トウモロコシとソルガムにおける効率的なランダム組み込みと標的ゲノム修飾のための葉の形質転換

Nov 12, 2023

Nature Plants volume 9、pages 255–270 (2023)この記事を引用

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草種の形質転換は伝統的に未熟な胚に依存してきたため、いくつかの主要なイネ科作物に限定されてきました。 葉組織を含む他の形質転換外植片も研究されていますが、成功率は低く、これが作物改良のためのゲノム編集の広範な適用を妨げる主な要因の1つです。 最近、形態形成遺伝子 Wuschel2 (Wus2) および Babyboom (Bbm) を使用した葉の形質転換が、Cas9 を介した突然変異誘発に使用されることに成功しましたが、大量の再生植物をスクリーニングする必要がある複雑なゲノム編集アプリケーションは依然としてとらえどころがありません。 今回我々は、Wus2/Bbm発現の増強によりトウモロコシやソルガムの葉の形質転換が大幅に改善され、Cas9を介した遺伝子ドロップアウトや標的遺伝子挿入を伴う植物の回復が可能になることを実証する。 さらに、トウモロコシに最適化されたWus2/Bbm構築物を使用して、4つのイネ亜科にまたがる8種で胚形成カルスと再生小植物体を作製することに成功した。これは、これがイネ科全体にわたる形質転換とゲノム編集のための普遍的な家族規模の方法につながる可能性があることを示唆している。

新しい表現型を持つ植物の遺伝子形質転換と再生は、初期の植物バイオテクノロジーにおける画期的な進歩であり、植物科学者の間で大きな期待を集めました。 しかし、アグロバクテリウム感染を用いたニコチアナ・タバカムの形質転換成功の最初の報告1の直後、タバコは例外であり、主要作物でこの技術の可能性を利用することは、形質転換や再生が不十分であれば妨げられることが明らかになりました2。 さまざまな植物種で形質転換の段階的な改善が続けられていますが、それらの多くでは、インビトロ操作に対する抵抗力により、このプロセスは制限されています。 各作物に形質転換方法と培養システムの最適な組み合わせを見つけるには、プロトプラストなどの単一細胞に至るまでのさまざまな外植片の評価が必要でした。 分裂組織、胚盤、子葉などの胚組織へ。 頂端/腋窩分裂組織、胚軸または葉などの苗木由来の組織に。 そして最後にインプランタの代替品へ。

CRISPR (クラスター化された規則的に間隔をあけられた短い回文反復配列)-Cas (CRISPR 関連) ヌクレアーゼに基づくゲノム編集技術の最近の開発により、改良された効率的な形質転換プロセスの必要性がさらに高まっています 3。 RNA 誘導性 Cas ヌクレアーゼは、ゲノム内に標的二本鎖切断を生成し、これは非相同末端結合 (NHEJ) または相同性指向修復 (HDR) 経路を通じて修復されます。 NHEJ は修復が不完全になる傾向があり、小さな挿入や欠失が生じることがよくありますが、HDR を使用すると、二本鎖切断部位と相同な領域を持つドナー DNA テンプレートを提供することで、事前に定義された修飾を導入できます。

タバコ、シロイヌナズナ、イネにおける Cas9 を介したゲノム編集の最初の報告以来、編集された植物種のリストは拡大し続けています 4、5、6、7。 しかし、NHEJを介した突然変異誘発と遺伝子ノックアウトは現在では一般的に行われていますが、他のタイプのゲノム編集（HDRを介した遺伝子挿入、大規模な欠失、逆位、転座など）は発生頻度がはるかに低く、多数の植物が必要です。再生およびスクリーニングして、目的の修飾が施されたものを見つけます。 この制限は、イネ科のほとんどの種 (インディカ米、トウモロコシ、小麦、大麦、ソルガム、パールミレットなど) に当てはまります。形質転換方法は未熟な胚に依存しており、一般に種および/または遺伝子型に大きく依存します。大規模な展開を制限します。 さらに、形質転換外植片として未熟胚を年間を通じて安定して供給するには、温室インフラが必要であり、ほとんどの学術機関にとってリソースとコストが法外なものとなっています。 その結果、変換サービス設備が必要なものになりました8。 したがって、高頻度の再生を伴う改善された形質転換プロセスは、これらの複雑なゲノム編集アプリケーションの前提条件になります9。

未熟胚ベースの形質転換における大きな進歩は、形態形成遺伝子 Wuschel2 (Wus2) と Babyboom (Bbm) の使用によってもたらされ、抵抗力のあるトウモロコシの遺伝子型から高頻度で植物を再生できるようになりました 10,11。 Wus2/Bbm の使用により、3 つのソルガム品種、Tx430、Tx623、および P898012 (参考文献 12、13)、および 2 つの公的トウモロコシ系統、FFMM14 および B104 (参考文献 15) の形質転換も改善されました。 さらに、Wus2 単独の発現は、トウモロコシの形質転換 16 およびソルガムのゲノム編集 17 の改善に効果的であることが示されています。 これらの報告に続いて、細胞分裂と胚形成組織の形成を刺激する他の遺伝子が同定され、使用されて同様の結果が得られています。 例えば、Grf4/Gif1 (参考文献 18) と Wox5 (参考文献 19) は、広範囲の小麦品種において未熟胚の形質転換と再生を改善しました。 しかし、一部の草種（竹、セタリア、テフ、小さなキビなど）では、種子や未熟胚が小さすぎて効率的に単離することができず、他の作物（サトウキビやバナナなど）は栄養繁殖します。

さまざまな研究グループが、草種の形質転換のための代替の出発外植片を研究してきました。 成熟種子のアグロバクテリウム感染によって容易に形質転換されるジャポニカ米 20 を除いて、これらのグループは、成熟種子由来の胚 21,22 または実生由来の葉基部 23,24,25,26 のいずれかを使用して、最初にカルス培養物を確立し、その後カルス培養物として使用した。アグロバクテリウム感染の標的。 トウモロコシの成熟胚スライスと葉基部組織セグメントを使用した繁殖力のあるトランスジェニック植物の再生によって実証されたように、Wus2 と Bbm の使用により、形質転換のための代替外植片のリストが拡張されました 10。 Lowe らによって開発された構築物 10 を使用した最近の報告では、switchgrass での葉基部の形質転換 27 と Eragrostis tef での遺伝子突然変異誘発の成功が示されています 28。 しかし、形質転換頻度を高め、イネ科植物内での方法を拡張し、最終的にはより複雑なゲノム編集アプリケーションを可能にするためには、さらなる改良が必要です。

今回我々は、トウモロコシとソルガムの実生由来の初期葉組織へのアグロバクテリウム感染後の不定胚の直接的な急速形成とT0植物の再生を刺激する、Wus2とBbmの発現を調節するプロモーターの新しい組み合わせについて説明する。 また、この改良された葉形質転換法により、トウモロコシにおける遺伝子ドロップアウトや標的遺伝子挿入など、Cas9 を介したゲノム改変が可能になることも実証します。 最後に、トウモロコシに最適化されたベクター設計、培地、および葉の形質転換プロトコルを使用して、イネ (インディカとジャポニカの両方)、テフ、スイッチグラス、パールミレット、アワ、大麦、ライ麦を含むさまざまな草種での葉の形質転換を実証します。

Wus2/Bbm を使用した以前の作業により、リーフ変換の最適化の出発点と新しい目標の両方が確立されました。 Lowe ら 10 は、ノパリン合成酵素 (Nos) プロモーターによって制御される Wus2 とユビキチン (Ubi) によって制御される Bbm を使用すると、胚形成カルスが生成され、10 ～ 12 週間後には、抵抗力のあるトウモロコシ遺伝子型のトランスジェニック植物を生成できると判断しました (我々の出発点)。 。 その後、Lowe ら 11 は、Wus2 と Bbm の発現を調節する異なるプロモーター セット (それぞれ Axig1 と Pltp) を使用して形態形成パルスを提供することにより、未熟な胚が急速に (7 ～ 14 日で) 体細胞胚を生成することを実証しました。 T0植物に再生されました。 したがって、葉の形質転換に関する我々の新たな目的は、標的遺伝子挿入などの複雑なゲノム編集アプリケーションを可能にする効率で迅速な葉の形質転換と植物の再生を可能にするプロモーターと組織培養条件の同定と評価でした。 さまざまなプラスミドのトランスファー DNA (T-DNA) 内の発現カセットで使用される遺伝子成分を補足表 1 に示します。

葉の胚形成反応を改善および加速する目的でプロモーターの組み合わせを評価するために、ヘルパープラスミド PHP71539 (pVIR9; 参考文献 29) を保有するアグロバクテリウム ツメファシエンス株 LBA4404 TD THY およびバイナリー ドナー ベクター (一般的な例として PHP96037 を参照。図1a) パイオニアトウモロコシ系統PH1V69の実生の下部からの葉組織を形質転換する。 葉の断片から生成されたカルスまたは直接不定胚の量を基準として、Wus2 および Bbm の発現を調節するプロモーターのさまざまな組み合わせを評価しました (スコアは図 2 に記載されています)。 トウモロコシ近交系PH1V69に関するこれらの実験結果を表1に要約する。一般に、Wus2/Bbmの発現が弱いと葉組織で胚形成が起こらないが、より強力なプロモーターおよび/または構成的プロモーターの異なる組み合わせでは胚形成応答の増加が生じた。

a、ランダム組み込み実験で使用される T-DNA ベクター: PHP86491 は、可視 (ZsGreen1) および選択可能 (Hra) マーカー遺伝子のみを含むコントロール ベクターです。 PHP96037 および PHP97334 は、それぞれ形態形成遺伝子 (Wus2 および Bbm)、Cre リコンビナーゼ、可視マーカー遺伝子 (ZsGreen1)、および選択マーカー遺伝子として Hra または NptII を含むベクターです。 b、形態形成遺伝子 (Wus2 および Bbm)、Cre リコンビナーゼ、Cas9、および 2 つの gRNA 発現カセット、可視 (ZsGreen1) および選択可能 (NptII) マーカー遺伝子を含む Cas9 媒介 Wx1 ドロップアウトに使用される T-DNA ベクター。 c、Cas9を介した標的遺伝子挿入実験の描写。（i）形態形成遺伝子（Wus2およびBbm）、Creリコンビナーゼ、Cas9およびgRNA発現カセット、選択マーカー遺伝子（Hra）、ドナーを含むT-DNAベクター。第２の選択可能マーカー遺伝子（ＮｐｔＩＩ）、Ｃａｓ９切断部位（または標的部位（ＴＳ））に隣接する相同アーム（ＨＲ１およびＨＲ２）、および可視マーカー遺伝子（ＺｓＧｒｅｅｎ１）を含むカセット； (ii) ゲノム標的部位と T-DNA 内の両方の標的部位の Cas9 切断による HDR を介した標的遺伝子挿入によるドナー配列の放出、および (iii) 標的遺伝子挿入遺伝子座と、標的遺伝子挿入遺伝子座の検出に使用される PCR プライマー ペアの位置HR1 (1) および HR2 (2) ジャンクション、および挿入全体にわたる長い PCR 産物 (3)。 RB および LB = アグロバクテリウム T-DNA の左右の境界配列。

これまでの研究から、Axig1 プロモーターと Pltp プロモーターの組み合わせにより、それぞれ Wus2 と Bbm 発現のパルスが生成され、これは未熟胚の胚盤上皮において 7 ～ 14 日以内に不定胚を刺激するのに十分な強さであることが知られていました 11。 しかし、葉組織では、この組み合わせ (PHP83652) は、それ以上成長することなく、蛍光を発する細胞の小さなクラスターを生成するだけでした。 同様に、Ubi::Bbm とともに Wus2 発現を駆動する日内調節プロモーター (Sweet 11 または Diurnal 10) を使用する 2 つの構築物は、増殖応答を生成しませんでした (それぞれ PHP96730 および PHP96731)。 弱い増殖応答 (+) が、オーキシン誘導性プロモーター (PHP81855 および PHP94636 の 8xDR5) を含むさまざまなプロモーターの組み合わせで観察されました。 PepC1(PHP95073)、Rubisco Ssu (PHP95205)、Cab (PHP95394)などの光合成プロモーター。 Diurnal 12 (PHP95074) および Diurnal 11 (PHP96032) などの日周プロモーター。 または 2 つのウイルス プロモーター、キャッサバ静脈モザイク ウイルス (CSVMV) (PHP95393) とサトウキビ桿菌状ウイルス (SCBV) (PHP95987) ですが、一般に、急速な胚形成増殖を誘発するには一時的すぎるか弱すぎます。 より一貫したカルス成長応答 (++) は、(1) 一過性 Bbm 発現を伴う構成的に発現された Wus2 (PHP81857)、(2) 構成的 Bbm を伴う一過性 Wus2 (PHP94715、PHP98564 および PHP98565)、または (3) 弊社のオリジナル番号: :Wus2/Ubi::Bbm の組み合わせ (PHP81858 または PHP97978)。 Wus2 および Bbm のそれぞれの発現を駆動する 3 つのプロモーターの組み合わせ (PHP95385 の Actin/Ubi、PHP96031 の Gos2/Ubi、または PHP97417 の Ubi/3xEnh–Ubi、3xEnh、Figwart Mosaic Virus (FMV)、Peanut Chlorotic Streak の 3 つの連続ウイルス エンハンサー)ウイルス (PCSV) およびミラビリス モザイク ウイルス (MMV); 補足表 1) は、14 日以内にある程度の不定胚形成を伴う、より急速な胚形成成長をもたらしました。 最後に、Wus2 のさまざまな構成プロモーター (Ubi、Actin、および Nos) と 3xEnh-Ubi::Bbm (PHP93925 ～ PHP103735) (表 1) は、葉断片の 60 ～ 80% で急速な不定胚形成を引き起こしました。 Bbm発現を駆動する3xEnh-Ubiプロモーターの存在（PHP97334およびPHP96277）は、Ubi::Bbmを使用したPHP97978およびPHP95385と比較して、BbmだけでなくWus2の転写レベルも大幅に増加しました（補足表2）。 また、2 つの特定の例で示したように、Wus2 の上流に発現カセットがあると増殖応答が低下することも観察されました。 まず、Nos::Wus2 の上流に Ubi::NptII (ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ II) を備えた PHP97335 は中程度の成長応答を生成しましたが、PHP97334 (Ubi::NptII が下流にある) は強力で急速な体細胞胚応答を生成しました。 次に、Actin::Wus2 の上流で Cre を駆動する熱ショックタンパク質 17 プロモーター (Hsp17) を備えた PHP93738 は中程度のカルス応答を引き起こしましたが、PHP95385 (Hsp17::Cre が下流) は急速な体細胞胚応答を引き起こしました。 テストしたすべてのコンストラクトのうち、PHP96037 と PHP97334 は、両方とも Nos::Wus2 と 3xEnh–Ubi::Bbm を持ちますが、2 つの異なる選択マーカーを持ち、一貫して強力で急速な増殖応答を示し、さらなる実験のために選択されました。

画像は、アグロバクテリウム感染から 14 日後の蛍光細胞と不定胚の成長をスコアリングした例を示しています。 画像は 3 つの独立した実験の代表です。 スケールバー = 1 mm。 NA = 結果として生じる組織が成長しないため、適用されません。

全体的な葉組織の形質転換プロセス (T0 植物の再生を含む) を評価するには、Wus2、Bbm、Cre、蛍光マーカー遺伝子 (ZsGreen1) および選択マーカー遺伝子 (高耐性 ZmAls (Hra) (PHP96037) または NptII を含むバイナリー ベクター) (PHP97334))をWus2/Bbmを欠く対照ベクター(PHP86491)と比較した(図1a)。 LoxP サイトが導入され、T0 植物再生の前に Wus2/Bbm および Cre 発現カセットの切除が可能になりました。 苗の準備と形質転換のプロセスを図3に示します。表面滅菌した種子を寒天で固めた培地上で14日間発芽させ（図3a〜c）、その後、中胚軸から約3 cm上の葉組織に発芽させました（図3d） ）を縦方向に二等分し、アグロバクテリウム懸濁液に浸漬しながらフードプロセッサーで機械的に切り刻みました（図3e）。 葉の断片を濾紙上に分配し、共生培地に24時間置き、その後、休止培地(RM)に7日間置きました(図3f)。 感染後約7〜10日後に、葉の断片から緑色蛍光の不細胞胚の形成が観察されました（図3g）。 濾紙上で3週間選択した後（図3h）、組織を含むプレートを45℃のインキュベーターに2時間移動してCre媒介切除を誘導し、その後、健康な胚形成組織の個々の部分を成熟期に移した。培地（図3i）、最後に発根培地（図3j）に移し、温室内の土壌に移す前に苗木の発育が完了しました。

ａ、トウモロコシ種子の表面殺菌。 b、発芽培地上のトウモロコシ種子。 c. 外植片源として使用した生後 14 日のトウモロコシの苗木。 ｄ、中胚軸の真上にある葉の輪生の３ｃｍの部分を調製し、続いて組織を縦方向にスライスする（図示せず）。 ｅ．組織を、ミニクイジナートブレンダー内のアグロバクテリウム懸濁液１００ｍｌに入れ、１０回の短いパルスにさらして、葉組織をさらにスライスした。 アグロバクテリウム懸濁液中で20分間インキュベートした後、液体を金属ふるいに通して葉の断片を収集し、乾燥濾紙上に簡単に吸い取って過剰なアグロバクテリウムを吸い取りました（図示せず）。 f、葉の破片を固体RM上の濾紙上に分配した。 g、アグロバクテリウム感染後 7 ～ 10 日で観察された蛍光不定胚の成長 (画像は 100 回を超える独立した実験の代表です。スケール バー、1 mm)。 ｈ、ＲＭ上で培養した後、葉組織を選択培地に移した。 i. 選択培地上の濾紙上で 3 週間培養した後、組織を 45 °C/70% RH に 2 時間置き（図示せず）、成熟培地に移し、さらに 3 週間培養しました。 ｊ、発根培地上で２週間後のＴ０再生体の形成。

形質転換された葉片内の体細胞胚の起源（拡張データ図1a、b）は、組織の組織学的観察に基づいて推測され、内部の葉の細胞から始まるように見える多細胞クラスターが明らかに示されました（拡張データ図1d–f） ）。 これらのクラスターは、不定胚が最終的に葉の表面から押し出されるにつれて成長し続けました（拡張データ図1c、f）。

ベクター PHP96037 を使用した 4 つの実験によるトウモロコシの硬い茎 (SS) 近交系 PH1V69 の葉組織形質転換の結果を表 2a に示します。 それぞれ葉の断片を生成するために使用した10本の苗木から開始する4回の反復で、回収されたトランスジェニックT0植物の数は6本(実験1および4)から14本(実験2)の範囲であり、平均形質転換頻度は98±43%となった。 (開始苗あたりの T0 再生体の数に基づいて計算)。 コントロールベクターPHP86491（図1a）を用いた3回の反復処理では、他のUbi::ZsGreen1含有プラスミドと同等のT-DNA送達が観察されましたが、これらの葉片では緑色蛍光の不細胞胚形成は起こらず、トランスジェニックT0も起こりませんでした。同じ形質転換プロトコルを使用して植物を回収しました。

これらの葉の形質転換実験では、単一コピーの組み込まれた T-DNA (選択マーカー遺伝子と蛍光マーカー遺伝子を含む) を含む高品質の T0 再生体が高い割合 (0% ～ 57%、平均 36 ± 25%) で生成されました。定量的 PCR (qPCR) によって決定された、他の場所に挿入されたバックボーン配列。 この高品質トランスジェニック イベントの数とこれらの実験で使用した開始苗の数を比較すると、平均頻度 40 ± 29% で、シングルコピー T0 植物を生産するための全体的な効率の明確な尺度が得られました。

シングルコピーのトランスジェニック再生体を温室で成熟するまで増殖させた。 T0 植物の表現型は、野生型 (非トランスジェニック) 種子由来植物の表現型と同等でした。 次に、T0 植物を自家受粉するか、または野生型植物と交配し、1 穂あたり平均 172 (11 穂) および 195 (17 穂) の種子を生産しました (補足表 3)。 36 個のシングルコピー T0 植物も、サザンバイシーケンシング (SbS) 技術を使用して分析されました 30 (補足表 4)。 27 植物 (75%) が「SbS パス」であり、Wus2、Bbm、および Cre が切除された組み込まれた T-DNA の完全なコピーが 1 つ存在し、結合されていない独立して分離された小さな DNA 断片は検出されなかったことを示しています。 残りの25％は、一塩基多型、連結または非連結フラグメント、プラスミドバックボーン、または不一致の境界配列などのさまざまな問題により失敗しました（補足表4）。

苗の急速な成長中に、葉が成長コンテナの蓋に接触することが多く、その結果、組織の壊死とフェノールの生成が発生しました。 この問題を軽減するために、ジベレリン調節伸長のアンタゴニストであるアンシミドール 31 を発芽および苗の成長培地に添加し、より短く、よりコンパクトな苗を生産しました。 さらに、PHP97334 ベクターを使用して実証されたように、実生のアンシミドール前処理により形質転換頻度が向上することも観察しました。このベクターには、PHP96037 と同じ Wus2、Bbm、Cre、および ZsGreen1 発現カセットを持つ T-DNA が含まれていますが、SiUbi::NptII で置き換えられている点が異なります。選択マーカー遺伝子としての SbAls::ZmHra (図 1a)。

3 つの異なる培地上で苗を 3 回別々に植えて実施したこの実験の 3 回の反復 (表 2b) では、アンシミドールの非存在下で生育した苗 (対照) は 103 ± 6% の平均形質転換頻度を示しましたが、いずれの 2 mg で生育した苗も同様でした。 l-1 または 4 mg l-1 のアンシミドールでは、平均形質転換頻度がそれぞれ 299 ± 50% および 246 ± 9% となりました。 2 つのアンシミドール治療は互いに有意な差はありませんでしたが (P = 0.32)、対照よりも大幅に高かったです (P < 0.02)。 3 つの処理 (0、2、および 4 mg l-1 のアンシミドール前処理) のすべてで、同様の割合で組み込まれた T-DNA の単一コピーを含む T0 植物が生成されました。

未熟胚について以前に観察されたように 32,33 、温度処理は下流の形質転換結果にプラスの影響を与える可能性があります。 この考えに基づいて、28℃で2mg/lのアンシミドールを補充した培地上で生育したPH1V69実生のサブセットを45℃および70％相対湿度（RH）で3時間インキュベートし、その後葉組織を収集した。アグロバクテリウム懸濁液の存在下での機械的断片化。 表 2c に示すように、対照処理では平均形質転換頻度 260 ± 101% が得られました。 実生を 45 °C で 3 時間前処理すると、形質転換頻度が 560 ± 85% と大幅に高くなりました (P = 0.002)。

この方法が一般的に使用されるトウモロコシ近交系 B104 で機能するかどうかを評価するために、45 °C/70% RH で 3 時間の前処理を行った 2 mg l−1 アンシミドールで生育した実生を組織源として使用し、記載されているように形質転換を実行しました。 PH1V69用。 各実験で7本の実生から始まる2つの反復では、生産されたT0植物の数は、それぞれ171％と186％の形質転換頻度で12と13でした（補足表5）。 これら合計 12 個と 13 個の T0 植物のうち、8 個と 7 個にはそれぞれ単一コピーの T-DNA 挿入があり、さらなる分析により、8 個中 4 個と 7 個中 5 個のイベントには無関係なプラスミド バックボーン配列がないことが示されました (補足表 5)。

当社の SS PH1V69 用に開発された葉形質転換法は、PHP97334 (Nos::Wus2 + 3xEnh–Ubi::Bbm を含む) を使用して、4 つのパイオニア非 SS (NSS) トウモロコシ近交系でもテストされました。まず、遺伝子型ごとに 21 ～ 24 本の苗から開始し、複製します。 近交系PH4257およびPNSS01は、アグロバクテリウム感染後の最初の14日以内に生成する不定胚の数が少なく、その結果、SS近交系PH1V69と比較して形質転換応答ランキングが低くなりました（補足表6）。 その結果、PH4257 はトランスジェニック植物を生成せず、PNSS01 については 3 つの T0 植物のみが再生されました (開始苗の数と比較して 13%)。

対照的に、他の 2 つの NSS 近交系 (1PYWK36 および 1PEEA63) は、近交系 PH1V69 と同様の強い初期体細胞胚反応を示しました。 それにもかかわらず、これら 2 つの近交系では、これらの不定胚から T0 植物への変換効率はかなり低く、T0 植物はわずか 10 株と 8 株しか生産されませんでした (形質転換頻度はそれぞれ 48% と 38%)。 しかし、アクチン制御Wus2を含む別の構築物(PHP96277)を使用した場合、近交系1PYWK36および1PEEA63では、再生されたT0植物の数がそれぞれ20および40(95%および190%)に増加した。 これら 4 つの近交系の結果は再現されておらず、総合すると暫定的なものですが、試験した 7 つのトウモロコシ近交系のうち 6 つで葉形質転換法が機能することを実証しました。

別の作物でトウモロコシの葉形質転換法をテストするために、同じアグロバクテリウム株、構築物、実生の成長、葉材料の調製、感染、共培養、休止培養、選択、Wus2/Bbm 切除、体細胞胚の成熟および発根を使用しました。ソルガム葉形質転換用培地。 PHP96037 には Hra 遺伝子が含まれていましたが、Wus2/Bbm の非存在下での最初の観察では葉組織からのバックグラウンド再生が観察されなかったため、このセットの実験では選択は使用されませんでした。 さらに、この一連の実験では、2 つの休止培地 (RM)、13266P 培地 + 50 mg l-1 メロペネムおよび RM + CB (100 μM 硫酸銅および 0.5 mg l-1 ベンジルアミノプリン) を比較しました。

4 つのソルガム (Tx430 品種) 実験の結果を表 2d に示します。 PHP96037 ベクターを使用したソルガム葉形質転換は、開始苗木ごとに回収されたトランスジェニック T0 植物の数に基づいて計算された高い再生頻度をもたらし、平均頻度は RM および RM + CB でそれぞれ 166 ± 96% および 297 ± 126% でした。 , 2 つのメディア間に有意差はありません (P = 0.15)。 T-DNA に Wus2/Bbm を含まない対照処理 (PHP86491) では、再生植物は生成されませんでした。 PHP96037 で形質転換した場合の高品質 (シングルコピー T-DNA/バックボーンフリー) T0 ソルガム植物の平均頻度は 35% ～ 37% であり、2 つの培地間に有意差はありませんでした (P = 0.87)。

急速な葉の形質転換によって生成された 23 個の単一コピー T0 ソルガム植物を、温室内で成熟するまで生育させました。 これらの植物は健康であり、野生型 Tx430 植物と同様の全体的な表現型を示しました。 SbS分析により、23本のT0植物のうち、17本に組み込まれたT-DNAの単一コピーが含まれることが実証されました（補足表4）。 21 の T0 植物 (91%) が肥沃で、種子セットは 1 頭あたり 667 ～ 3,255 個の種子の範囲であり、1 頭あたり平均 2,057 ± 900 種子でした (補足表 3)。

トウモロコシ近交系PH1V69の実生由来の葉組織における遺伝子ドロップアウトの効率を評価するために、Cas9と2つのガイドRNA（gRNA）発現カセットで補完された前述のコンポーネントを含むT-DNAベクター（PHP98784、図1b）を使用しました。 Gao et al.34 によって以前に記載されているように、内在性 Wx1 遺伝子に隣接する 2 つの部位を標的とします。 これらの実験では、近交系PH1V69の発芽培地に2 mg l-1のアンシミドールを使用し、アグロバクテリウム感染前に3時間の苗熱前処理を適用しました。

3 つの Wx1 ドロップアウト実験の結果を表 3 にまとめます。平均 514 ± 139% に対して 636%、544%、および 363% という高い変換頻度が観察されました。 T0 植物に対して行われた定量的 PCR 分析は、これら 3 つの実験でそれぞれ 4.4%、8.1%、および 8.0%、平均 6.8 ± 1.7% のドロップアウト頻度を示しました。

トウモロコシの葉細胞への HDR 媒介の標的遺伝子挿入をテストするために、2 つのほぼ同一の T-DNA ベクター (PHP99721 および PHP103735) を構築しました。 両方のベクターには、Wus2、Bbm、Cre、Cas9、gRNA、相同性アームとゲノム標的部位 (Chr1 上の 53.66 cM (参考文献 35)) と同一の配列が隣接する選択マーカー遺伝子 (NptII) を含むドナーテンプレート、 2番目の選択マーカー遺伝子（Hra）およびZsGreen1（PHP99721;図1c（i））。 2 つのベクターは、使用した 2 つの遺伝子型 (PH1V69 については PHP99721、Pioneer NSS 近交系 PHR03 については PHP103735) に特異的な相同アーム配列が異なりました。 以前に報告されたように 36、隣接する標的部位の存在により、gRNA および Cas9 の発現時に T-DNA からドナーテンプレートが放出されます (図 1c(ii))。 ドナーテンプレートの内側と外側にそれぞれ存在する2つの異なる選択マーカー遺伝子NptIIとHraを使用することで、選択マーカー遺伝子の位置に応じて標的挿入頻度を比較することができました（図1c（i））。

これらの実験では、苗木をアンシミドールを含む発芽培地上で生育させた。 2 つの異なるパイオニア独自の遺伝子型を使用して、合計 5 つの実験が実施されました。 実験 1 ～ 4 は近交系 PH1V69 で実行され、実験 5 は近交系 PHR03 を使用して実行されました。 実験 1 では、苗の熱前処理は行われませんでしたが、実験 2 と 3 では、アグロバクテリウム感染前に苗の半分を 45 °C、相対湿度 70% に 3 時間曝露し、残りの半分には熱前処理を行いませんでした。 実験４および実験５では、全ての苗に熱前処理を施した。 実験 1、2、3、および 5 では、NptII (ドナーテンプレート内) を選択マーカー遺伝子として使用しました。 実験 4 では、T0 植物の 1 セットは選択剤 (NptII 用) として G418 を使用して再生し、一方、植物の 2 番目のセットはエタメルフロン含有培地 (Hra 用) で再生しました。

5 つの実験すべての結果を表 4 にまとめます。熱前処理を適用しなかった実験 1 ～ 3 では、形質転換頻度 (苗木あたりの T0 植物の数) はそれぞれ 140%、262%、230% でした。平均は 211 ± 63%。 対照的に、温度前処理を使用した実験 2 ～ 4 では、変態頻度はそれぞれ 560%、570%、524% と大幅に増加し (P = 0.001)、平均は 551 ± 24% でした。 回避率 (選択マーカー遺伝子が検出されない再生体の数) は 9.0% ～ 10.9% の範囲でした。 T0 植物は、方法に記載されているように、診断用 HR1 および HR2 接合 qPCR によって HDR 媒介挿入イベントについて最初に分析されました (図 1c(iii))。 HR1 または HR2 接合部のみで qPCR 陽性であった T0 植物は、5% ～ 12.6% の範囲でした。 両方の接合部に対して陽性であった T0 植物 (表 4 の HR1&HR2 列) は、標的挿入頻度が 4 つの実験全体で同様である (P = 0.71) ことを実証しました。 熱前処理なしの場合は 4.5%、6.8%、および 5.2%、前処理ありの場合は 7.0%、5.6%、および 5.0%。

挿入部位全体（組み込まれたドナーを横切るHR1アームの外側のゲノム配列からHR2アームの外側の配列まで；図1c（iii））にわたる長いPCRを使用して、推定上の完全な挿入イベントの頻度を検出することができました。 。 実験 1 ～ 4 の非加熱前処理複製と加熱前処理複製の両方で、頻度は非常に類似しており、それぞれ 3.2%、2.8%、3.0%、および 2.7%、2.5%、2.6% でした。 これらの結果は、熱前処理により T0 植物の初期回復が大幅に増加したが、標的遺伝子挿入頻度は非常に一貫していたことを明確に示しています。 さらに、HR1 および HR2 接合陽性 T0 植物の総数に対する長い PCR 陽性イベントの数は、HDR と HR2 接合の組み合わせによって発生した不完全および/または複雑な挿入に関連する消耗の指標を提供します。 NHEJ経路。 実験 1 ～ 3 におけるこれらの頻度は、熱前処理を行っていない反復では 72%、41%、58% でしたが、熱前処理を行った両方の反復では値は 40% と 45% でした。

標的挿入頻度は、ドナーテンプレートの内側（NptII）にあるため標的部位に組み込まれるか、ドナーテンプレートの外側（Hra）（この場合、選択マーカー遺伝子はランダムに残される）のいずれかに位置する 2 つの異なる選択マーカー遺伝子を使用して比較されました。統合された T-DNA (実験 4)。 これら 2 つの処理を比較すると、初期形質転換頻度は同様でした。G418 を含む培地で選択した場合は 524% (エスケープ頻度は 9.8%)、エタメルフロンを含む培地で選択した場合は 579% (エスケープ頻度は 12.6%)でした。 ドナーテンプレート内の選択マーカー遺伝子による処理では、HR1&HR2-qPCR 陽性イベントの頻度は 5.0% で、最初の 3 つの実験で観察された頻度と同様でした。 比較すると、選択マーカー遺伝子がドナーテンプレートの外側にある場合、標的遺伝子挿入イベントの頻度は 2.9% と低くなりました。 2 つのグループの長期 PCR 陽性イベントの頻度は、それぞれ 2.6% と 1.5% でした。

実験５は、ＮＳＳ近交系ＰＨＲ０３における標的遺伝子挿入頻度を評価するために行われた（表４）。 同じ T-DNA 設計と選択マーカー遺伝子 (ドナー テンプレート内に位置) として NptII を使用すると、形質転換頻度は 205% (エスケープ頻度は 9.6%)、HR1 と HR2 の合計率は 2.2% で、最終的な長PCR頻度は1.2%でした。

HDR ベースの標的組み込みの伝達および分離パターンを評価するために、遺伝子挿入および T-DNA 成分 (Cas9、gRNA、Bbm) の存在について qPCR を使用して、実験 1 (表 4) の 3 つの T0 挿入イベントの 32 個の T1 植物を分析しました。 、Wus2、Hra、NptII）。 この分析の結果は補足表 7 にまとめられています。3 つの T0 植物すべてが、安定したメンデル遺伝と一致して、約 1:1 (40%、44%、および 56%) の分離比で T1 世代への挿入の伝達を示しました。単一対立遺伝子座の。 予想通り、挿入された T1 植物の約 50% には導入遺伝子がありませんでした。

T1 挿入陽性植物をサンガー配列決定によってさらに分析し、挿入の品質と完全性を検証しました。 10 個の T1 選択植物 (3 つの T0 イベントごとに 3 つまたは 4 つの植物) からの長い PCR 産物を配列決定し、コンティグに組み立てました。 10 個すべてのコンティグを比較したところ、配列の変動は示されず、すべての植物に正確な HDR 媒介遺伝子挿入があることが確認されました。

トウモロコシとソルガムでの結果に勇気づけられて、私たちは、Eragrostis tef、Panicum virgatum (スイッチグラス)、Cenchrus americanus (同名 Pennisetum glaucum、パールミレット)、Setaria italica (アワ) を含むイネ科の 9 種を使用して葉の形質転換の予備評価を実行しました。アワ）、Triticum aestivum（パイオニア春小麦）、Secale cereale（ライ麦）、Hordeum vulgare（大麦）、Saccharum officinarum（サトウキビ）およびOryza sativa（米）（図4a）。 この評価には、トウモロコシに最適化された方法が使用されましたが、アンシミドールや苗の熱前処理は行われませんでした。 葉の組織を苗の基部から採取し、手動で 1.5 ～ 3 mm の断片にスライスしました (拡張データ図 2)。 次に、葉片にPHP97334を含むアグロバクテリウムを感染させました（図1a）。 異なる種/品種に対して 6 ～ 120 本の苗木を使用しました (出発原料の入手可能性が限られていたため、種によっては数が少なかったものもあります)。 感染後4〜5日後に蛍光顕微鏡を使用してZsGreen1発現を評価したところ、試験したすべての種で良好なT-DNA送達が観察されました（図4b、左の顕微鏡写真）。 葉組織をさらに4〜5週間培養すると、蛍光を発する胚形成カルスが得られました（図4b、中央の顕微鏡写真）。 Wus2/Bbm切除後、組織を胚成熟培地で3週間、次に発根培地で2週間培養し、その時点で再生中の小植物を撮影した（図4b、右の写真）。

a、実験で使用した種と対応する亜科を示すイネ科の系統図。 形質転換と再生に成功し、T0 植物を生成した種は黒色で示されています。 形質転換されてカルス組織が生成されたが再生しなかった種は赤色で示されています。 b. 形質転換に成功したすべての草種の結果。 左側の画像は、アグロバクテリウム感染後 3 ～ 4 日後の ZsGreen1 の一過性発現を示し (スケール バー、500 μm)、さまざまな作物における相対的な T-DNA 送達を示しています。 中央の画像は、感染後 3 ～ 4 週間後の緑色蛍光胚形成カルス形成の例を示しています (スケール バー、1 mm)。 右の画像は、感染後 5 ～ 8 週間で土壌に移す準備ができている新芽と根を持つ回復した苗木を示しています。 画像は 3 つの独立した実験の代表です。

胚形成カルスは試験したすべての種で生成され（各種の個々の実験は補足表8にまとめられています）、健康な芽と根を持つT0苗木は9種のうち7種で再生されました（図4b）。 小麦とサトウキビの 2 種は T0 植物を生産できませんでした (拡張データ図 3)。 パイオニア小麦品種 PH456D の場合、不定胚は最初の 10 ～ 14 日以内に生成されましたが (初期の成長表現型に基づく)、胚形成能は低下し、次の 2 ～ 3 週間でカルスが再生できなくなりました。 サトウキビの場合、体細胞胚形成カルスが生成および維持されましたが、Cre 媒介切除を刺激するために使用される 45 °C の熱処理にさらされた後、胚形成形態はすぐに失われました。 サトウキビを用いた実験は、Lowe et al.10 に記載されているように、切除を促進するために Cre を駆動するアブシジン酸/乾燥誘導性 Rab17 プロモーターに熱誘導性プロモーターを置き換えて、将来繰り返される予定です。

イネ科種におけるアグロバクテリウム媒介形質転換および/または Cas9 媒介遺伝子編集を改善するための形態形成遺伝子の使用は、勢いを増し続けています。 トウモロコシの未熟胚形質転換を促進するための Wus2 と Bbm の組み合わせは、いくつかの抵抗力のあるトウモロコシ近交系で最初に報告されました 10。 これらの遺伝子の応用は、ソルガム形質転換 10,12、ソルガムゲノム編集 37、トウモロコシ公共近交系形質転換 14,15,38 およびトウモロコシゲノム編集 15,35,36,39 にさらに拡張されました。 最近、Wox5 は多数の小麦品種の形質転換を改善することも実証されており、Triticum monococcum、ライコムギ、ライ麦、大麦、トウモロコシなどの他の穀物にも応用できる可能性があります 19。 同様に、Grf5 はトウモロコシ近交系 A18840 の形質転換を改善することが示されており、Grf4/Gif1 遺伝子の組み合わせは小麦、米、ライコムギのトランスジェニック イベントの成長と再生を刺激することが示されています 18。 しかし、上記の進歩は引き続き未熟胚の形質転換に依存しており、これが多くのイネ科作物にとって制約となっており、研究者が組織培養および形質転換のための代替外植片を探索する動機となっている。

葉の基部は、ほぼ 40 年にわたって魅力的な組織培養外植片であり、コムギ 41,42,43,44、エンバク 45,46、オオムギ 47,48、ライ麦 49、トウモロコシ 23、イネ 50 などの多数のイネ科種でカルスの開始と再生が実証されています。アポミック草51． したがって、研究者らは葉の基部を使用して、アグロバクテリウム感染およびトランスジェニック植物の再生の標的外植片として胚形成カルスを生成した（例えば、トウモロコシ 23、インディカ米 24,52、マタケ 25、およびテオシント 26）。 しかし、トランスジェニック植物が作出されたオーチャードグラス (Dactylis glomerata) での報告 53 を除いて、葉の基部組織が形質転換の直接標的として使用されている研究は、イネ 54、コムギ 55 およびトウモロコシ 56 における一過性の導入遺伝子発現のみを実証することに限定されていました。

Lowe ら 10 は、形態形成遺伝子 Wus2 および Bbm の使用により、アグロバクテリウムを介した根元葉組織の直接形質転換と、ランダムな導入遺伝子の組み込みによるトウモロコシ植物の回復が促進されることを示しました。 最近、この方法は Panicum virgatum27 のランダム形質転換および Eragrostis tef28 の Cas9 媒介突然変異誘発に拡張され、Wus2/Bbm が他の草種における直接の葉基部形質転換を促進できることが実証されました。 しかし、Cas9 媒介ゲノム編集の真の可能性を裏付けるためには、標的の HDR 媒介遺伝子挿入や大規模な染色体再構成などの複雑なゲノム修飾を回復するために必要な多数の植物を生産するには、依然として大幅に高い形質転換率が必要です9。

このニーズに対処するために、我々は、新しいプロモーターによって調節されるWus2とBbmのアグロバクテリウム媒介送達が、トウモロコシとソルガムの葉基部の形質転換を有意に上昇させることができることを示す。 これまで、Wus2/Bbm を介した未熟胚の形質転換には 2 つのプロモーターの組み合わせが使用されてきました。 最初の方法では、Wus2 と Bbm の発現をそれぞれ駆動する Nos と Ubi プロモーターの使用により、胚形成カルスの発生が刺激されましたが、数週間の培養とその後の植物再生前の形態形成遺伝子の切除が必要でした 10,12。 2 番目のプロモーターの組み合わせ、Wus2 の場合は Axig1、Bbm の場合は Pltp は、迅速な不定胚形成を刺激し、後の切除を必要としませんでした 11、14、15、57。 Lowe ら 10 は、Nos::Wus2 および Ubi::Bbm を使用したトウモロコシの葉の形質転換により、感染後最初の 2 週間以内にほとんど発達しない弱い胚形成カルスが開始されることを実証しました (表 1、PHP81858)。また、Axig1::Wus2 および Ubi::Bbm を使用すると、 Pltp::Bbm は、葉外植片において強力な一過性発現をもたらしましたが、その後の不定胚形成を引き起こしませんでした (表 1、PHP83652)。 これにより、多くの異なるプロモーターの組み合わせをテストすることになり、その一部は遅い (++) 速度または速い (+++) 速度で不定胚を生成しました (表 1)。 これらのプロモーターの組み合わせはトウモロコシには最適ではありませんが、さらなる実験により他の草種でも有用であることが判明する可能性があります。 Nos、Actin、または Ubi プロモーターが Wus2 発現を制御し、Bbm が FMV::PCSV::MMV::Ubi プロモーター (Ubi プロモーターの上流にある 3 つのウイルス エンハンサー) によって制御された場合に、構築物のグループで最良の結果が得られました。 トウモロコシとソルガムについては、さらなるメソッド開発のために Nos::Wus2 と 3xEnh–Ubi::Bbm に焦点を当てました。

形質転換頻度は、アンシミドール上で苗を生育させ、葉外植片の収穫およびアグロバクテリウム感染の前に熱前処理を行うことによってさらに高められた。 感染直前の熱曝露の利点は、イネ58、トウモロコシ44,58、ソルガム32の未熟胚形質転換で見られるものと同様であり、熱ショックタンパク質の蓄積がアグロバクテリウム感染のストレスを軽減する可能性があることが示唆されている。 アンシミドールへの曝露とストレス軽減との関連性はあまり明らかではない。 むしろ、胚形成反応の亢進について考えられる説明の 1 つは、アンシミドール処理した葉の基部が発生中の葉肉細胞に顕著な量のデンプンを蓄積するという観察に関連している可能性があります (拡張データ図 4)。 デンプンの蓄積と不定胚発生の改善との間の相関関係は他のシステムでも指摘されており 59,60,61 、デンプンは不定胚の発生をサポートする容易に代謝可能なエネルギー源であることが示唆されています。 その結果、PH1V69 では、アンシミドールで 260%、アンシミドールと熱前処理の組み合わせで 560% の平均形質転換頻度 (開始苗あたりの T0 再生体の数) を達成しました (表 2c)。 PH1V69 用に開発されたプロトコルは、パイオニア NSS 近交系 PHR03 と公衆回線 B104 をそれぞれ約 200% と 180% の頻度で形質転換するのにも成功しました。 他の試験された NSS 系統の形質転換頻度は 13 ～ 190% でした。 現時点では、アグロバクテリウム感染に使用される外植片が非常に異なるという理由だけで、未熟胚の形質転換の効率と実生由来の葉の形質転換の効率を比較するための共通の指標がありません。 また、機械化された葉の断片化にミニクイジナートを使用する場合、生成される個々の葉片の集団は数とサイズがばらつきすぎて、効率を計算するための再現可能な開始点を提供できません。 したがって、我々は、実験間、近交系間、草種間で葉の形質転換頻度を比較する際に、共通分母として開始苗の数を使用することにしました。 この測定に基づいて、トウモロコシ近交系 PH1V69 とソルガム品種 Tx430 は出発苗木ごとに多数の T0 トランスジェニック イベントを生成し、試験された他の近交系 (B104 など) はより低い結果を生成したと明白に言えます。 B104 および他の近交系では、より多くの研究室がアグロバクテリウム感染のためにこの組織を扱うことや、B104 で開発されたアグロバクテリウム媒介未熟胚形質転換のための改変三元プラスミド系などの新たな改良により、葉の形質転換頻度はおそらく改善し続けるでしょう (参考文献 62)。 ）葉組織に影響を及ぼします。

葉の直接形質転換には、組織培養材料の自動化と取り扱いの改善を可能にする他の利点もあります。 具体的には、面倒な胚の単離手順が簡単な実生由来の葉組織の調製に置き換えられ、断片化がブレンダーを使用して自動化され（外植片調製のばらつきが減少する可能性がある）、アグロバクテリウム感染が混合容器内で直接行われます。 また、未熟胚の継代は胚を1つずつ新しい培地に移し替えて行いますが、形質転換された葉片は濾紙上に置かれるため、培地間の移動が容易で、時間と労力を大幅に削減できます。 未熟胚の方法を長年悩ませてきた季節変動に加えて、年間を通じた胚生産の必要性がなくなる 15 ことと相まって、これらの利点により、形質転換が容易になり、より実用的で、再現性があり、人間工学的に優しく、幅広い重要な草種に広く適用できるようになります。

未熟胚の培養と草種の形質転換の初期の頃から、不定胚の形成が胚盤上皮で起こることは常に明らかでした 63,64。 しかし、葉ベース培養の場合、培養反応の起源は未解決のままでした。 さまざまなイネ科種にわたる、インビトロ培養操作およびカルスの生成に応答する葉基部組織に関する多くの報告にもかかわらず 24、25、43、47、50、関与する特定の細胞タイプは明らかではありませんでした。 アグロバクテリウム感染後 5 ～ 7 日後の蛍光を発する多細胞クラスターの観察と合わせた我々の組織学的分析 (拡張データ図 1) は、不定胚が主に葉の内部細胞から形成されるように見えるという Lowe らの初期の観察を裏付けており、この観察は一貫しています。オーチャードグラスの葉組織からの胚の成長65と、OsBbm1遺伝子を構成的に発現するイネの葉での観察66。 蛍光多細胞クラスターの豊富な初期形成（拡張データ図1a〜c）と、そのような初期の成長応答の一部のみからトランスジェニック植物を回収する現在の頻度に基づいて、おそらくこの方法はさらに改善される可能性があります。単に培養プロセス中の消耗率を減らすだけです。

また、パイオニア独自のトウモロコシ SS 近交系 PH1V69 で達成された葉基部の形質転換レベルが、Cas9 を介したさまざまなゲノム修飾 (NHEJ ベースの突然変異誘発、遺伝子ドロップアウト、HDR によって促進された標的遺伝子挿入) を伴う植物の回復を、次のような頻度でサポートしていることも実証しました。未熟胚から得られたもの35、36、39。 ゲノム編集で考慮すべきもう 1 つの重要な側面は、形態形成遺伝子による増殖刺激の寄与であり、これに付随して細胞周期の進行と細胞分裂が加速され、Cas9 を介した修飾の全体的な効率に寄与します。 したがって、未熟胚でWus2/Bbmを使用する利点は、トウモロコシにおいて遺伝子ドロップアウト35,34およびHDR媒介組み込みイベント36,39の回復を促進することが実証されている。 さらに、T0 ソルガム植物における回復された遺伝子ドロップアウトの頻度は、単により多くの T0 植物を生産することによって説明できるレベルを超えて、Wus2 によって強化されます 17。 Peterson et al.36 が推測しているように、ゲノム改変実験で形態形成遺伝子を使用することのさらなる利点は、細胞分裂の刺激であり、遺伝子のドロップアウトや HDR を介した挿入など、より効率的な複雑な形のゲノム編集に役立つ細胞環境を提供します。 トウモロコシの葉の基部に関する我々の結果は、これらの解釈と一致しています。

要約すると、我々の結果は、トウモロコシとソルガムの形質転換とゲノム編集のための開始外植片として葉の基部を使用することの潜在的な利点を明確に示しています。 トウモロコシについては、トランスジェニック T0 植物生産とゲノム編集の両方の高効率という点でこの方法の可能性を示しました。 さらに、複数のトウモロコシ近交系と代表的なイネ科種群について、葉の形質転換と小植物の再生が成功したことが実証されました。 単一の手法が広範囲のイネ科植物に使用できるようになり、形質転換およびゲノム編集手法をイネ科全体に拡張する可能性が開かれています。

B104 公開系統に加えて、パイオニア独自の Zea Mays 系統 PH1V69、PHR03、PH4257、PNSS01、1PYWK36 および 1PEEA63 の種子を形質転換実験に使用しました。 ソルガム バイカラーには、Tx430 系統の種子を使用しました。 追加のイネ科種に対して形質転換を実施しました：Eragrostis tef (teff 品種 DZ-01-354)、Panicum virgatum (スイッチグラス品種 Performer)、Pennisetum glaucum (同義語 Cenchrus americanus、パールミレット品種 ICMB93333)、Setaria italica (アワ)、 Triticum aestivum (パイオニア春小麦品種 PH456D)、Secale cereale (ライ麦、冬品種エメラルドおよびピエール)、Hordeum vulgare (大麦、品種 Golden Promise および Morex SPDL2)、Saccharum officinarum (サトウキビ品種 CPCL02)、Oryza sativa (両方ともインディカ品種 IRV95)ジャポニカ品種北明）。

成熟した種子を80%エタノール溶液で3分間表面滅菌し、続いて0.1% Tween-20を含む30%クロロックス漂白剤溶液で20分間インキュベートし、最後にオートクレーブ滅菌水でそれぞれ5分間ずつ3回すすいだ。 滅菌種子を固体90O培地に移して発芽させた(補足表9)。 in vitro発芽と苗の成長は、28℃、80μmol m-2 s-1の光強度下、16時間明期/8時間暗期の光周期で行われた。

表面滅菌種子を、アンシミドールを含まない発芽培地(0 mg l-1 アンシミドールを含む対照培地90O)、または2または4 mg l-1 アンシミドールを加えた90O培地(Sigma Aldrich、製品番号 A9431)に播種しました。 苗の発芽と成長は、28℃、16時間の光周期を使用して80μmol m-2 s-1の光強度下で起こり、すべての反復実験と処理について14日目に形質転換のために苗が収穫されました。

表面滅菌種子を発芽培地９００プラス２ｍｇ ｌ−１アンシミドール上に播種した。 実生の発芽および成長は上記のように起こった。 外植片を収穫する前に、生後 12 ～ 18 日の苗木を 45 °C/70% RH のインキュベーターに 3 時間入れました。

以前の研究では、アグロバクテリウム株 LBA4404 THY- におけるヘルパー プラスミド pVIR9 (PHP71539) の組み合わせは、トウモロコシの形質転換での使用に非常に有効であり 29、未熟胚 10、11、16 および現在の葉に対する Wus2/Bbm 法の最適化に不可欠な要素となっています。組織。 ヘルパープラスミドPHP71539およびバイナリードナーベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス株LBA4404 TD THYを、-80℃で凍結したアリコートから固体12R培地（補足表10a）上に画線培養し、暗所で28℃で2日間培養して、マスタープレートです。 作業プレートは、アグロバクテリウム感染に使用する前に、12R で成長させたマスター プレートから新鮮な 810K 培地 (補足表 10b) に 4 つまたは 5 つのコロニーを画線し、28 °C の暗所で一晩インキュベートすることによって準備されました。 実生の葉組織を調製する直前に、アグロバクテリウムを700F感染培地に懸濁および分散させた(補足表11b)。

実生を手動で解剖した場合（以下を参照）、10 mlの700J培地（補足表11a）、20μlのアセトシリンゴン（100 mMストック）および0.02％（v/ ｖ）界面活性剤（ＢＲＥＡＫ−ＴＨＲＵ Ｓ ２３３、Ｅｖｏｎｉｋ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ＧｍｂＨ）を５０ｍｌコニカルチューブに入れた。 アグロバクテリウムを作業プレートから収集し、50 ml チューブ内の感染培地に移し、均一に懸濁するまでボルテックスしました。 懸濁液の光学密度(OD)を550nmで測定し、ODが0.6になるように調整した。 最終的なアグロバクテリウム懸濁液を、０．４μｍの透過性培養インサート（それぞれＦａｌｃｏｎ、部品番号３５３０４６および３５３０９０）を含むＣｏｒｎｉｎｇ６ウェルプレートに等分し、各ウェルに約８ｍｌの懸濁液を入れた。

Cuisinart Mini-Prep Food-Processor (下記参照) での機械化された葉の断片化のために、100 ml の 700J 培地、200 μl のアセトシリンゴン、および 0.02% (v/v) BREAK-THRU S を組み合わせて感染混合物 (700F) を調製しました。 223. アグロバクテリウムの約半分から全作業プレートを100 mlの混合物に移し、550 nmでのODが0.6に調整された。

苗木は上記のように成長させた。 生後 12 ～ 18 日の体外発芽苗から葉の基部部分 (中軸上約 2.5 ～ 3.0 cm の部分) を滅菌ハサミで採取し、外側の葉を剥がして廃棄しました。 残りの葉の基部の円筒を、滅菌したNo. 1 を使用して長さ方向に二等分し、2つの長さの半分に分けた。 10メスの刃。 次に、二等分された葉の輪生の半分を手動でさらに解剖するか、ブレンダーで機械的に処理しました。

二等分した葉の輪生セグメントをより小さな葉の外植片（約3 mm）に断面化し、これを、8 mlの既製アグロバクテリウム懸濁液（培地700°F、補足表11b）を含む6ウェル培養プレートに設置された透過性培養インサートに移しました。室温で 20 分間感染させます (拡張データ図 2)。 感染後、アグロバクテリウムに感染した葉片を含むカルチャーインサートを 6 ウェルプレートから取り出し、オートクレーブした乾燥濾紙上に置き、残留アグロバクテリウム溶液を吸い上げて除去しました。 次に、感染した葉の切片を、710N固体共培養培地上に置いた新しい濾紙(VWR 直径7.5cm)上に移した(補足表12)。 鉗子を使用して葉の部分を濾紙上に均一に分散させ、それらが成長するのに十分な余地を確保した。 感染した葉組織を暗所で 21 °C で 2 日間インキュベートしました。

二等分した葉の輪生を、100 mlの既製アグロバクテリウム感染培地（700F）を含むCuisinart Mini-Prep Food-Processor（MODEL DLC-1SSTG、70％エタノールを使用して事前滅菌）のボウルに直接落としました。 実験の反復ごとに、葉の輪生の総数 (二等分された葉の輪生をそれぞれ生成するために使用された苗の総数に相当) は異なりました。 結果表に記載されている数字は、各反復における開始苗の数です。 葉のセグメントを低速設定で 10 回の速いパルスで切り刻みました。 刻んだ葉組織を、アグロバクテリウム懸濁液の入った容器内に２０分間放置し、この感染期間中に２〜３回穏やかに撹拌した。 感染後、懸濁液中のすべての切り刻まれた葉組織をオートクレーブ処理したステンレス鋼メッシュふるい (Target.com 品目番号 53142252) に注ぎ、アグロバクテリウム懸濁液を排出しました。 感染した葉組織を、空のペトリ皿内のオートクレーブ処理した２層の濾紙上に移し、残留アグロバクテリウム懸濁液をブロット乾燥した。 次に、およそ 1 つまたは 2 つの播種からの感染した葉組織を、固体共培養培地 710N の表面に置かれたオートクレーブ処理した濾紙上に移し、均一に分散させました。 感染した葉組織を暗所で 21 °C で 2 日間インキュベートしました。

2日間の共生培養後、葉セグメントを支持する濾紙を710Nから13266P RMに移し(補足表13)、選択せずに28℃の暗所で1週間培養した。 次に、組織断片を囲む濾紙を選択培地（NptII選択の場合は13266Pプラス150 mg l-1 G418、またはHra選択の場合は0.1 mg l-1 エタメルフロン;それぞれ補足表14a、bを参照）上に移しました。 選択培地上で 3 週間培養した後、プレートを温度/湿度制御されたインキュベーター (45 °C/70% RH) に 2 時間入れて、Hsp17 プロモーターを刺激し、Cre を介した Wus2、Bbm、および Cre の切除を誘導しました。リコンビナーゼカセット。 プレートをインキュベーターから取り出し、プレートが冷えるまで室温で１〜２時間保持した。

室温での熱処理と温度平衡の後、新たに発達した不細胞胚を含む葉切片を濾紙なしで成熟培地404（補足表15）に移し、28℃の暗所で2週間培養した後、26℃の暗所で培養した。 °Cの明るい部屋でさらに1週間保管します。 小さな苗条を支えている葉の部分を、よく形成された根が発達するまでさらに 2 ～ 3 週間発根培地 272M (補足表 16) に移し、その時点で苗木は温室内の土壌に移す準備が整いました。 各 T0 植物が独立したイベントであることを保証するために、各葉片から最も活発に成長している小植物体 (複数の不定胚が発生することが多い) のみを発根培地に移し、最後に温室に移しました。

Wus2 および Bbm の転写レベルに関する形質転換された葉片の分子分析は、いくつかの修正を加えて以前に記載されたように 67 実行されました。 簡単に説明すると、サンプルを RB Lysis Buffer (Omega Bio-tek) 中で粉砕し、続いて等量の 70% エタノールを加え、深さ 2 ml の Nunc Glass 結合精製プレート (Thermo Fisher Scientific) に移すことによって全 RNA を単離しました。 -ウェルプレート。 プレートをＱｉａｇｅｎ ＡｉｒＰｏｒｅシート（Ｑｉａｇｅｎ）で覆い、遠心分離し、ＲＮＡ洗浄緩衝液ＩおよびＩＩ（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ－ｔｅｋ）で連続的に洗浄した。 Nunc Glass結合プレートで2分間インキュベートした後、95℃に加熱したヌクレアーゼフリー水でRNAを溶出し、その後遠心分離して96ウェルプレートにRNAを回収しました。 Roche Recombinant RNase-free DNAse I (Roche Diagnostics Corp.) を使用して RNA サンプルから DNA を除去し、Applied Biosystems High Capacity cDNA Reverse Transcription キット (Thermo Fisher Scientific) を製造者の指示に従って使用して相補 DNA を合成しました。 加水分解プローブを使用して定量的 PCR を実施しました。 プライマーとプローブは、Applied Biosystems Primer Express ソフトウェアを使用して設計されました。 加水分解プローブベースの PCR は、Applied Biosystem Viia7 リアルタイム PCR 装置で Bioline Sensi-fast mix (Bioline) を使用し、メーカーの条件で実行されました。 相対的な遺伝子発現は、トウモロコシ真核生物開始因子 4-ガンマ遺伝子 (GenBank アクセッション番号 EU967723) に対して正規化することによって計算されました。 転写物分析に使用されるプライマーとプローブのリストを補足表 17 に示します。

Peterson et al.36 で参照されているように、ドロップアウトおよび HDR 媒介遺伝子挿入イベントの分子分析を実行しました。 定量的PCRは、QuantiTect Multiplex PCR Master Mix (Qiagen)を用いて、製造業者の指示に従って(HR1/HR2検出を除く)、ViiA 7 Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific)で実施した。 補足表 18 には、Wx1 ドロップアウト産物、HR1/HR2 接合部、T-DNA 成分、および HDR 標的部位変異を検出するために使用されるプライマーおよびプローブがリストされています。 Wx1 ドロップアウト産物 (110 塩基対) を検出するために、内因性 Wx1 標的部位 (3.8 キロベース) をプライマー/プローブで隣接させました。 プライマーとプローブを使用して、T1 分離コピー数に関する T-DNA 発現カセット成分 (Wus2、BBM、Cas9、gRNA、および Hra) および HDR 媒介挿入産物成分 (SiUbi プロモーター、NptII および SiUbi ターミネーター) を特徴付けました。 T1 qPCR 特性評価では、LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix (New England Biolabs) を使用したロングインサート スパン PCR とその後のアガロース ゲル電気泳動を組み合わせると、イベントの完全性を最もよく理解できます。 HDR 標的部位に隣接するゲノム プライマー (フォワード プライマー 5'-GCGTGCGTGCTTACATGATG-3' およびリバース プライマー 5'-GTGCGACATTAAACAGTGTTAGTTGTAGCC-3') は、インタクトなインサート産物 (約 5.0 キロベース) と挿入のない対立遺伝子 (1.0 キロベース) の両方を増幅するように設計されました。キロベース）。 さまざまなバンド サイズによって示されるさまざまな挿入または欠失が存在し、NHEJ 経路を介した二本鎖切断修復を示している可能性があります 36。 HR ジャンクションの検出も、蛍光プローブベースの検出で完了しました。 アッセイ (補足表 18) はゲノム領域から挿入産物 (HR1 (600 塩基対) および HR2 (586 塩基対)) まで及んでいましたが、標準的な qPCR サイクリングプロトコルを変更することで HR 産物のデジタル検出が可能になりました。 3 ステップのサイクリング アプローチにおける次のサイクリング パラメーターを使用しました: 95 °C で 15 分間の変性、その後の 95 °C/20 秒の変性、62 °C/60 秒のアニーリング、および 68 °C/30 秒の伸長の 40 サイクル。 qPCR 反応混合物には、50 ng のテンプレート DNA、900 nM プライマー、および 100 nM プローブが含まれていました。 HR1 産物には追加の蛍光バックグラウンドが含まれていましたが、同様のサイズの独自のノーマライザー (VIC) を使用することで、両方のジャンクションについて qPCR ベースのコピー数予測が可能になりました。 HR1 反応のバックグラウンドは、より高い定量値に基づいて差し引かれました。 T1 ロング PCR 陽性分離イベントについては、補足表 18 に記載のプライマーを使用して完全なインサート産物をサンガー配列決定しました。SbS 分析は、Zastrow-Hayes et al.30 の記載に従って実行されました。

すべてのペアの平均値の比較は、JMP バージョン 16.0.0 (SAS Institute Inc.) を使用した片側 Tukey-Kramer 正直有意差検定によって行われました。 各実験で使用される反復の数は、それぞれの図および表の凡例に記載されているか、表内の個別のデータ ポイントとして示されています。

組織学的検査のために組織を小さな断片に切断し、固定した後、形質転換されていない葉組織を収集しました (以下を参照)。 感染後５、１０および１５日目に形質転換された葉組織片を収集し、新たに調製した固定液、リン酸緩衝液中２．５％グルタルアルデヒド（電子顕微鏡科学社）（ｐＨ７．０）中に入れ、室温で一晩固定した。 組織をリン酸緩衝液で３回交換して（交換ごとに３〜５分）洗浄し、組織片を段階的エタノールシリーズで１００％エタノールまで脱水した。 この材料に活性化テクノビット 7100 (Heraeus Kulzer GmbH) を浸透させました。最初は 100% エタノール:テクノビット 7100 の 1:1 混合物で 1 時間、続いて 100% テクノビット 7100 を 2 回交換し、1 回目は 1 時間、2 回目は交換しました。一晩中。 １５ｍｌの活性化テクノビット７１００に１ｍｌのテクノビット７１００硬化剤を添加した後、サンプルをポリテトラフルオロエチレン型内で重合させた。重合は、真空デシケーター中で真空下で一晩進行させた。

ミクロトーム（Leica 2050、Leica Biosystems）上でサファイアナイフを使用して切片を2.5μmで切断した。 切片をスライドガラス (Fisherbrand SuperFrost Plus) 上の蒸留水の滴に浮かべ、50 °C のホットプレート上のスライド上で乾燥させました。 切片は、多糖類については過ヨウ素酸シッフ試薬で染色し 68、続いてタンパク質については 0.1% アニリン ブルー ブラック (7.0% 酢酸中) で 5 分間対比染色しました 69。 画像は、Nikon DS-Ri1 カメラ (Nikon) を備えた Nikon E800 顕微鏡で撮影しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

著者らは、この研究の結果を裏付けるすべてのデータが論文とその補足情報ファイルおよび拡張データ内で入手可能であることを宣言します。 Corteva Agriscience は、材料の全部または一部の第三者所有者からの許可の証明および政府規制の考慮を条件として、適用される材料譲渡契約に基づき、非営利研究のために学術研究者にプラスミドを提供します。 管理計画の完了も必要です。 この研究で記載されているパイオニア トウモロコシ近交系 PH1V69、PH4257、PNSS01、1PEEA63、および 1PYWK36 は専有物です。

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アジス・アナンド

現在の住所: MyFloraDNA、ウッドランド、カリフォルニア州、米国

Corteva Agriscience、米国アイオワ州ジョンストン

ニン・ワン、ラリサ・ライアン、ナゲシュ・サルデサイ、エミリー・ウー、ブライアン・レンダーツ、キース・ロウ、ピン・チェ、アジス・アナンド、アンドリュー・ウォーデン、ダリーン・ヴァン・ダイク、ピエルイジ・バローネ、セルゲイ・スヴィタシェフ、トッド・ジョーンズ、ウィリアム・ゴードン＝カム

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NW、LR、NS、EW、AA、KL、PC、PB、SS、TJ、WG-K。 実験をデザインした。 NW、LR、BL、AW、DvD、TJ が実験を実施しました。 著者全員、および NW、LR、NS、EW、BL、AW、DvD、PB、SS、TJ、WG-K が結果の分析に貢献しました。 原稿執筆に貢献した。

ウィリアム・ゴードンカムへの通信。

NW、LR、NS、EW、BL、KL、PC、AA、AW、DvD、PB、SS、TJ、WG-K。 この調査が実施された時点では Corteva Agriscience に雇用されていたため、競合する利益を抱えています。 著者の雇用主 (Corteva Agriscience) は、この研究の 1 つ以上の側面をカバーする特許を申請し、取得しています。

Nature Plants は、この研究の査読に貢献してくれた Sadiye Hayta 氏、Kirankumar Mysore 氏、およびその他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a、PHP97334によるアグロバクテリウム感染から4日後の一過性ZsGreen1発現の蛍光画像。 b. 感染後 9 日目に体細胞胚が成長し始めるにつれて、成長する独立した蛍光焦点。 c、感染後9日目の高倍率で、葉の表面から出現した蛍光不定胚を示している。 df、PAS で染色し、アニリン ブルー ブラックで対比染色した葉組織の横断面の顕微鏡写真。d、感染後 5 日の葉切片の初期発生不定胚 (矢印) を示す分裂細胞の小さなクラスター、e、分裂細胞のクラスターを示します。細胞は、感染後10日で葉切片の表皮層を通って出てくる準備ができています。f、感染後15日の葉切片では、より大きな不定胚が葉の表面を突き抜けています（矢印）。 組織学の方法については、補足セクションの終わりを参照してください。 画像は 10 を超える独立した実験の代表です。

a、6 ウェル培養プレートに設置された透過性培養インサートに等分されたアグロバクテリウム懸濁液。 b、手動による外植片調製のために収穫された領域を示すトウモロコシの苗木。 c、アグロバクテリウム懸濁液中で葉組織外植片を手動で切断します。 d、e、過剰なアグロバクテリウム懸濁液を拭き取った透過性培養インサート内の葉組織、および固体培地の表面に置いた濾紙上で培養した葉組織。

アグロバクテリウム感染後 3 ～ 4 日後の ZsGreen1 の一過性発現 (左のパネル) は、相対的な T-DNA 送達を示しています。 感染後 3 ～ 4 週間後の緑色蛍光の胚形成カルス形成 (右のパネル)。 画像は 3 つの独立した実験の代表です。

a、b、2 mg/l のアンシミドールの非存在下 (a) または存在下 (b) で生育した生後 14 日の実生からのトウモロコシの葉の基部組織の切片。 切片は、多糖類については過ヨウ素酸シッフで、タンパク質についてはアニリンブルーブラックで染色されます。 矢印はマゼンタに染色されたアミロプラストを示します。 アンシミドール処理した葉組織の発育中の葉肉にはアミロプラストが広範囲に存在し、アンシミドールの非存在下で増殖させた組織にはアミロプラストが全体的に欠如していることに注目してください。 スケールバー = 50 μm。

補足表 1 ～ 18、組織学の方法と参考文献の説明。

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転載と許可

Wang, N.、Ryan, L.、Sardesai, N. 他トウモロコシとソルガムにおける効率的なランダム組み込みと標的ゲノム修飾のための葉の形質転換。 ナット。 Plants 9、255–270 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41477-022-01338-0

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受信日: 2022 年 8 月 22 日

受理日: 2022 年 12 月 21 日

公開日: 2023 年 2 月 9 日

発行日：2023年2月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-022-01338-0

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