成できることを観察しました。 D-CS は、生物学的に利用可能な前駆体を含む抗結核抗生物質の既知の最短経路であるため、結核に対する遺伝的化学予防の最適な候補です (表 1)。 FLAG-GFPでタグ付けされたDcsEはA549細胞で発現できますが（図2）、DcsE-FLAG-GFPトランスフェクション培地とFLAG-GFPトランスフェクション培地から検出されたL-OASの間には目立った違いはありません（図4）。しかし、精製されたDcsE-FLAG-GFP（図5）は、L-セリンとアセチル-CoAからのL-OASの形成を触媒します（図6）。精製されたDcsE-FLAG-GFPによって生成されたL-OASは、1.1分の予想保持時間（図6a）、148.13 m/zの質量（図6c）を有し、同じ106 m/zおよび131 m/zを生成しました。反応バッファー中の0.5 mM L-OAS標準（図3f）として、5 Vでフラグメントを生成します（図6d）。精製されたFLAG-GFPを含む反応物からはL-OASは検出されなかった(図6b)。

ヒト肺細胞における活性型 DcsE 酵素の産生は、結核に対する遺伝的化学予防に向けた進歩を示しています。これまでの研究では、イソニアジドなどの他の結核抗生物質が、HIV 感染者や結核皮膚検査で結核陽性と判定された人の結核感染を予防するために予防的に使用できることが示されています26。イソニアジドは化学予防的に使用される唯一の結核抗生物質ではありません。リファンピシン、ピリドキシン、およびリファンピシンとピリドキシンの組み合わせも、プラセボと比較して結核感染の発生率を低下させることが示されています27。

提案されている遺伝子治療に D-CS を使用する場合の制限の 1 つは、Mtb の最小発育阻止濃度 (MIC) が 10 ～ 50 μg/mL と比較的高く、体内でどれだけの D-CS が生成されるかによって治療の有効性が制限される可能性があることです。人間。この研究では、30 °C で 1 時間の反応後に 40.3 μM L-OAS が生成されました。これは 5.94 μg/mL L-OAS に相当します。これは、前駆体の濃度が D-CS の MIC よりも低いことを意味します。さらに、FLAG-GFP および DcsE-FLAG-GFP トランスフェクト細胞の培地では L-OAS は検出されなかったので (図 4)、DcsE および他の D-CS 生合成遺伝子を最適化する必要があります。

ただし、D-CS 発現が効果を発揮するには、完全な MIC 濃度に達する必要はありません。通常、D-CS は患者の MIC 濃度に到達せず、MIC に達することが治療効果には必要ないことを示唆しています。 D-CS は肺腔透過性が低いことで知られています。成人の臨床用量 250 mg は、肺内で 2 μg/mL 未満の濃度に達するだけです 28。これは、感染が軽度である間に細胞内で少量の D-CS が産生されることが臨床的に関連する可能性があることを意味します。人間のシステムの複雑な環境をより厳密にモデル化した条件での将来の実験では、生成される可能性のあるD-CSの現実的な濃度をより正確に決定できる可能性があります。たとえば、Beas-2B などの非癌細胞モデル、マクロファージ、および in vivo モデルを使用できます。さらに、in vivo モデルは、局所的な D-CS 発現が身体システムの器官レベルでどのように保護できるかをよりよく描写するでしょう。

結核に対する遺伝的化学予防法を安全に適用するために、図 7 に示すように、結核感染の存在下で特異的に D-CS を送達する切除可能な遺伝子治療を開発することを提案します。このような遺伝子治療は、副作用の場合に切除可能である必要があります。感染の場合に誘導され、結核に反応して特に活性化します。 CRE/loxP1 システムの部位特異的組換えは、副作用が発生した場合に dcsABCDEG を永久的に切除するために使用できます。図 7a に視覚化されているように、リコンビナーゼ CRE の発現はタモキシフェン 29 という薬剤によって活性化されます。発現すると、CREは2つのloxP部位を切断し、D-CSの生成に関与する構築物を切除します（図7b）。 CRE/loxP1 システムは、正確で、人間の細胞に天然には存在しない薬剤によって制御され、D-CS 発現を迅速かつ永続的に停止できるため、この用途に適したシステムです。さらに、dcsABCDEGは、感染の存在下で、適切な感染反応性プロモーターエレメント(InfRE;図7c)を介して選択的に発現される。例えば、MIP-2 プロモーターは、Mtb30、31 などの細胞内細菌の存在下でプラスミドを活性化するために使用できます。 MIP-2 プロモーターはあらゆる細胞内感染に反応するため、追加の分子工学が必要になります。これを達成するには、Mtb によって生成される MycP1 プロテアーゼ 32 を使用して、機能的な酵素の発現を制御できます。 DcsABCDEG を MycP1 特異的ポリペプチド SLKPASAGGG と繋ぐことにより、活性酵素が TB の存在下でのみ産生されることが期待されます。感染誘導プロモーター、結核の存在下で酵素の機能を制御する各酵素間のMycP1部位、およびCRE/loxP1によって制御される切除可能なプラスミドを我々の設計に含めることにより、D-CS合成遺伝子の発現が制御されます。

結核誘導性発現のための切除可能な D-CS プラスミドを提案。 (a) 提案された D-CS プラスミドのマップ。感染応答性エレメントプロモーター (灰色: InfRE)、タモキシフェン誘導性プロモーター (灰色: TAM)、DcsABCDEG および CRE 遺伝子 (赤色)、切除可能な loxP 部位 (金色)、Mtb MycP1 切断部位 SLKPASAGGG (点線)。 (b) loxP 部位で切断する CRE リコンビナーゼを発現するタモキシフェンによって活性化された、切除されたプラスミドを持つ細胞。 (c) 結核感染がない場合、DcsABCDEGを発現しない細胞。 (d) 結核感染の場合の DcsABCDEG を発現する細胞。

もう 1 つの重要な安全要素は、宿主による耐性です。図 1 に示すように、DcsA および B は L-アルギニンからヒドロキシ尿素を合成します14。ヒドロキシ尿素は、2 ～ 10 mM の濃度でヒト細胞に対して細胞毒性があることが知られています 33。これらの濃度は、予想される D-CS の生体内濃度である約 50 μM をはるかに超えていますが、将来の重要な研究分野は、ヒドロキシ尿素が毒性に達するかどうかを判断することです。または、細胞毒性効果を回避するのに十分な速さで DcsD によって消費されます。

遺伝的化学予防薬を送達するために使用されるシステムは、長期間持続し、耐容性が良好でなければなりません。アデノ随伴ウイルス（AAV）は、図7aで提案されているものと同様の構築物を送達する1つの方法です。 AAV は、一本鎖 DNA を含むタンパク質シェルを介して遺伝物質を送達する多用途かつ効果的な方法です 34。 AAV のゲノム容量は一般に約 4.5 ～ 5 kb であると考えられており、図 7 で提案されているプラスミドの推定サイズよりも小さいです。ただし、AAV の血清型である AAV5 は、最大 8.9 kb のゲノムサイズを組み込むことが示されています 35。これは、図 7 で提案されているプラスミドよりも大きいです。カチオン性リポソーム (CL) は、遺伝子治療を提供できる技術の別の例です。 CL は非ウイルスであり、閉じた脂質二重膜を使用して遺伝子を送達し、DNA を分解から保護します 36。 CL は非常にカスタマイズ可能で、最大 1,000kb36 を細胞に導入できるため、遺伝子治療用途にとってもう 1 つの有望な技術となります。全体として、AAV と CL は両方とも、構築組織を特異的、安全、確実に送達するために使用できる送達方法です。遺伝子治療の in vivo 送達は、AAV および CL37 を使用して比較的低いトランスフェクション効率を高めるための研究が活発な分野です。さらに、結核感染の性質と各細胞型のトランスフェクション効率に基づいて、マクロファージと肺細胞のどちらがこのアプローチの最終的なターゲットとして適しているかを判断するには、今後の研究が必要となるでしょう。

機能的な DcsE-FLAG-GFP の異種産生を観察することにより、予防的な D-CS 合成の最初のステップがヒト細胞で可能であるという証拠が得られます。私たちの当面の将来の方向性には、生きたA549細胞でこの酵素活性を観察する方法を開発し、最終的には提案されたプラスミドを介してD-CS経路の6つの酵素すべてを合成することに進むことが含まれます。さらに、将来の研究では、Beas-2B やマクロファージなどの非癌細胞モデルでこの研究を再現する可能性があります。最後に、提案されている遺伝的化学予防法の有効性を判断するには、最終的には in vivo モデルが必要になります。全体として、細胞ベースの治療の急速な成長に伴い、私たちは遺伝子治療が一般的で、安全で、経済的に妥当で、十分に受け入れられる将来の状態に備えるためのツールを今作成しようとしています。

A549 呼吸上皮細胞 (ATCC CCL-185) は、Kaighn 改変 Ham's F-12 K 培地 (ATCC 30 ～ 2004)、10% FBS (v/v; VWR 89,510 ～ 186) で構成される完全 F-12 K 培地で維持されました。、および 1% ペニシリン - ストレプトマイシン (v/v; ATCC 30-2300)。細胞は、A549 細胞の ATCC 取り扱いガイドラインに従って維持されました 38。

DcsE 遺伝子は、D-サイクロセリン合成細菌 Streptomyces lavendulae に存在します。 S. lavendulae (ATCC #11,924) は、凍結乾燥された形態で ATCC から入手し、供給者の指示 (ATCC、nd-c) に従って蘇生させました。微生物を酵母麦芽抽出液（5 g ブドウ糖、2.5 g ペプトン、1.5 g 麦芽抽出物、および 1.5 g 酵母抽出物を diH2O で 500 ml にしたもの）中で復活させ、同じ寒天培地に画線培養し、2 日後に増殖を起こしました。 26℃で接種。

次に、S. ラベンデュラの新鮮な液体培養物を単一コロニーから培養し、増殖後に細胞を溶解しました。 5 mlの細胞をペレット化し、200 μlのリゾチーム消化バッファーで洗浄しました。次に、細胞を 0.1 mm ガラスビーズの入ったスクリューキャップ遠心管に移し、30 秒間均質化しました。次に、PureLink Genomic DNA Minikit (カタログ番号 k182001) を使用して細菌からゲノム DNA を抽出しました。最終溶出溶液をナノドロップを使用して分析したところ、DNA に特徴的な 260 nm のきれいなピークが明らかになりました。 2 回の濃度読み取りを実行し、およそ 15 ng/μl の濃度を得ました。

DcsE は、NEB HiFi DNA システム (カタログ番号 E2621S) を使用して、Gibson アセンブリ (https://www.nature.com/articles/nmeth.1318) によってベクター pCOOFY50 (Addgene プラスミド #55,189) に最初にクローン化されました。表 3 に記載の PCR プロトコールに従って、プライマー AB0001 および AB0002 (表 2) と pHusion ハイフィデリティポリメラーゼ (NEB # M0530S) を使用して、20 ng の PCOOFY50 バックボーンを増幅しました。同様に、50 ng のゲノムフラグメントを使用して DcsE フラグメントを増幅しました。同じプロトコールを使用した S. lavendulae およびプライマー AB0009 および AB0010 からの DNA。 Zymo clean and concentrator kit (Zymo #D4004) を使用して PCR 産物をクリーンアップした後、NEB HiFi DNA システム (カタログ # E2621S) を使用して 2 つの産物の相同末端をアニーリングし、以下に説明するように DH5α E. coli に形質転換しました。

DcsEもGFPもpCOOFY50ベクターを使用して発現しなかったため、CMVプロモーターの下流にFLAG-GFPを含むpCS2 + (https://www.addgene.org/vector-database/2295/)にDcsEをサブクローニングしました。ＤｃｓＥを、ＰＣＲ増幅を使用してｐＣＳ２＋にサブクローニングし、続いて以下の改変を加えて上記のようにギブソンアセンブリを行った：プライマーＡＳＢ００１およびＡＳＢ００２を使用してｐＣＳ２−ＦＬＡＧ−ＧＦＰバックボーンを増幅し、プライマーＡＳＢ０１１およびＡＳＢ０１２を使用してｐＣＯＯＦＹ５０ＤｃｓＥからＤｃｓＥを増幅した。得られたプラスミドをpCS2-FLAG-GFPおよびpCS2-DcsE-FLAG-GFPと名付けた。

プラスミドのプロモーター配列とオープンリーディングフレームは、シカゴ大学総合がんセンター (UCCC) 配列決定施設のサンガー配列決定によって検証されました。

コンピテントDH5αをDcsE-FLAG-GFPまたはFLAG-GFPで形質転換するために、50μlのコンピテントDH5αと2μlの精製プラスミドを混合し、氷上で30分間インキュベートした。サンプルに 42 °C で 45 秒間ヒートショックを与え、氷上に 5 分間置きました。 800μlのSOCを加え、室温で1時間振盪した。この溶液 150 μl を 100 μg/ml アンピシリンを含む LB 寒天プレートにプレーティングし、37 °C で一晩増殖させました。 1 つのコロニーを 100 μg/ml アンピシリンを含む 5 mL の滅菌 LB ブロスに移し、37 °C で 12 時間振盪しました。 ZymoPURE Plasmid Miniprep Kit を遠心分離プロトコールに従って使用し、純粋なプラスミドを精製しました。

A549細胞をDcsE-FLAG-GFPまたはFLAG-GFPでトランスフェクトするために、細胞を完全F-12K培地中176,800細胞/mLの濃度で組織培養処理した60mmプレート上にプレーティングした。播種から 12 時間後、A549 細胞に関する Thermo Fisher ガイドラインに従って、リポフェクタミン 3000 (Thermo Fisher L3000) と 6 μg の精製プラスミドを使用して細胞をトランスフェクトしました 39。細胞を、37℃、4.5% CO2で12時間一晩トランスフェクトしました。 12 時間のトランスフェクション後、培地を収集し、その後の分析のために保存しました。

トランスフェクションの 12 時間後に、Nikon TE2-PS100W 電源、Chiu Technical Corporation 100 W 水銀ランプ (Kings Park、米国) を備えた Nikon Eclipse TE2000-U 倒立位相差顕微鏡 (東京、日本) を使用して、A549 細胞を画像化しました。ニコンNIS-Elementsソフトウェア。細胞画像は、10X 対物レンズ、1.5X ボーナスズーム、およびフェーズ 1 を使用して撮影されました。各位置について、微分干渉コントラスト (DIC) を使用して画像が撮影され、細胞の焦点を合わせ、青色光で GFP 蛍光を画像化しました。画像の結合には ImageJ を使用しました。

A549 細胞は、トランスフェクションとイメージングの直後に溶解されました。培地を除去し、細胞を 5 mL PBS (ATCC 30-2200) で洗浄しました。 150 mM NaCl、1% IGEPAL CA-630 (NP40)、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS (ドデシル硫酸ナトリウム)、50 mM Tris-HCl、pH 8.0 を含む 150 μl の冷ラジオ免疫沈降アッセイ緩衝液 (RIPA) 溶解緩衝液を添加しました。それぞれのお皿に。セルスクレーパーを使用して、細胞を氷上で約30秒間溶解しました。倒立顕微鏡を使用して、すべての細胞が溶解していることを確認しました。すべての液体を予冷した微量遠心管に移し、13,000xg、4℃で10分間遠心分離しました。上清を新しいチューブに移し、すぐに精製を行った。

細胞溶解物を直ちに精製して、粗溶解物中のプロテアーゼを除去した。 Sigma モノクローナル ANTI-FLAG M2 アフィニティーゲルを使用してタンパク質を精製し、シグマプロトコール「モノクローナル抗体アフィニティーゲルを使用した FLAG 融合タンパク質の免疫沈降」に従いました。免疫沈降の前に、TBS (0.5 M トリス HCl、pH 7.5、1 M NaCl) を使用してゲルを洗浄しました。サンプルは、3 × FLAG ペプチド (Rockland Immunochemicals) を使用し、TBS 中の作業濃度 150 ng/μL で 3 回溶出しました。溶出後、サンプルを 500 µl の 10 kDa 微量遠心フィルター (Amicon) を使用してろ過して過剰な 3 × FLAG ペプチドを除去し、溶解バッファーを 40 mM Tris-HCl (pH 7.6)、400 mM NaCl、2 mM を含む 10 × 反応バッファーに交換しました。 EDTA から改変され、サンプルを最終容量 50 μl に濃縮するために使用されます。

FLAG-GFP および DcsE-FLAG-GFP の存在は、abcam ウェスタンブロットプロトコル 40 を使用して検出されました。各画分 7 μl を 2.5 μl の 4 × LDS サンプルバッファー (Thermo Fisher NP0007) とともにレーンごとにロードしました。 5 μl PageRuler 染色済みプロテインラダーをリファレンスとして使用しました (Thermo Fisher 26,616)。製造元の説明書に従って、NuPAGE 4 ～ 12% Bis–Tris Gel (Thermo Fisher NP0321BOX) を NuPAGE MES SDS ランニングバッファー (Thermo Fisher NP0002) とともに使用しました 41。 Bio-Rad Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell を使用し、Bjerrum Schafer-Nielsen Transfer Buffer: Tris Base 48 mM および Glycine 39 mM (pH 9.2) を使用して 25 V で 30 分間、ゲルを PVDF 膜に転写しました。メンブレンは、PBS 0.1% Tween 20 中の 3% BSA (w/v) でブロックしました。一次抗 FLAG (Sigma F1804) を 3% BSA で 1:1000 に希釈し、二次抗マウス (Thermo Fisher 31,431) を希釈しました。 1:10,000。 ECL 基質 (BioRad 1,705,062) は、BioRad ChemiDoc Imaging System を使用して製造業者の指示 42 に従って使用されました。ウェスタンブロットは、再プローブ用のabcamストリッピングプロトコールを使用してストリップおよび再プローブされました43。一次抗チューブリン (NOVUS NB600-936) は 1:1000 に希釈し、二次抗ウサギ (Promega W401B) は 1:2000 に希釈しました。ブロットを上記のように画像化した。

in vitro L-OAS 合成 14 を実行するには、20 μl の精製 DcsE-FLAG-GFP および FLAG-GFP を、反応緩衝液中 1 mM L-セリンおよび 1 mM アセチル CoA の最終濃度で 50 μl の反応液中で反応させました。 4 mM Tris-HCl (pH 7.6)、40 mM NaCl、0.2 mM EDTA、および 1 mM ジチオスレイトール (DTT) を含みます。サンプルを 30 °C で 1 時間反応させました。

HPLC-MS を使用して、In vitro L-OAS 合成サンプルから L-セリンと L-OAS を検出しました。サンプルは、YMC ODS-AQ 2.0 mm × 100 mm、5 μm (YMC America) 水性 C18 カラムを備えた Agilent 1290 Infinity II HPLC、および統合型分析装置でポジティブモードの Agilent 6545 四重極飛行時間型 LC/MS 質量分析計を使用して分離されました。ノースウェスタン大学の分子構造教育研究センター (IMSERC) 施設。 1 μl のサンプルを、100% 溶媒 A (H2O + 0.1% ギ酸 (FA)) および 0% 溶媒 B (ACN + 0.1% FA) の濃度から注入しました。溶媒 B の比率は 2.0 分から 7.0 分まで 50% まで直線的に増加しました。 7.0分から9.0分まで、溶媒Bの比率は再び99%まで直線的に増加した。 11.0 分から 11.5 分まで、溶媒 A を 1.0% から 100% に増加させました。溶媒 A は、メソッド全体が 16 分に達するまで 100% のままでした。流量は 0.3 mL/min に設定され、すべてのサンプルは室温で実行されました。

この方法を使用して、500 uM ～ 3.9 uM の範囲の L-セリンおよび L-OAS の 1:1 段階希釈の標準曲線を作成しました。反応サンプルは、反応完了直後に等量のアセトニトリル（Sigma 34,851）中の0.1% FA（Sigma 5.43804）を添加することによって調製した。サンプルをボルテックスし、最高速度で 10 分間遠心分離し、75 μl の上清をオートサンプラーバイアルに移しました。上記と同じ方法を使用し、HPLC-MS を使用してサンプル中の生成物を検出しました。タンデム MS の場合、2.0 および 5.0 V の電圧が使用されました。 MassHunter Data Acquisition ソフトウェアを使用して機器を操作し、MassHunter 定性分析をデータ分析に使用しました (Agilent MassHunter Quantitative Analysis、バージョン 10.0、ビルド 10.0.10305.0。RRID:SCR_016657)。

この研究の基礎となるデータは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

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著者らは、HPLC-MS と蛍光顕微鏡の DebBurman Lab の使用を支援してくれたノースウェスタン IMSERC 施設の Fernando Tobias 博士と Ben Owen 博士に感謝します。著者らはまた、原稿を読んでくれた Rebecca Delventhal と Karen Kirk に感謝します。この研究は、レイクフォレスト大学生化学および分子生物学プログラムによって支援されました。

米国レイクフォレスト、レイクフォレスト大学、化学生化学および分子生物学プログラム学科

ローレル・ロビンス、アリアン・バララム、ステファニー・デジネカ、マシュー・マクマホン、ザリナ・ナジビ、ピーター・パブロヴィッツ、ウィリアム・H・コンラッド

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LR と WC は主要な原稿を書き、実験を計画しました。 LR はプラスミド設計を除くすべての実験を実行しました。 ZN は実験を設計し、図 1 の再現に貢献しました。AB はプラスミドの構築と検証を実行しました。 LR は図 7 を除くすべての図を作成し、MM は表 1 を作成しました。SD と PP は導入、実験、および図 7 に貢献しました。著者全員が原稿をレビューしました。

ウィリアム・H・コンラッドへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

ロビンス、L.、バララム、A.、デジネカ、S. 他。ヒト II 型肺細胞モデルにおける D-サイクロセリン中間体 O-アセチル-L-セリンの異種生成。 Sci Rep 13、8551 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35632-4

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受信日: 2022 年 10 月 19 日

受理日: 2023 年 5 月 21 日

公開日: 2023 年 5 月 26 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35632-4

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