FadLを介した根粒菌の根への移動

Nov 19, 2023

ISME Journal volume 17、pages 417–431 (2023) この記事を引用する

2136 アクセス

1 引用

14 オルトメトリック

メトリクスの詳細

根圏から根面への移動は、根のマイクロバイオーム構築における重要な選択プロセスですが、完全には理解されていません。根粒菌目メンバーは陸生植物の中核根マイクロバイオームに多く存在しており、今回我々はツルマメ、栽培ダイズ、イネ、トウモロコシにおける有益なシノリゾビウム・フレディの根面適応遺伝子のゲノムワイドなトランスポゾン配列を報告する。広範囲の宿主範囲の根面面でのコロニー形成に関与する遺伝子はほとんどありませんでした。脂肪酸トランスポーターを欠くfadL変異体は高いコロニー形成率を示したが、exoFQP（エキソ多糖の重合と分泌を指示する膜タンパク質をコードする）の変異はあったものの、エキソ多糖生合成に必須のエキソ遺伝子の変異はそうではなかったために、コロニー形成率が著しく低下した。この変動は、根圏と根面での生存能力、および関連するバイオフィルムと外多糖類の生成によっては説明できませんでしたが、根面への移動能力、関連する表面運動性およびクオラムセンシング AHL (N-アシル化-L-ホモセリンラクトン) の混合物と一致していました。。遺伝学および生理学的な証拠は、FadL が長鎖 AHL の取り込みを媒介する一方、ExoF が長鎖 AHL 生合成に悪影響を与える短鎖 AHL の分泌を媒介することを示唆しています。 fadL 変異体と exoF 変異体では、それぞれ細胞外長鎖 AHL が増加し、細胞外長鎖 AHL が減少していました。 fadL変異体のものを模倣した長鎖AHLの合成混合物は、根粒菌の表面運動性を改善することができる。この AHL 混合物を根圏にスポットすると、S. fredii の根への移動と根面への定着が拡散性の方法で強化されました。この研究は、根面への細菌の移動を調節する細胞外AHLを管理する新しい部分を追加します。 FadL-ExoFQP システムはアルファプロテオバクテリアで保存されており、多様なキーストーン根粒細菌の「家庭生活」を形成している可能性があります。

原核生物種のカタログは増え続けているにもかかわらず [1]、地球規模で土壌に豊富に存在する分類群はほとんどありません [2]。土壌の特徴は、根に関連する細菌群集の構成を決定する際に、植物の遺伝子型よりも重要な役割を果たします [3、4]。これに関連して、多くの研究により、イネ [5]、柑橘類 [6]、サトウキビ [7]、多様なマメ科植物など、さまざまな条件の複数の地理的サイトにわたる植物種と再現可能に関連する群落メンバーのサブセットがさらに特定されています。種[8]。入手可能な証拠は、根面が選択ゲートである、バルク土壌から根圏、根圏、内圏へと順に根マイクロバイオーム集合の多段階モデルの確立を支持している[5、9]。この多段階パターンは広く説明されているが、さまざまなニッチ（バルク土壌、根圏、根圏）における根粒細菌の分布と存在量を形成する、根底にある遺伝子と環境の相互作用は、ほとんど解明されていないままである[10、11、12]。この知識のギャップは、これらの生態学的ニッチにおける根粒菌の「家庭生活」の究極的な進化的説明を妨げています[12]。

モデル根粒細菌の根面適合性遺伝子のゲノムワイドな同定は、制御された条件下での Tn-seq アッセイによって大幅にスピードアップされました [13,14,15,16,17,18]。しかし、これらのハイスループット研究では、さまざまなコロニー形成段階におけるこれらのフィットネス遺伝子の機能的特徴付けは扱われていませんでした。現在の多段階コロニー形成モデルには、根への走化性、付着、およびその後の根面上での多細胞バイオフィルムの形成が含まれており、これはさまざまな根粒菌からの累積的な逆遺伝学の証拠によって裏付けられています[19]。根滲出液の化学勾配は、重要な条件（シグナル伝達機能など）およびリソース（栄養価）として機能し、運動性細菌と異なって相互作用して根ニッチに向かう移動プロセスを形成すると考えられている[20、21]。細菌の化学受容体によって直接認識されるリガンドはほとんど不明であるが[22]、化学エフェクター機能は有機酸、炭水化物、糖アルコール、アミノ酸、植物ホルモンについて提案されている[23]。多様な細菌付着因子[24]によって根面に付着すると、運動性細菌は徐々に固着型に移行し、その後マトリックスに埋め込まれた細菌群集（エキソ多糖類（EPS）、eDNA、eRNA、タンパク質、脂質など）の成長と成熟が続きます。生体分子）、すなわち多細胞バイオフィルム[25]。バイオフィルムは、同じまたは異なる種の複数の細胞の「ホーム」であり、高度に保存されたクオラムセンシングシグナルである N-アシルホモセリンラクトン (AHL) を介して相互に通信します [26]。対照的に、密度に依存するクオラムセンシングプロセスがルートニッチへの移行にどの程度関与しているかは依然として不明である[19、27、28]。これは、根のマイクロバイオーム構築を理解し、設計するために不可欠です [29、30]。

根粒菌とバークホルデリア目は、陸生植物の根の中心微生物叢に属します [31、32]。これらの目には、マメ科植物に関連する有益な根粒菌と多様な植物病原体 [8] の両方が豊富に含まれており、根茎定着後の宿主との分子相互作用について集中的に研究されています [33,34,35,36]。根粒菌は、マメ科植物の根粒細胞における細胞内感染と窒素固定を特徴とし[33]、マメ科植物の根微生物叢の先駆者と考えることができます。この明確な王国間の共生は、根粒菌の転写制御因子 NodD によるマメ科植物のフラボノイドの特異的感知と、その後のリポキトオリゴ糖 (Nod 因子として知られる) の生合成に関与する他の nod 遺伝子の活性化によって開始され、これらの遺伝子は宿主受容体によって特異的に認識され、リポキトオリゴ糖の生合成を誘導します。下流の感染と結節の形態形成 [36]。フラボノイドは、初期の研究 [20] に基づいて根粒菌の化学エフェクターとしても提案されていますが、フラボノイドを溶解するために通常使用される共溶媒からの新しい証拠によって最近疑問視されています [37]。さらに、根粒菌は多様な植物種の内部寄生虫として繰り返し報告されており、イネ [38, 39]、小麦 [40, 41]、トウモロコシ [42] などの穀物に対する植物の成長促進効果が実証されています。根粒面定着後の根粒菌とその宿主の間の分子相互作用は集中的に研究されている[34, 36]が、有益な根粒菌がどのようにして多様な陸生植物に定着することに成功するのかはほとんど不明のままである。

広範な宿主範囲の根面の定着に関与する根粒菌の機構を調査するために、我々は、広範な宿主範囲の多様なマメ科植物種の通性微共生生物である Sinorhizobium fredii に焦点を当てた [43, 44]。 Tn-seq は、ツルマメ (Glycine soja W05)、栽培ダイズ (Glycine max cv. JD17)、トウモロコシ (Zea Mays cv. ZD958) 上の S. fredii CCBAU25509 (以下、SF2) の根面コロニー形成遺伝子のゲノムワイド解析に使用されました。、および米（Oryza sativa cv. 日本晴）。これにより、広範な宿主範囲の根面定着遺伝子の確実なリストを同定することができました。このリストの中で、fadL (外膜トランスポーターをコードする) と exoFQP (EPS の重合と分泌を指示する膜タンパク質をコードする) の変異が、それぞれ広範な宿主範囲の根面面定着能力の改善と低下につながることが、逆遺伝学によって検証されました。根圏および根面の生存性 (EPS およびバイオフィルム生成) および根への移動 (遊泳および表面運動性) に関連する特性が、関連する変異体について決定されました。最後に、fadL 変異体と exoFQP 変異体間の根面での定着能力が反対であることは、それらの根への対照的な移動能力、および関連する表面運動性と細胞外クォーラム感知長鎖 AHL と一致していることを明らかにしました。 AHLの定量化により、細胞外長鎖AHL恒常性のFadL-ExoFQP依存性調節が関与する根への移動の実用モデルを提案することもできた。このモデルは、長鎖 AHL の合成混合物を使用した根面定着実験でさらに検証されました。

この研究で使用した細菌株とプラスミドを表S1に示し、プライマーを表S2に示します。根粒菌は TY 培地中で 28 °C で生育させました [45]。大腸菌株は、Luria-Bertani (LB) 培地中で 37 °C で増殖させました。アグロバクテリウム・ツメファシエンスはLB培地中で28℃で増殖させた。抗生物質の濃度については以前に説明しました [45、46]。 Bioscreen C (Oy Growth Curves Ab Ltd、Raisio、フィンランド) を使用して、試験菌株の増殖曲線を決定しました。

飽和トランスポゾン挿入変異体ライブラリーを構築するために、pSAM_Bt [47] に由来するマリナートランスポゾン媒介 pSAM_Sf を結合によって SF2 に導入しました。成長後、接合スポットをこすり取り、0.85% NaCl 溶液に再懸濁しました。この交配混合物（プレートあたり 100 μL）を、ナリジクス酸（30 μg/ml）、トリメトプリム（10 μg/ml）およびカナマイシン（50 μg/ml）を含む 600 TY 寒天プレート（90 × 90 mm）上に滅菌培地を使用してさらに広げました。ガラスビーズを加え、28℃で3日間インキュベートしました。約 600,000 個のコロニーが収集され、その後の実験のための入力トランスポゾン挿入変異体ライブラリーが生成されました。 3 つの独立したライブラリが構築され、3 つの独立した実験で直接使用されました。

ツルマメ、栽培ダイズ、イネ、およびトウモロコシの種子を 95% エタノールで 30 秒間処理し、17% NaClO (wt/vol) 溶液で 3 分間表面滅菌しました (ツルマメの種子は 1 分間濃硫酸で前処理しました)。 3 分)、オートクレーブ処理した脱イオン水を使用して 5 ～ 7 回洗浄し、0.8% 寒天プレート上で 28 °C、暗所で 48 時間発芽させました。フィットネス遺伝子スクリーニングにおける偽陰性を最小限に抑えるために、インプットライブラリーを OD600 = 1 で 0.85% 生理食塩水に再懸濁しました。インプットライブラリーを植物培養皿の濾紙 (0.8% 寒天、低 N 栄養液培地 [45]) に接種しました。 ]）。同時に、生後 2 日の苗をこれらの培養皿に移しました。次いで、根を７ｄｐｉ（接種後日数）で採取し、プールし、重量を量り、０．８５％ＮａＣｌ溶液で５回洗浄し、１０ｇ当たり１５ｍｌの０．８５％ＮａＣｌ溶液に懸濁した。超音波処理 (50 Hz、30 秒を 2 回) 後、これらの根面サンプル (WS7d、CS7d、R7d、および Z7d) のさらなる Tn-seq ライブラリー構築を促進するために、懸濁液を抗生物質を含む 200 ml TY 培地中で 32 時間インキュベートしました。対照サンプルには、インプットライブラリーの 32 時間 TY 培養物 (TY)、および 1 hpi (接種後 1 時間; F1h) または 7 dpi (F7d) で植物培養皿から収集した濾紙の TY 培養物が含まれていました。 3 つの独立したマリナートランスポゾン挿入ライブラリーを 3 つの独立した実験で入力ライブラリーとして使用しました (図 1)。

S. fredii CCBAU25509 (SF2) の 3 つの独立したマリナートランスポゾン挿入ライブラリーを、3 つの独立した実験で投入接種材料として使用しました。植物培養皿のフィルター上の接種後 1 時間 (F1h) および接種後 7 時間 (F7d) のサンプルを、4 つの試験植物種 (CS7d、WS7d、R7d、および Z7d) の根面サンプルに対する対照サンプルとして使用しました。。 Tn-seq ライブラリの構築を容易にするために、すべての出力サンプルを TY リッチ培地で 32 時間培養し、入力ライブラリをコントロール (TY) と同じ条件下で培養しました。

収集したサンプルからの DNA を TIANamp Bacteria DNA キット (Tiangen) を使用して抽出し、MmeI (New England Biolabs) による酵素的断片化に供しました。約 3 μg の適格 DNA を 3 μl (6 単位) の MmeI を用いて総量 200 μL 中で 37 °C で 2.5 時間消化しました。次に、2μlの子牛腸アルカリホスファターゼ(CIP; New England Biolabs)を添加し、反応系を37℃で1時間インキュベートした。異なるバーコードを持つ二本鎖アダプターを、QIAquick PCR 精製キット (Qiagen) を使用して精製した制限フラグメントにライゲーションし、16 °C で一晩インキュベートしました。トランスポゾン挿入部位に隣接する配列は、Universal および P7-Tn プライマー、および Q5 DNA ポリメラーゼ (New England Biolabs) を使用した PCR によって濃縮されました (98 °C で 2 分、98 °C で 10 秒、72 °C で 25 秒を 22 サイクル) 、72 °C で 30 秒間、その後 72 °C で 5 分間最終伸長します)。 PCR産物を1.8%アガロースゲル上で泳動し、QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)を使用して精製した。 DNA は Nanodrop で定量され、NextSeq 550AR プラットフォーム (ANORAD Gene Technology Co., Ltd) でシングルエンドシークエンシングを受けました。

fqgrep (https://github.com/indraniel/fqgrep) を使用して生のリードをフィルタリングしてアダプターとトランスポゾンを特定し、トランスポゾンに隣接するゲノム DNA を抽出しました。 Bowtie は、読み取りを SF2 ゲノムにマッピングするために使用され [48]、.sam 出力ファイルを生成し、その後、このファイルを使用して、summary_mappings.py (https://github.com/elijweiss/) を使用して整列したゲノム DNA の .wig 形式ファイルを生成しました。 Tn-seq)。結果の .wig ファイルは、TTR 正規化法 (トリミングされた合計リード) を使用した TRANSIT の「リサンプリング」法によって分析されました [49]。 5 ～ 95% の ORF 内の挿入のみが、非破壊挿入の潜在的な影響を最小限に抑えると考えられました [50]。個々の入力ライブラリーまたは F1h サンプルのいずれかをコントロールとして使用しました。

Tn-seq の結果を検証するために、表 S2 にリストされているプライマーを使用して、個々の標的遺伝子の内部フラグメントを保持する pCM351 [51] 誘導体の挿入によって代表的な遺伝子を変異させました。すべての pCM351 誘導体はサンガー配列決定によって検証され、SF2 に結合されました。 SF2 またはさまざまなバックグラウンドにおける fadL、exoF、traI、sinI、および flaA のインフレーム欠失については、シームレスアセンブリクローニングキット (Taihe Biotechnology、北京、中国) を使用して、以前に記載されているように pJQ200SK [52] 誘導体を構築しました [53]。、対応するプライマーは表S2にリストされています。陽性クローンに含まれる正しく操作されたプラスミドは、PCR およびサンガー配列決定を使用して検証され、根粒菌に結合されました。ゲンタマイシン耐性の単一クロスオーバークローンをさらに、5% スクロースを使用した二重組換え体に対する対抗選択に供しました。相補的変異株を構築するために、対応するコード配列および上流プロモーター領域を含むフラグメントを pBBR1MCS-2 にクローニングしました [54]。正しいクローン化配列を有する pBBR1MCS-2 誘導体を結合によって根粒菌に導入しました。 GFP および mCherry タグ付き S. fredii 株を生成するために、pRJPaph-bjGFP および pRJPaph-mChe [55] を結合によって S. fredii に送達しました。すべての挿入変異体、インフレーム欠失変異体、相補的変異株、およびタグ付き株は、コロニー PCR およびサンガー配列決定によって検証されました。

根粒菌の根粒占有率を決定するために、変異体を親株と 1:1 (OD600 = 0.2) で混合し、低窒素栄養液培地で湿らせたバーミキュライトで栽培した宿主植物に接種しました (アルファルファ種子は同じ方法で滅菌しました)ツルマメの種子として）。 30 dpi で、結節の表面を滅菌し (95% エタノールで 30 秒間、17% NaClO で 3 分間)、対応する抗生物質を含む TY プレート上での増殖と、株特異的フラグメントを標的とするプライマーを使用した PCR によって結節分離株を同定しました。

根面コロニー形成実験では、Tn-seq サンプルを収集するために記載したものと同じシステムを、以下に記載するように接種密度を下げて使用しました。一晩根粒菌培養物を、接種材料として使用した０．８５％生理食塩水中でＯＤ６００が０．２になるように調整した。 7 dpi で、根面サンプルまたは濾紙上のコロニー形成単位 (CFU) を、希釈サンプルを TY 寒天プレート上で対応する抗生物質とともにインキュベートすることによって決定しました。ツルマメの根上の根粒菌の根面生存性を調べるために、根の長さ 3 cm の苗を OD600 = 0.2 の根粒菌溶液 300 μl に 10 秒間置き、その後風乾して植物培養皿に移しました。次に、根を 1 hpi および 7 dpi で採取し、根面サンプルの CFU を上記のように決定しました。根圏から根面への移動プロセスを特徴付けるために、2 μl の野生型または OD600 = 0.8 の変異体 (約 1.6 × 106 CFU) をツルマメの苗木から 1 cm、2 cm、3 cm、および 4 cm 離れた位置に対称的に接種しました。植物培養皿。 7 dpiで、接種部位の濾紙サンプルおよび根面サンプルのCFUを上記のように決定した。この対称的な接種手順は、長鎖 AHL (45 ng 3-OXO-C12-HSL、52 ng C14-HSL、および 1 μg 3-OXO-C14-HSL を含む 2 μl 溶液) の拡散効果をテストするためにも使用されました。 SF2 または変異体の根面コロニー形成 (接種物質: 約 1.6 × 106 CFU)、つまり、AHL と細菌の両方の接種位置がツルマメの苗木まで対称的な距離で変化します。

バイオフィルムの形成は、以前に記載されたように [56] 修正を加えて測定されました。根粒菌の一晩の TY 培養物を遠心分離し、0.85% NaCl 溶液を使用して 2 回洗浄し、TY で OD600 = 0.1 に調整しました。得られた培養物 100 μl を 96 ウェルポリスチレンマイクロタイタープレート (株あたり 8 ウェル) に接種し、パラフィルムで密閉し、28 °C の増殖チャンバー内で 48 時間静置しました。細菌の増殖は、マイクロプレートリーダーでOD600で測定されました。浮遊細菌をピペットで除去し、プレートを0.85% NaCl溶液で3回洗浄した。ウェルを空にし、150 μl の 0.1% (w/v) クリスタルバイオレットで 10 分間染色し、蒸留水で 3 回洗浄しました。マイクロタイタープレートを組織上で逆さまにして余分な液体を除去し、風乾した。残りのクリスタルバイオレットを、150μlの95%(v/v)エタノールを添加し、15分間インキュベートすることによって可溶化した。最後に、各ウェルからのクリスタルバイオレット/エタノール溶液125μlを96ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダーでOD590を測定した。

エキソ多糖類 (EPS) は、以前に記載されているように精製および定量されました [57]。簡単に説明すると、細菌を M9 培地で 5 日間培養して回収し、標準化のために OD600 を測定しました。ＥＰＳを含む上清を遠心分離（２４４９ｇ、３０分間）により得、高分子量（ＨＭＷ）画分を３：１容量の９５％冷エタノールを添加することにより沈殿させた。ＨＭＷ沈殿物を遠心分離（２４４９ｇ、３０分間）により回収し、得られた上清にさらに７倍量のエタノールを加えて低分子量画分を沈殿させた。次いで、これらの２つの画分を凍結乾燥し、重量を量った。

根粒菌の遊泳を評価するために、細菌コロニーを滅菌つまようじで遊泳寒天プレート (TY、コンゴレッドを含む 0.3% 寒天) の中心に移しました。表面運動性については、試験菌株の一晩培養物 (OD600 = 0.8) 2 μl を表面運動性寒天プレート (TY、コンゴレッドを含む 0.5% 寒天) の中央にスポット接種しました。プレートを表を上にして28℃で7日間インキュベートし、対応する遊泳コロニーまたは表面運動コロニーの最大直径を測定しました。

変異体と SF2 の競合的な表面運動性をテストするために、mCherry 標識変異体と GFP 標識 SF2 を異なる比率 (10%、30%、50%、70%、および 90%) で混合し、表面運動性プレート (TY) 上でインキュベートしました。、0.5％寒天）を1週間。 mCherry 標識 flaA 変異体と GFP 標識 SF2 の競泳運動性を試験するために、2 つの株を 1:1 の比率で混合し、水泳寒天プレート (TY、0.3% 寒天) の中心に接種しました。７日後、各コロニーをライカ蛍光実体顕微鏡（励起光源：ＧＦＰ標識ＳＦ２の検出の場合は４８８ｎｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ標識変異体の検出の場合は５４６ｎｍ）で観察した。

細菌の表面運動性に対する長鎖 AHL の影響を分析するために、各 mCherry 標識株を対応する非標識株と OD600 = 0.8 の濃度になるまで 1:1 の比率で混合し、その後長鎖 AHL をスポット接種しました。表面運動性寒天プレート (TY、0.5% 寒天培地) の中央にある AHL (細菌溶液 2 μl には 45 ng 3-OXO-C12-HSL、52 ng C14-HSL、および 1 μg 3-OXO-C14-HSL が含まれます)コンゴレッド）。７日後、コロニーの直径を記録し、ライカ蛍光実体顕微鏡（励起光源：５４６ｎｍ）で写真を撮影した。

Agrobacterium tumefaciens KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410) [46] は、S. fredii 株から細胞外 AHL を検出するための指標株として使用されました。試験株を、x-gal の有無にかかわらず表面運動性プレート上で 3 日間培養し、次に KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410) (OD600 = 0.1) を根粒菌コロニーの外側にループさせました。 KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410) の 4 dpi で、x-gal を含むプレートを写真に撮り、x-gal を含まないプレートを KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410) の β-ガラクトシダーゼ活性の定量に使用しました。 ) 根粒菌の細胞外 AHL 含量を反映します。

細胞内および細胞外の短鎖および長鎖 AHL を測定するために、根粒菌を TY 培地中で 28 °C で 32 時間インキュベートしました (定常期)。細胞外ＡＨＬを含む上清を遠心分離（２４４９ｇで３０分間）によって得た。ペレットを０．８５％ＮａＣｌで２回洗浄し、再懸濁し、超音波処理し、次いで遠心分離して、細胞内ＡＨＬを含む上清を得た。得られたサンプルを等量のクロマトグラフィーグレードの酢酸エチルで２回抽出し、有機相を蒸発させた。抽出物を、0.1% (v/v) ギ酸を含む 1 mL メタノール:水 (1:1 v/v) に溶解し、精密濾過 (0.22 μm) しました。得られたサンプル 1 μL を、TACQUITY UPLC HSS T3 カラム (2.1 × 100 mm、粒径 1.8 μm) (Thermo Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を備えた HPLC システムに注入しました。溶離液は、0.1% ギ酸水溶液 (溶媒 A) およびアセトニトリル溶液 (溶媒 B) でした。流速を 300 μL/分に設定し、最初の 9 分間で混合パーセンテージを 40% 溶媒 B から 98% 溶媒 B に変更し、2 分間維持し、その後カラムを開始条件に戻しました。すべての AHL 分子は高セリンラクトン環を持ち、HPLC 質量分析法で m/z 102 の特徴的なフラグメントを形成します [58]。この原理に従って、HPLC-Q-Exactive-PRM 法が確立されました。 C8-HSL、3-OXO-C8-HSL、C12-HSL、3-OXO-C12-HSL、C14-HSL、3-OXO-C14-HSL の分析標準 (純度 > 99%) は Sigma (ダルムシュタット) から購入しました。、ドイツ）。 1 μg/ml 溶液を 1/4、1/16、1/256、および 1/1024 に連続希釈しました。質量分析は、Q Exactive HF-X 四重極トラップ質量分析装置 (Thermo Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) で実施しました。プリカーサーイオンスキャン実験を陽イオンモードで実行し、m/z 102 を監視しました。

この研究は、シノリゾビウムの典型的な複数部分のゲノム (染色体、クロミド、および共生プラスミド) を保持する SF2 に焦点を当てました [59]。 SF2 の根面コロニー形成遺伝子のゲノムワイドな調査を行うために (図 1)、入力変異体ライブラリーを植物培養皿の濾紙に接種し、接種後 1 時間 (F1h) で出力変異体ライブラリーを濾紙から収集しました。接種後 7 日 (dpi; F7d)、7 dpi での栽培ダイズ (CS7d)、ツルマメ (WS7d)、イネ (R7d)、およびトウモロコシ (Z7d) の根面から。 Tn-seq ライブラリーの構築を容易にするために、すべての出力変異体ライブラリーを TY リッチ培地で 32 時間培養し、入力ライブラリーをコントロール (TY) と同じ条件で培養しました。 Tn-seq により、3 つの入力サンプルと 21 の出力サンプルにおけるトランスポゾン挿入密度が 57.03 ～ 86.99% の範囲であることが明らかになり (表 S3)、これは良好な Tn-seq データセットの挿入密度の閾値 50% を上回っています [49]。再現可能な根圏効果が3つの独立した実験で観察されました（図S1）、つまり、根面サンプル（CS7d、WS7d、R7d、およびZ7d）は、TY、F1h、およびF7dのクラスターと比較して、一貫して異なるクラスターを形成しました。 3 つの独立した入力ライブラリのかなりの特徴も特定されました (データ S1、データ S2、および図 S1)。これらの結果は、遺伝子適合性について結論を下す前に、複数の独立した入力ライブラリ間の確率的変動を考慮する必要があることを強調していますが、これは、1 つの入力ライブラリのみに基づく初期の研究ではほとんど見落とされてきました [49]。

対応する F1h データセット (図 S2A; データ S2) と比較した根面サンプル (CS7d、WS7d、R7d、および Z7d) の遺伝子適合性スコアに基づいて、93、91、127、および 206 遺伝子が、試験植物の根面定着遺伝子として同定されました。それぞれ栽培ダイズ、ツルマメ、トウモロコシ、イネであり、SF2 ゲノムの 1.4 ～ 3.1% を占めます (p 値 < 0.01)。この範囲は、Sinorhizobium meliloti (2%) [60]、Rhizobium Leguminosarum bv.の根面定着遺伝子について報告されている範囲と類似しています。 viciae (2.9%) [17]、Agrobacterium tumefaciens (2.9-4%) [18]、緑膿菌 (1.6%) [15]、Pseudomonas simiae (2%) [13]、Pseudomonas sp. WCS365 (3.8%) [14]、Azoarcus olearius (2.2%)、Herbaspirillum seropedicae (2.7%) [16]。これらの根面適応度遺伝子のうち、8、8、21、および82遺伝子は、それぞれ栽培ダイズ、ツルマメ、トウモロコシ、イネに特異的でした（図S2AおよびデータS2.1）。さらに、少なくとも 1 つの試験植物種に対する 3 つの独立した実験で、43 個の遺伝子が根面定着遺伝子として再現性よく同定されました（図 S2B およびデータ S2.2）。したがって、これらはさらなる研究のための根面定着遺伝子の堅牢なリストとみなされました。。濾紙からの対照サンプル（F7d）は、階層的クラスタリング分析（図S2B）における根面サンプルと比較して、明確なクラスターを形成しました。 R7d.3 および Z7d.3 データセットでは c09590 に顕著なノイズが観察されたため、c09590 変異体を構築し、Tn-seq サンプル収集に使用したのと同じ条件下で SF2 を 1:1 の比率で共接種しました。さらに、c04390 の変異体も構築され、同じ実験で陽性対照として使用されました。 c09590およびc04390変異体は、SF2と比較して、広範囲の宿主範囲の根面面コロニー形成能力の大幅な低下を示し（p値<0.001;図S3）、Tn-seq結果を裏付けています（図S2B）。

43 遺伝子のうち 41 遺伝子が根面のコロニー形成に積極的に寄与していました。これらの遺伝子は、DNA (UvrA) およびタンパク質 (Pcm) の修復、翻訳 (YchF および LepA)、呼吸 (シトクロム C に関連する 7 つのタンパク質)、ホスホン酸代謝 (PhnP)、抗酸化活性 (SodA)、第二鉄の取り込みに関与しています。 (c03990 および c04080) およびオリゴペプチド (b57060、b57070、および b57080)、リポタンパク質の結合 (c19900)、EPS の分泌 (ExoF、ExoP、および ExoQ)、トリプトファンの同化作用 (TrpA、TrpB、TrpD、および TrpE)、グルタミン酸 ( GltA、GltB、ArgD）、ロイシン（LeuA および LeuB）、メチオニン（MetA）、IMP（PurC および PurF）、AMP（PurA）および dUMP（Dcd）。この遺伝子リスト内では、22 個の遺伝子の相同体も S. meliloti-alfalfa [60]、P. simiae-Arabidopsis thaliana [13]、Pseudomonas sp. における根面定着プレーヤー (データ S2.2) として同定されました。 WCS365-A。タリアナ [14]、P. エルギノーサトウモロコシ [15]、A. オレアリウス/H. seropedicae-Setaria viridis [16]、R.leguminosarum-pea [17]、または Agrobacterium tumefaciens-トマトのペア [18]。対照的に、推定上のアンチシグマ因子（RsbU）と既知の唯一の外膜疎水性トランスポーターFadLをコードする遺伝子[61,62,63,64]は、SF2の根面コロニー形成を負に制御し、fadLの方がより強い効果を示した（図S2B）。。ウキクサの浮遊植物全体における Aquitalea magnusonii のコロニー形成遺伝子の最近の Tn-seq 調査では、fadL 変異体が出力プールに濃縮され、コロニー形成に対するマイナスの影響を示しています [65]。

これら 43 個の根面コロニー形成遺伝子は、SF2 多分ゲノム内で偏ったレプリコン分布を持っています: 染色体上で 81.4%、クロミッド上で 18.6%、共生プラスミド上で 0%。これは、シノリゾビウムの染色体とクロミッドが根圏の適合性に寄与し[66]、一方、共生プラスミドをコードする遺伝子は主にマメ科植物との窒素固定共生の確立と維持に関与していることを示すS. メリロティの初期の代謝モデリング証拠と一致している[59]。それにもかかわらず、染色体およびクロミド遺伝子による共生最適化が報告されており[34、67、68]、その中でクロミッド上のEPS生合成遺伝子は、マメ科植物におけるシノリゾビウムの感染プロセス[69、70]とクロミッド上の両方の感染プロセスの最適化における役割に関して集中的に研究されている。 in vitro でのバイオフィルム形成 [71]。この研究では、根面でのコロニー形成に関与する8つのクロミド遺伝子（図S2B）のうち、exoF、exoP、およびexoQはEPSの重合と分泌を指示する膜タンパク質をコードしています（図2A）[72、73、74、75、76、77]。。 exoF、exoP、およびexoQの同じ遺伝子クラスター内のさまざまなEPS生合成遺伝子が根面でのコロニー形成に必須ではないことは直感的に予想外でした（図2B、C）。これは、ExoF、ExoP、ExoQ の他の未知の生理学的機能が根面定着において EPS 産生よりも重要な役割を果たしているという実用的なモデルを意味します。

ExoP、ExoQ、ExoF、および FadL の細胞内局在の予測。 B SF2 におけるエキソ多糖の生合成、輸送、分解を指示するエキソ遺伝子クラスターと、異なる条件下での 3 つの独立した実験 (行) におけるそのトランスポゾン挿入頻度。 fadLの結果も併せて示します。 C SF2 におけるエキソ多糖の生合成、輸送、および分解の予測経路。 G-6-P グルコース-6-リン酸、F-6-P フルクトース-6-リン酸、Ac アセチル基、Ac-CoA アセチル CoA、PEP ホスホエノールピルビン酸。

上述したように、広範囲の宿主範囲の根面適応度遺伝子（データS2.2および図S2）の中で、fadLの変異は傑出した高い根面定着率をもたらしましたが、exoFQPの変異はEPSの重合と分泌に関与しますが、exoFQPの変異はEPSの重合と分泌に関与しませんでした。 EPS 生合成に必要な exo 遺伝子はコロニー形成率を著しく低下させました。根面コロニー形成における FadL と ExoFQP の逆の役割を検証するために、fadL、exoF、exoP、および exoQ の変異体を構築しました。さらに、比較のために、EPS 生合成と分解の異なる段階に関与する 5 つの exo 遺伝子の変異体が構築されました: exoB (前駆体合成)、exoY (プライミング糖転移酵素)、exoA (糖転移酵素)、exoZ (置換)、および exoK (多糖分解)図２Ｃ）。これらの変異体は、Tn-seq と同じ条件下で SF2 を 1:1 の比率で個別に同時接種されました (図 1)。根面でのコロニー形成におけるそれらの競合能力は、Tn-seq の結果と概して一致していました。 fadL変異体は、CS7d、WS7d、およびR7d処理ではSF2よりも競合的であったが(図3A; p値<0.001)、Z7dではSF2と区別できなかった。対照的に、exoF、exoP、および exoQ 変異体は、4 つの植物種において SF2 と競合しました (図 3A; p 値 < 0.001)。

A exoF、exoQ、および exoP 変異体の根面定着能力の低下、および fadL 変異体のパフォーマンスの向上。試験変異体を、Tn-seqに使用したのと同じ条件下で野生型株SF2を1:1の比率で個別に同時接種した(図1;本明細書ではOD600 = 0.2の1ml接種物)。 B exoF、exoQ、exoP 変異体によるバーミキュライトで生育したマメ科植物の根粒占有の障害、および fadL 変異体のパフォーマンスの増加。野生型 SF2 (WT) は、グリシンソージャ (野生ダイズ W05) に効果的な根粒を形成しますが、グリシンマックス cv. には効果的な根粒を形成しません。 JD17 (栽培ダイズ) は、その rhcV 変異体が JD17 上に効果的な根粒を確立できます。 S. meliloti 株 SM01290 (CCBAU01290; BioSample: SAMN02388829) および SM2011 (BioSample: SAMN02603522) の fadL 変異体も、それらの宿主である Medicago sativa (アルファルファ) でテストされました。個々の変異体と WT の間の競合的な根面コロニー形成および根粒占有率の有意な差が示されています (1 サンプルの t 検定; 理論的平均 = 0.5; **、p < 0.01; ***、p < 0.001)。エラーバーは、3 つの生物学的複製の SD を表します (15 を超える植物からの根粒が分析され、試験根粒の数が示されています)。

exoY、exoA、exoZ、および exoK 変異体は、CS7d、WS7d、および R7d 処理では SF2 と区別できませんでしたが、exoY、exoZ、および exoK 変異体は、Z7d では競合能力の低下を示しました (33 ～ 43%、p 値 < 0.001) )、ただし、程度は exoF、exoP、および exoQ 変異体 (27 ～ 28%) よりも低いです。注目すべき例外は、ここでSF2と競合したexoB変異体であったが(図3A)、根面サンプルからのTn-seqデータではexoB変異体の枯渇は観察されなかった(図2B)。 UDP-グルコース 4-エピメラーゼをコードする ExoB は、変異体ライブラリーの混合物内の他の変異体によって提供される可能性のある UDP-ガラクトースを合成します [78]。この仮説は、いくつかの証拠によって裏付けられています：（1）シノリゾビウムの隠れたuxe遺伝子は、UDPキシロース/UDPアラビノースおよびUDPグルコース/UDPガラクトースの相互変換とその過剰発現を触媒する二機能性UDP-糖4-エピメラーゼをコードしています。 exoB を機能的に置き換えることができる [79]。 (2) しかし、このuxe遺伝子は一般に、野生型シノリゾビウム株のグローバルサイレンサーMucRによって抑制されている[79、80、81]。 (3) 根面サンプルの Tn-seq データ内の 2 つの mucR コピー (c08920 および a45250; 遺伝子あたり 377 ～ 758 個の挿入) でかなりの数のトランスポゾン挿入が観察されました (データ S1)。 exoY、exoA、exoZ、および exoK 変異体と比較した exoB 変異体の根本面コロニー形成欠陥 (図 4A) は、ExoB によって合成される UDP-ガラクトースが複数のガラクトース含有多糖類の前駆体であるという事実による可能性があります。 (リポ多糖類、サクシノグリカン、ガラクトグルカン) [82]。

コンゴレッドを含む TY プレート上の水泳 (左、0.3% 寒天) および表面運動性 (右、0.5% 寒天) の能力。 *、exoQ、exoF、およびexoP変異体のコロニーに顕著な亀裂。 B、C (A) に示すように、遊泳 (B) および表面運動 (C) 条件下でのコロニーの直径。 D 接種混合物（以下のように異なる比率で混合した：1:9）中の野生型 SF2（WT; 緑色）と比較した、fadL 変異体（赤）および exoF 変異体（赤）の表面運動能力の蛍光実体顕微鏡写真。、3:7、5:5、7:3、9:1）。 B、C 異なる文字は平均値間の有意差を示します (±SEM; ANOVA とそれに続くダンカン検定、アルファ = 0.05; 3 つの独立した実験)。

市販の根粒菌接種材料と在来の根粒菌の間の競合的な根粒形成は、農業実践における長期にわたる問題である[83]ため、これらの変異体は、バーミキュライトで栽培された植物での根粒占有能力についてさらに試験された。野生型SF2は、多くのツルマメ系統および一部のダイズ在来種では有効な根粒を形成できるが、特定の現代ダイズ品種では形成できない[67、84]。これらの変異体をツルマメ植物に接種すると、exoB変異体のみが根粒形成とシュート乾燥重量に関する共生性能に重大な欠陥を示しました（表S4）。さらに、exoB変異体は、競合的根粒形成実験においてSF2によって完全に打ち負かされた(1:1接種比;図3B)。 exoF、exoP、および exoQ 変異体も結節占有率に重大な欠陥を示しましたが (13 ～ 17%、図 3B)、他の exo 変異体の中で exoK のみが、より低い程度で結節占有率の障害を示しました (36%)。。 fadL (78%) および exoZ (63%) 変異体は、SF2 より多くの小結節を占めていました。 exoY、exoA、exoZ、および exoK 変異体はすべて、ツルマメ植物の根面定着に関して SF2 と区別できなかったため (図 3A)、競合的根粒形成における ExoZ および ExoK の役割は、EPS 修飾および劣化[73、85]。

我々は以前、SF2のタイプ3分泌系の必須成分をコードするrhcVの変異により、JD17などの特定の市販ダイズ品種における根粒形成と共生性能の向上が可能になることを報告した[84、86]。 fadLがrhcV変異体のバックグラウンドでさらに変異した場合、rchV fadL二重変異体はJD17においてrhcV変異体よりも高い結節占有率（61％）を示した（図3B; p < 0.01）。我々はさらに、アルファルファに関連する S. meliloti のモデル株 SM2011 [87] および接種菌株 SM01290 [88] における fadL 変異の影響をテストしました。これら 2 つの fadL 変異体は、野生型株 SM2011 および SM01290 よりも多くの結節を占有しました (図 3B; 74 ～ 78%; p 値 < 0.001)。まとめると、fadL 変異体と exoF、exoP、および exoQ 変異体の間の対照的な根粒占有能力は、それらの反対の根面コロニー形成能力と一致していました。

テスト変異体の対照的な根面定着能力（図2および図3A）、それらの増殖曲線（図S4A）、EPS産生（図S4B）、バイオフィルム形成（図S4C）に関連する潜在的な形質を明らかにするために。、水泳と表面運動性（図4A〜C）を比較しました。 exo 変異体と fadL 変異体は、TY リッチ培地での増殖曲線において互いに有意な差はありませんでした (図 S4A)。 exoZを除くすべてのexo変異体はEPSの生成が少なく（高分子量組成物と低分子量組成物の両方；図S4B）、これはバイオフィルム形成能力と一致していました（図S4C）。これらの結果は、EPS がバイオフィルムの重要なマトリックス成分であるという見解を裏付けています [25]。特に、exoF、exoP、およびexoQ変異体は、exoZを除く他のexo変異体と区別できず、fadL変異体はSF2と同様のEPS産生およびバイオフィルム形成能力を持っていました（図S4B、C）。明らかに、増殖曲線、EPS、およびバイオフィルム生成のこれらの特徴は、fadLおよびexo変異体の根面定着能力の観察された変動を説明できませんでした（図2および図3A）。これはおそらく、バイオフィルムが複数の細胞の「家」であり[25]、そのうちの一部のファミリーメンバー(特定のエキソ変異体など)が根微生物叢内の他のEPS生産者と根面に効果的に共定着できるという事実によるものと考えられます。

根への移動における運動性の重要な役割を考慮して、試験変異体の遊泳と表面運動性を比較しました（図4A〜C）。 fadL変異体は、SF2よりも高い表面運動能力を有していた(図4C; ANOVAとその後のダンカン検定、α=0.05)。すべての exo 変異体は、半固体プレート (コンゴレッドを含む 0.5% 寒天、図 4C) 上のコロニーの直径に関して低い表面運動性を示しましたが、exoF、exoP、および exoQ 変異体にはコロニーに顕著な放射状の亀裂がありました (図の * でマーク)図 4A)、他の exo 変異体では観察されませんでした (図 4A)。しかしながら、試験変異体の遊泳能力の変動は、それらの根面定着能力と一致しなかった(図4B)。対照的な表面運動表現型をさらに検証するために、GFP 標識 SF2 および mCherry 標識 fadL または exoF 変異体を、異なる比率 1:9、3:7、5:5:7:3、および 9:1 で混合しました (図 4D)。）、すべての接種率にわたって、fadL 変異体と exoF 変異体のそれぞれ高い表面運動能力と低い表面運動能力が実証されました。 fadL、exoF、exoP、およびexoQ変異体の表面運動能力は、対応する相補的変異株で完全に回復できます（図S5）。

入手可能な文献によると、試験用半固体プレート（0.5% 寒天）上の表面運動性は、鞭毛依存性の群れ形成および/または鞭毛非依存性の運動プロセス、たとえば、線毛依存性の単収縮、付着因子依存性の滑走、および成長圧力によって駆動される滑りである可能性があることが示唆されています。種および資源に依存した方法で追加の因子（例、界面活性剤、EPS、および表面タンパク質）によって促進されます[89、90]。この研究では、鞭毛、線毛、付着因子上の既知の遺伝子は、広宿主根面適応遺伝子のリストに見つかりませんでした（図S2およびデータS2.2）。たとえば、鞭毛フィラメントサブユニットをコードする4つのflaA遺伝子が欠失した場合（図S6A）、得られたflaA変異体は予想どおり鞭毛依存性遊泳能力の障害を示しました（0.3％寒天を含むTYプレート;図S6B-D; p < 0.01））、しかし、表面運動性（0.5％寒天を含むTYプレート;図S6B、D）および根面コロニー形成能力アッセイ（図S7）に関してはSF2と区別できませんでした。つまり、表面運動性の変化（おそらく滑りやその他の未知の運動機構）は、fadL変異体とexoF、exoP、およびexoQ変異体間の反対の根面コロニー形成能力と一致していた。

上記の証拠（図2〜4）は、表面運動能力と競合的な根面定着との相関関係を示唆しています。ここで、exoY、exoA、およびSF2株を対照として、fadL、exoF、exoP、およびexoQの個々の変異体の根面定着能力をさらに評価しました。 fadL 変異体は、ツルマメ、栽培ダイズ、イネ、トウモロコシで有意に高い根面定着能力を示しましたが、exoF、exoP、および exoQ 変異体は根面定着能力に重大な障害を示しましたが、exoA および exoY 変異体ではそうではありませんでした (図 5A)。 ; p 値 < 0.001)。対照的に、これらの変異体は、植物の非存在下で培養皿の濾紙上で同様の生存率を示した（図５Ａ；ｐ＞０．０５）。根面上のコロニー形成単位（CFU）の数は、さまざまな植物種の根滲出液の変動[20]および根マイクロバイオーム構築に対するそれらの影響[21]と一致する、全体的な宿主依存性パターンを示しました（図5A）。それにもかかわらず、fadL 変異体と exoF、exoP、および exoQ 変異体間の反対の根面コロニー形成能力は宿主依存性ではありませんでした。したがって、根圏効果に関する以下の実験は 1 つの植物種 (ツルマメ) に対してのみ実行されました。

個々の菌株の Rhizoplane コロニー形成能力。 F 植物なしフィルター、WS ツルマメ、CS 栽培ダイズ、R 米、Z トウモロコシ。 B 7 dpi (接種後日数) での WS 根上の個々の株の根面生存率。１ｈｐｉ（接種後数時間）のサンプルを比較のために使用した。野生型株 SF2 (WT) と比較して有意な差が示されています (t 検定; ***、p < 0.001)。エラーバーは 3 つの生物学的複製の SD を表します (SD 値が小さい場合は表示されません)。

観察された根面定着率の変動（図2、図3、および図5A）には、根圏および根面上での生存可能性、および根圏から根面への移動が関与している可能性がありますが、これについては公表されているTn-seq研究では十分に対処されていません。根面コロニー形成遺伝子の解析 [13,14,15,16,17,18]。テスト exo および fadL 変異体は、TY 豊富な培地での成長欠陥 (図 S4A) および植物培養皿の濾紙での生存性欠陥 (図 5A) を示さなかったが、これが根面上で当てはまるかどうかは不明のままであった。この質問に答えるために、培養皿に植える前に、試験株を苗の根に個別に接種しました（図 5B）。 7 dpi での根面上の CFU の数は、他の試験株 (SF2、exoY、exoA、exoQ、exoF、および exoP; p 値 < 0.001) と比較して fadL 変異株で有意に高かったのに対し、exo 変異株と SF2 はそうではありませんでした。互いに大きく異なります (図 5B)。これらの結果は、根面の生存能力が、fadL 変異体の優れた根面定着能力の少なくとも一部を説明するが、exoF、exoP、および exoQ 変異体の定着欠陥とは相関しないことを示唆しています。

これらの結果は、生存性と表面運動性の両方が、fadL、exoF、exoP、および exoQ 変異体間の対照的な根面定着能力の基礎となる根圏プロセスであるかどうかという疑問をさらに提起しました。この質問に答えるために、fadL または exoF 変異体、および SF2 を実生から 1/2/3/4 cm 離れたところに対称的に個別にスポットしました (図 6A)。接種スポットおよび根面上の CFU は 7 dpi で測定されました。すべての株において、接種部位が実生から離れるほど、根面上の CFU の数は減少し（図 6B-E、灰色のバー）、これは根面定着率の距離減衰パターンを示しました。これは、根圏効果のさまざまなモデルでは当然のことと考えられていますが、ほとんどテストされていない、細菌と根の相互作用効率の空間パターンの直接的な証拠を提供します [19、20、91]。 1 ～ 4 cm の部位にわたって、これら 2 つの変異体は SF2 と比較して生存率に有意な差を示さなかった (図 6B、C; p 値 > 0.05)。これらの部位にわたる生存率に関係なく、fadL および exoF 変異体は、SF2 よりも高い CFU (SF2 より 153 ～ 223% 高い CFU; p 値 < 0.001; 図 6B の左パネルの灰色のバー) と低い (SF2 より 75 ～ 98% 低い CFU) ＳＦ２；ｐ値＜０．００１；図６Ｃの左パネルの灰色のバー）それぞれ、ＳＦ２（図６Ｂ、Ｃの右パネルの灰色のバー）と比較した根面定着率。これら 2 つの変異体に関連するすべての根圏表現型は、対応する相補的変異株で回復できます (図 6D、E)。これらの結果は、対照的な表面運動能力と一致しています（図4および図S5）。まとめると、fadL 変異体、exoF 変異体、および SF2 間の根面定着能力の変動は、主に根圏から根面への移動プロセスにおける表面運動性によって調節されます。

AAの概略図は、根から1cm、2cm、3cm、4cm離れた位置に対称的に接種した野生型SF2(WT;緑)とその誘導体(赤)の根圏生存率アッセイを示しています。 B〜E 接種部位（フィルター）と根面（根）からのコロニー形成単位（CFU）を7 dpi（接種後日数）でテストしました。 WT と比較した有意差が示されています (t 検定; ***、p < 0.001)。エラーバーは、3 つの生物学的複製の SD を表します。

利用可能な証拠は、S. メリロティの長鎖脂肪酸輸送体 FadL のホモログが長鎖 AHL (少なくとも 12 個の炭素を含むアシル鎖を持つ) の取り込みを促進する可能性があり [92]、長鎖 AHL が生体界面活性剤として機能し、半固体プレート（0.75％寒天を含む酵母エキスマンニトール培地）上のRhizobium etliの表面運動性[93]。しかし、fadL 変異体からの AHL 混合物の直接測定はまだ利用できませんでした。したがって、我々は、AHLインジケーター株A. tumefaciens KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410)[46]を使用して、SF2、fadLおよびexoの変異体、およびそれらの相補的変異株におけるAHLの細胞外含有量を調べた[46]（図7A）。この指標菌株は、AHL生合成能力を欠いており、さまざまな鎖長、飽和レベル、酸化状態のAHL分子と相互作用するとPtraI-lacZ融合体の発現を活性化できるAHL受容体TraRを過剰発現している[46]。表面運動性プレート上では、fadL 変異体により A. tumefaciens KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410) が SF2 よりも多くの β-ガラクトシダーゼを発現するようになり (図 7B)、より多くの X-gal を切断して青色生成物を生成しました (図 7A)。）。対照的に、exoQ、exoF、およびexoP変異体は細胞外AHLのレベルが低下し、exoYおよびexoA変異体はSF2と同様であった(図7A、B)。 fadLおよびexoF/exoP/exoQ変異体からの細胞外AHLのレベルの増加および減少は、試験条件下でそれらの相補的変異株において回復することができる(図7A、B)。我々の知る限りでは[72、73、74、75、76、77、94]、これは細胞外AHLの調節におけるEPS分泌系の関与に関する最初の報告である可能性がある。

A TY プレート (0.5% 寒天、コンゴレッド、および X-gal) 上のバイオセンサー A. tumefaciens KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410) (丸) を使用した、根粒菌 (中央コロニー) からの細胞外 AHL の検出。 B (A) から収集した A. tumefaciens KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410) 細胞のβ-ガラクトシダーゼ活性。 C HPLC-Q-Exactive-PRM-MS アプローチを使用して測定された細胞内および細胞外の AHL 濃度。 NF、見つかりませんでした。膜に統合された FadL および ExoFPQ を介した長鎖および短鎖 AHL の輸送のための DA ワーキングモデル。短鎖 AHL による長鎖 AHL 生合成の予測された抑制が示されています。平均値間の有意差は、(B) (*、p < 0.05; ***、p < 0.001; t 検定)、および (C) (括弧内の異なる文字; ANOVA とそれに続くダンカン検定、アルファ = 0.05) に示されています。 3 つの独立した実験に基づいています。エラーバーは SEM (B) または SD (C) を表します。

fadL 変異体と exoF 変異体に関連する AHL の混合物についてさらに洞察を得るために、HPLC-Q-Exactive-PRM-MS アプローチを使用して細胞内および細胞外 AHL を測定しました (図 7C)。少量の短鎖 AHL 3-OXO-C8-HSL が exoF 変異体内で検出されましたが、他の試験株の細胞では検出できませんでした。対照的に、exoF 変異株では細胞外 3-OXO-C8-HSL は検出されませんでしたが、他の株では検出可能であり、その中で exoF 変異株の相補変異株は SF2 より多くの細胞外 3-OXO-C8-HSL を有していた (ANOVA)続いてダンカンの検定、アルファ = 0.05)。 exoF 変異体は、細胞内下部 (3-OXO-C12-HSL、3-OXO-C14-HSL、および C14-HSL) および細胞外長鎖 AHL (3-OXO-C12-HSL、C12-HSL) によっても特徴づけられました。、3-OXO-C14-HSL、およびC14-HSL; ANOVAとそれに続くダンカン検定、アルファ = 0.05）はSF2よりも優れています。その相補的変異株は、SF2 よりも高い細胞外長鎖 AHL (C12-HSL、3-OXO-C14-HSL、および C14-HSL; ANOVA とその後のダンカン検定、アルファ = 0.05) を有していたが、細胞内では SF2 と区別できませんでした。長鎖AHL。まとめると、これらの結果は、ExoF が短鎖 AHL 3-OXO-C8-HSL の分泌に必須であり、exoF 変異体における細胞内蓄積が長鎖 AHL の生合成および細胞外レベルの下方制御を引き起こす可能性があるというモデルを示唆しています。 AHL を連鎖させます (図 7D)。以前の研究では、緑膿菌からの多剤流出システム MexAB-OprM が長鎖 AHL の活発な分泌に関与しており、Burkholderia pseudomallei からの BpeAB-OprB 流出システムがさまざまな長さの AHL の分泌に必要であることが示されています [95, 96] ]。他の細菌の短鎖 AHL は、膜を越えて自由に拡散すると仮説が立てられています [97]。どうやら、AHL、特に短鎖 AHL の受動的拡散に関するこの長年の仮説は、より広範な調査に値するようです。

S. fredii では、traI 遺伝子と sinI 遺伝子はそれぞれ短鎖と長鎖の AHL の生合成に必須です [98]。実際、SF2のtraIおよびtraI exoF変異体からは3-OXO-C8-HSLは検出されなかった(図8A)。 exoF 変異体の細胞内 (SF2 の 1.7 ～ 4.6%) および細胞外 (SF2 の 25.9 ～ 57.4%) の長鎖 AHL の枯渇レベル (図 7C) は、traI をさらに欠失させることでかなり回復しました (図 8A; 58.9)。細胞内および細胞外の長鎖 AHL ではそれぞれ –87.7% および 79.6 ～ 85.4%）。さらに、内因性AHLを産生できないtraI sinI二重変異体(図8A)は、100ng/mlの外因性3-OXO-C8の存在下でtraI sinI exoF三重変異体よりも少ない細胞内3-OXO-C8-HSLの蓄積を示した。 -HSL (図8B)。まとめると、これらの結果は、短鎖AHLの分泌におけるExoFの重要な役割、および短鎖AHLの細胞内蓄積が長鎖AHLの生合成を負に調節することを支持する(図7D)。

A HPLC-Q-Exactive-PRM-MS アプローチを使用して測定された細胞内および細胞外の AHL 濃度。 NFが見つかりません。異なる文字は、ANOVA とそれに続くダンカン検定、アルファ = 0.05 に基づく平均間の有意差 (±SD、3 回の独立した実験) を示します。 B 100 ng/mlの外因性3-OXO-C8-HSLの存在下でのtraI sinIおよびtraI sinI exoF変異体の細胞内短鎖AHL。 C 100 ng/mlの外因性3-OXO-C14-HSLの存在下でのtraI sinIおよびtraI sinI fadL変異体の細胞内長鎖AHL。 D–F 外因性長鎖 AHL は根への根粒菌の移動能力を強化します (45 ng の 3-OXO-C12-HSL、52 ng C14-HSL、および 1 μg の 3-OXO-C14-HSL を含む 2 μl 長鎖 AHL 溶液) 、図7CのfadL変異体から検出された細胞外AHL組成による）。 DA 根粒菌 (WT/変異体) および AHL (または陰性対照として 0.8% NaCl) を根まで対称な距離で接種したことを示す実験計画の概略図。 E、F 長鎖 AHL は、WT (E)、traI sinI および exoF 変異体 (F) による根面定着を促進します。平均間の有意差（±SEM、3回の独立した実験）を（B〜F）に示します（*、p < 0.05; **、p < 0.01; ***、p < 0.001; t検定）。

対照的に、fadL変異体は、SF2と比較して同様のAHLの細胞内レベルを有していたが、最も高い細胞外長鎖AHLを特徴とした(図7C; ANOVAとその後のダンカン検定、α=0.05)。短鎖 AHL 3-OXO-C8-HSL の細胞内および細胞外レベルは、fadL 変異体と SF2 の間で同様でした。 fadL変異体の長鎖AHLの細胞外レベルは、その相補的変異株において回復することができる(図7C)。さらに、ｔｒａＩｓｉｎＩｆａｄＬ三重変異体は、１００ｎｇ／ｍｌの外因性３−ＯＸＯ−Ｃ１４−ＨＳＬの存在下で、ｔｒａＩｓｉｎＩ二重変異体と比較して、３−ＯＸＯ−Ｃ１４−ＨＳＬ取り込みに重大な欠陥を示した（図８Ｃ）。これらの発見は、長鎖AHLの取り込みシステムとしてのFadLの仮説を支持する、より洞察力に富んだ証拠を提供する[92](図7D)。

どうやら、fadL変異体とexoF変異体、およびSF2の間の対照的な根面コロニー形成能力と表面運動性は、細胞外AHLの混合におけるそれらの変異と一致している。長鎖 AHL は、R. etli の表面運動性を促進するバイオサーファクタントとして機能できることが実証されています [93]。私たちは、fadL 変異体由来の AHL の細胞外組成を模倣した合成混合物が、SF2 およびそのさまざまな変異体の表面運動性および根面定着率を改善するのではないかと考えました。したがって、3-OXO-C12-HSL (4.0%)、3-OXO-C14-HSL (91.3%)、および C14-HSL 3 (4.7%) を合成し、AHL の混合物として混合しました。半固体TYプレート（0.5％寒天）上では、AHLのこの混合物はSF2、flaA、exoF、およびtraI sinI変異体の表面運動性を大幅に改善しました（図S8; p値<0.001）。 exoF、traI sinI、およびsinI変異体（p値<0.001）は、対称接種実験において根定着率の低下を示しましたが、flaAおよびtraI変異体ではそうではありませんでした（図S7および図6）。長鎖 AHL の合成混合物を根から同じ距離で SF2、traI sinI、および exoF として対称的に接種した場合 (図 8E、F)、これらの株の根面コロニー形成率は、0.8% NaCl 対照と比較して大幅に向上しました。 (p 値 < 0.05)。長鎖AHLのこの拡散効果は、根から1cm、2cm、3cmまたは4cm離れたところで検出可能であった(図8E、F)。さらに、このAHL混合物は、1 cmおよび2 cmの部位でのSF2の生存性も大幅に向上させることができます（図S9; p値<0.001）。同様に、fadL 変異体も、これら 2 つの株を実生の両側に対称的に接種した場合に SF2 の生存率を高めることができます (図 6B)。ただし、細胞外長鎖 AHL の過剰生産菌である fadL 変異体は、根面でのコロニー形成において優れていました。。注目すべきことに、長鎖AHLを生成できないsinI変異体（図8A）は、対称接種実験（図S7）において根面定着率の低下を示しましたが、Tn-AHLの試験植物の根面上で豊富なsinI変異体が同定されました。 seq 画面 (図 S10)。 Tn-seq の結果は、sinI 変異体を 1:1 混合物として接種した場合、根面コロニー形成率の点で SF2 と同等に競合的であった (sinI 対 SF2 = 52% 対 48%; p > 0.05) と一致しました。これらの根面コロニー形成実験と一致して、sinI または traI sinI 変異体は、SF2 および traI 変異体と比較して表面運動性の低下を示しました（図 S10B; p 値 < 0.001）が、この表面運動性の欠陥は、SF2 と混合すると回復できます。 (図S10C)。したがって、sinI変異体の根面コロニー形成欠陥は、野生型SF2を含む接種材料混合物中で多機能性ExoFを欠く変異体ほど重大ではなかった。

持続可能な農業のための根のマイクロバイオームの工学技術はまだ初期段階にあり、その主な原因は根のマイクロバイオーム構築の根底にあるメカニズムの理解が限られているためです[20]。根微生物叢のキーストーン種の根面定着メカニズムに対する注目が高まっています。最近の先駆者のゲノムワイド Tn-seq 解析により、より多くの根面適応遺伝子 [13,14,15,16,17,18] が明らかになりつつありますが、根圏から根面への移動過程における機能は十分に解明されていません。この研究は、キーストーン受益種 S. fredii に焦点を当て、ツルマメ、栽培ダイズ、イネ、トウモロコシの根面定着を正または負に調節するその遺伝子のゲノムワイドな Tn-seq 調査を実施しました (図 1)。広範な宿主範囲の定着遺伝子の堅牢なリストが特定されました（図S2）。次に、我々は、広範囲の宿主範囲の根面面でのコロニー形成において、それぞれ負の役割と正の役割を持つ優れた fadL と exoF/exoQ/exoP に焦点を当てました (図 2 と図 3)。 EPS の生合成と分解に関与するこれら 4 つの遺伝子と関連するエキソ遺伝子の逆遺伝学的特徴付けは、対照的な根面定着能力が、水泳ではなく根圏から根面への表面運動性と、根圏と根面の生存能力によって媒介されることを示唆しています (図 3 – 図 3)。図6、および図S4〜S6）。これらの株からのクオラムセンシングAHLのさらなる生理学的分析（図7〜8）により、FadLが長鎖AHLの取り込みを媒介する一方、ExoFが短鎖AHLの分泌を媒介する可能性が高く、短鎖AHLの蓄積が明らかになりました。 exoF変異体の細胞内の鎖状AHLは、生合成の下方制御および長鎖AHLの細胞外レベルの低下を引き起こす可能性がある(図7D)。したがって、fadL 変異体と exoF 変異体、および SF2 の間で対照的な長鎖 AHL の細胞外レベルは、それらの根面コロニー形成率の変動と一致しています。根圏から根面への移動プロセスにおける長鎖AHLの重要な役割は、fadL変異体のものを模倣した長鎖AHLの合成混合物の拡散効果によってさらに検証された（図8E、F）。アルファプロテオバクテリアにおけるFadLおよびExoFQPホモログの広範な分布を考えると（図S11）、根への移動におけるFadL-ExoFQP媒介の表面運動性調節は、進化的に保存された遺伝子ニッチ相互作用機構である可能性があります。それは、根マイクロバイオームの多様なキーストーン種を含むこのクラスに属する根粒菌の「家庭生活」を形作ります。この研究で開発された手順は、他の細菌と宿主の相互作用の研究にも使用できます。この研究と他の出版された根面適応度遺伝子に関するハイスループット研究は、依然として、よく管理された実験室条件下でのよく知られたキーストーン種に限定されています。土壌-植物-微生物叢の相互作用におけるこれらのキーストーン種の生態学的役割は集中的に研究されているが、根面適応遺伝子の機能は、植物および微生物叢と集中的かつ動的に相互作用する複雑で変動する土壌条件下でさらに試験されることはほとんどない。根マイクロバイオーム研究に関連するメタゲノムデータの急速な蓄積とは対照的に、私たちの機能特性評価の取り組みはまだ限られており、ハイスループットの機能ゲノミクスツール（Tn-seqなど）はさらに改良され、さまざまな土壌条件下で探索される必要があります。

Tn-seq 解析の生配列データは、NCBI Sequence Read Archive (PRJNA808870) 経由でアクセスできます。

Parks DH、Chuvochina M、Chaumeil PA、Rinke C、Mussig AJ、Hugenholtz P. 細菌と古細菌の完全なドメインから種への分類。ナットバイオテクノロジー。 2020;38:1079–86。

論文 CAS PubMed Google Scholar

デルガド＝バケリソ M、オリヴェリオ AM、ブリューワー TE、ベナベント＝ゴンザレス A、エルドリッジ DJ、バージェット RD、他。土壌中に存在する主要な細菌の世界的なアトラス。科学。改訂 2018;359:320–5。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ブルガリ D、ロット M、シュラエッピ K、ヴァーローレンヴァンテマート E、アフマディネジャド N、アッセンザ F、他。シロイヌナズナの根に生息する細菌叢の構造と集合の手がかりを明らかにする。ネイチャー 2012;488:91–5。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ルンドバーグ DS、ルベイス SL、パレデス SH、ユアストーン S、ゲーリング J、マルファッティ S 他シロイヌナズナの中心となる根のマイクロバイオームの定義。ネイチャー 2012;488:86–90。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Edwards J 、Johnson C 、Saints-Medellin C 、Lurie E 、Podishetty NK 、Bhatnagar S など。イネの根関連マイクロバイオームの構造、変異、および集合。 Proc Natl Acad Sci USA。 2015;112:E911–E920。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu J、Zhang Y、Zhang P、Trivedi P、Riera N、Wang Y 他地球規模の柑橘類の根圏微生物叢の構造と機能。ナットコミューン。 2018;9:4894。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Hamonts K、Trivedi P、Garg A、Janitz C、Grinyer J、Holford P、他。現地調査により、植物の中核微生物叢とその推進要因の相対的な重要性が明らかになりました。環境微生物。 2018;20:124–40。

論文 CAS PubMed Google Scholar

de Lajudie PM、Andrews M、Ardley J、Eardly B、Jumas-bilak E. Nemanja Kuzmanovic、他。根粒菌およびアグロバクテリウムの新しい属および種を記載するための最小限の基準。 Int J Syst Evol 微生物。 2019;69:1852–63。

論文 PubMed Google Scholar

Bulgarelli D、Schlaeppi K、Spapepen S、Van Themaat EVL、Schulze-Lefert P. 植物の細菌叢の構造と機能。 Annu Rev Plant Biol。 2013;64:807–38。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Venturi V、Bez C. 植物マイクロバイオームにおける細菌間の細胞間相互作用についての呼びかけ。トレンド植物科学。 2021;26:1126–32。

論文 CAS PubMed Google Scholar

トリベディ P、リーチ JE、トリンジ SG、サ T、シン BK。植物とマイクロバイオームの相互作用:群集の集合から植物の健康まで。 Nat Rev 微生物。 2020;18:607–21。

論文 CAS PubMed Google Scholar

M. タウンゼント CR エコロジー: 個人から生態系へ、第 5 版を始めてください。 2021. 米国ニュージャージー州ホーボーケン：ワイリー。 2021年。

コール BJ、フェルトチャー ME、ウォーターズ RJ、ウェットモア KM、ムシン TS、ライアン EM、他。細菌性植物コロニー形成遺伝子のゲノムワイドな同定。 PLoSバイオル。 2017;15:e2002860。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu Z、Beskrovnaya P、Melnyk RA、Hossain SS、Khorasani S、O'sullivan LR、他。ゲノムワイドなスクリーニングにより、植物防御を回避するために必要な根圏関連シュードモナス属の遺伝子が同定されます。 mBio 2018;9:e00433–18。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

シヴァクマール R、ランジャニ J、ヴィシュヌ US、ジャヤシュリー S、ロザノ GL、マイルズ J、他。緑膿菌PGPR2トウモロコシ根定着に必須の遺伝子を同定するためのinseqの評価。 G3。遺伝子ゲノムジュネット。 2019;9:651–61。

CAS Google スカラー

Do Amaral FP、Tuleski TR、Pankievicz VCS、Melnyk RA、Arkin AP、Griffitts J、他。多様な細菌遺伝子は、有益な細菌による植物の根の結合を調節します。 mBio 2020;11:e03078–20。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ウィートリー RM、フォード BL、リー L、アロニー STN、ナイツ HE、レーダーマン R 他根圏から共生までの根粒菌の生活様式の適応。 Proc Natl Acad Sci USA 2020;117:23823–34。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

[ PubMed ] Torres M、Jiquel A、Jeanne E、Naquin D、Dessaux Y、Faure D. 植物腫瘍と根の定着に関与するアグロバクテリウムツメファシエンスの適応度遺伝子。 Nフィトール。改訂 2022;233:905–18。

記事 CAS Google Scholar

ナイツ HE、ジョリン B、ハスケット TL、プール PS。細菌の根定着メカニズムの解読。 Environ Microbiol Rep. 2021;13:428–44。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Sasse J、Martinoia E、Northen T. 友達に餌をあげましょう: 植物の浸出液が根のマイクロバイオームを形成しますか? トレンド植物科学。 2018;23:25–41。

論文 CAS PubMed Google Scholar

カワサキ A、デニス PG、フォースナー C、ラガベンドラ AKH、マテシウス U、リチャードソン AE 他根尖からの浸出液の組成を操作することで、根系全体のマイクロバイオームが形成されます。植物生理学。 2021;187:2279–95。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Matilla MA、Krell T. 宿主感染および病原性に対する細菌走化性の影響。 FEMS 微生物改訂版 2018;42:40–67。

記事 CAS Google Scholar

Colin R、Ni B、Laganenka L、Sourjik V。細菌生理学における鞭毛の運動性と走化性の複数の機能。 FEMS 微生物改訂版 2021;45:fuab038。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

バーン C、デュクレ A、ハーディ GG、ブラン YV。グラム陰性菌による非生物的表面への付着に関与する接着因子。微生物スペクトル。 2015;3:MB-0018-2015。

記事 Google Scholar

Karygianni L、Ren Z、Koo H、Thurnheer T. バイオフィルムマトリックソーム: 構造化された微生物群集の細胞外成分。トレンド微生物。 2020;28:668–81。

論文 CAS PubMed Google Scholar

プレスコットRD、デコAW。自然界におけるクォーラムセンシングの柔軟性と適応性。トレンド微生物。 2020;28:436–44。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ムカルジー S、バスラー BL。複雑で動的に変化する環境における細菌のクオラムセンシング。 Nat Rev 微生物。 2019;17:371–82。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ウィートリー RM、プール PS. 細菌が根に付着するメカニズム。 FEMS 微生物レター。 2018;42:448–61。

CAS Google スカラー

Ke J、Wang B、吉國 Y. マイクロバイオーム工学: 持続可能な農業における植物関連マイクロバイオームの合成生物学。トレンドバイオテクノロジー。 2021;39:244–61。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Niu B、Paulson JN、Zheng X、Kolter R. トウモロコシの根の簡略化された代表的な細菌群集。 Proc Natl Acad Sci USA。 2017;114:E2450–E2459。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

バナジー S、シュラエッピ K、ハイデンファンデル MGA。マイクロバイオームの構造と機能の原動力としてのキーストーン分類群。 Nat Rev 微生物。 2018;16:567–76。

Yeoh YK、Dennis PG、Paungfoo-Lonhienne C、Weber L、Brackin R、Ragan MA、他。熱帯土壌の時系列に沿った、植物門全体にわたる根の核となるマイクロバイオームの進化的保存。ナットコミューン。 2017;8:215。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

マッソン・ボワヴァン C、サックス JL. 根粒菌による共生窒素固定 - 成功物語のルーツ。現在の植物バイオール。 2018;44:7–15。

論文 CAS PubMed Google Scholar

プール P、ラマチャンドラン V、テルポリ J. 根粒菌: 腐生植物から内部共生生物まで。 Nat Rev 微生物。 2018;16:291–303。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zhou JM、Zhang Y. 植物免疫: 危険の認識と信号伝達。セル 2020;181:978–89。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ロイ S、リュー W、ナンデティ RS、クルック A、マイソール KS、ピスラリウ CI、他マメ科植物の根粒形成と共生窒素固定における遺伝的発見の 20 年を祝う。植物細胞。 2020;32:15–41。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Compton KK、Hildreth SB、Helm RF、Scharf BE。アルファルファフラボノイドに対する Sinorhizobium meliloti 走化性に関する最新の見解。フロント微生物。 2020;11:581482。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ビスワスJC、ラダJK、ダッツォFB。根粒菌の接種により、低地イネの栄養摂取と成長が改善されます。 Soil Sci Soc Am J. 2000;64:1644–50。

記事 CAS Google Scholar

Wu Q、Peng X、Yang M、Zhang W、Dazzo FB、Uphoff N、他根粒菌は、細胞シグナル伝達、分裂、拡大を標的とすることにより、イネの新芽の成長を促進します。植物モルバイオル。 2018;97:507–23。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ヤニー YG、ダッツォ FB、スクアルティーニ A、ザナルド M、ジダン MI、エルサダニー AEY。根粒菌と小麦の間の自然内生菌の関連性と、ナイル川デルタにおける小麦生産を増加させるその能力の評価。植物の土。 2016;407:367–83。

記事 CAS Google Scholar

Liu H、Wang X、Qi H、Wang Q、Chen Y、Li Q 他アゾリゾビウム・カリノダンス ORS571 の小麦 (Triticum aestivum L.) への感染と影響。 PLoS ONE。 2017;12:e0187947。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Woodard HJ、Bly A. 乾燥地生産条件下での種子を接種した N2 固定細菌に対するトウモロコシの成長と収量の応答。 J植物栄養剤。 2000;23:55–65。

記事 CAS Google Scholar

プエプケ SG、ブロートン WJ。根粒菌 sp. NGR234 株と R. fredii USDA257 株は、非常に広い入れ子の宿主範囲を共有しています。モル植物と微生物の相互作用。 1999;12:293–318。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Liu LX、Li QQ、Zhang YZ、Hu Y、Jiao J、Guo HJ 他硝酸塩低減遺伝子クラスターの構成要素は、シノリゾビウムとダイズとの共生の最適化に系統依存的に寄与します。環境微生物。 2017;19:4926–38。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Jiao J、Wu LJ、Zhang B、Hu Y、Li Y、Zhang XX、他 MucR は、大豆根粒における Sinorhizobium fredii の窒素固定をサポートするための、保存されたイオントランスポーターの転写活性化に必要です。モル植物と微生物の相互作用。 2016;29:352–61。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zhu J、Chai Y、Zhong Z、Li S、Winans SC。 n-アシルホモセリンラクトン型クォラムセンシング分子の超高感度検出のためのアグロバクテリウムバイオアッセイ株：メソルヒゾビウム・フアクイにおける自己誘導物質の検出。アプリケーションエンビロン微生物。 2003;69:6949–53。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Goodman AL、McNulty NP、Zhao Y、Leip D、Mitra RD、Lozupone CA、他。ヒトの腸内共生生物をその生息地に確立するために必要な遺伝的決定因子を特定する。細胞宿主微生物。 2009;6:279–89。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ラングミード B、ザルツベルク SL。 Bowtie 2. Nat メソッドによる高速ギャップリードアライメント。 2012;9:357–9。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

デヘスス MA、アンバディプディ C、ベイカー R、サセッティ C、ヨエルガー TR。 TRANSIT - Himar1 TnSeq 解析用のソフトウェアツール。 PLoS コンピューティングバイオル。 2015;11:e1004401。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

パウエル JE、レナード SP、クォン WK、エンゲル P、モラン NA。ゲノムワイドスクリーニングにより、細菌の腸内共生生物における宿主定着決定因子が同定されます。 Proc Natl Acad Sci USA。 2016;113:13887–92。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

マルクス CJ、リドストローム ME。グラム陰性菌における抗生物質マーカーのリサイクルのための広範な宿主範囲の cre-lox システム。バイオテクニック 2002;33:1062–7。

論文 CAS PubMed Google Scholar

クワント・J、ハインズMF。グラム陰性菌の遺伝子置換の直接選択を可能にする多用途の自殺ベクター。ジーン 1993;127:15–21。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Hu Y、Jiao J、Liu LX、Sun YW、Chen W、Sui X 他マメ科の根粒における最終分化を伴わない根粒菌のリン酸欠乏の証拠。モル植物と微生物の相互作用。 2018;31:1060–8。

論文 CAS PubMed Google Scholar

コヴァッハ ME、エルザー PH、ヒル DS、ロバートソン GT、ファリス MA、ループ RM 2nd 他異なる抗生物質耐性カセットを搭載した、広範囲の宿主範囲に対応するクローニングベクター pBBR1MCS の 4 つの新しい誘導体。ジーン 1995;166:175–6。

論文 CAS PubMed Google Scholar

レーダーマン R、バルチュ I、レムス・エムザーマン MN、フォルホルト JA、フィッシャー HM。宿主植物の感染とコロニー形成を分析するための Bradyrhizobium diazoefficiens の安定した蛍光タグと酵素タグ。モル植物と微生物の相互作用。 2015;28:959–67。

論文 CAS PubMed Google Scholar

メリット JH、カドゥリ DE、オトゥール GA。静的なバイオフィルムの成長と分析。カープロトック微生物。 2005年; 第 1 章: ユニット 1B.1。 https://doi.org/10.1002/9780471729259.mc01b01s00。

Wang D、Couderc F、Tian CF、Gu W、Liu LX、Poinsot V。異なる系統系統のシノリゾビウム株の根粒形成ダイズによって産生される nod 因子と細胞外多糖の保存された組成。フロント微生物。 2018;9:2852。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

グールド TA、ハーマン J、クランク J、マーフィー RC、チャーチル MEA。質量分析法によって調べられたアシルホモセリンラクトンシンターゼの特異性。 J バクテリオール。 2006;188:773–83。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jiao J、Ni M、Zhang B、Zhang Z、Young JPW、Chan TF 他 Sinorhizobium fredii の多部分ゲノムにおけるコア遺伝子とアクセサリー遺伝子の調整された制御。 PLoS ジュネット。 2018;14:e1007428。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

サラス ME、ロサーノ MJ、ロペス JL、セラニア J、アルトゥーロ G、テヘリソ T、他。特異性形質は、Ensifer meliloti の根圏植民地化によって示されるマメ科植物と根粒菌の共進化と一致します。環境微生物。 2017;19:3423–38。

論文 CAS PubMed Google Scholar

サルバドール・ロペスJM、ファン・ボガートINA。微生物の脂肪酸輸送タンパク質とそのバイオテクノロジーの可能性。バイオテクノロジーバイオエンジ。 2021;118:2184–201。

論文 PubMed Google Scholar

Somboon K、Doble A、Bulmer D、Baslé A、Khalid S、van den Berg B. FadL チャネルを介した側方拡散による生分解中の単芳香族炭化水素の取り込み。ナットコミューン。 2020;11:6331。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Van Den Berg B. FadL ファミリー: 異常な基質に対する異常なトランスポーター。現在の構造バイオル。 2005;15:401–7。

論文 PubMed Google Scholar

Van Den Berg B. 横方向に進む: タンパク質チャネル壁を通る疎水性分子の膜貫通。 ChemBioChem 2010;11:1339–43。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

石澤博、黒田正、井上大、池 M. 浮遊大型植物ウキクサにおける細菌の定着と適応度決定因子のゲノムワイドな同定。コミューンバイオル。 2022;5:3–5。

記事 Google Scholar

DiCenzo GC、Checcucci A、Bazzicalupo M、Mengoni A、Viti C、Dziewit L、他代謝モデリングにより、Sinorhizobium meliloti におけるニッチ適応のための二次レプリコンの特殊化が明らかになりました。ナットコミューン。 2016;7:12219。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tian CF、Zhou YJ、Zhang YM、Li QQ、Zhang YZ、Li DF、他根粒菌根粒形成ダイズの比較ゲノミクスは、適応において系統特異的な遺伝子が広範囲に動員されることを示唆している。 Proc Natl Acad Sci USA。 2012;109:8629–34。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Masson-Boivin C、Giraud E、Perret X、Batut J. マメ科植物との窒素固定共生の確立: 根粒菌のレシピは何通りありますか? トレンド微生物。 2009;17:458–66。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ルーバーTL、ウォーカーGC。リゾビウムメリロティの共生的に重要な体外多糖であるサクシノグリカンの生合成。細胞。 1993;74:269–80。

論文 CAS PubMed Google Scholar

チェン HP、ウォーカー GC。サクシノグリカンは、根粒菌によるアルファルファの根粒形成中の感染糸の開始と伸長に必要です。 J バクテリオール。 1998;180:5183–91。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

藤重 NA、カパディア NN、デホフ PL、ハーシュ AM。根粒菌バイオフィルム形成の研究。 FEMS 微生物エコル。 2006;56:195–206。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Skorupska A、Janczarek M、Marczak M、Mazur A、Krol J. 根粒菌外多糖類: 遺伝子制御と共生機能。マイクロセルの事実。 2006;5:7。

記事 Google Scholar

Staehelin C、Forsberg LS、D'Haeze W、Gao MY、Carlson RW、Xie ZP、他。 Rhizobium sp.のエキソオリゴ糖 NGR234 株はさまざまなマメ科植物との共生に必要です。 J バクテリオール。 2006;188:6168–78。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schmid J. 微生物のエキソ多糖生合成とエンジニアリング戦略に関する最近の洞察。カー・オピン・バイオテクノロジー。 2018;53:130–6。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Schmid J、Sieber V、Rehm B. 細菌の外多糖: 生合成経路と工学戦略。フロント微生物。 2015;6:496。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ゴンザレス JE、セミノ CE、ワン LX、カステラーノ＝トーレス LE、ウォーカー GC。リゾビウムメリロティの共生的に重要な体外多糖であるサクシノグリカンの八糖サブユニットの重合における分子量の生合成制御。 Proc Natl Acad Sci USA 1998;95:13477–82。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Niemeyer D、Becker A. Sinorhizobium meliloti によって生成されるサクシノグリカンの分子量分布は、ExoP タンパク質の細胞質ドメインの特異的なチロシンリン酸化と ATPase 活性によって影響されます。 J バクテリオール。 2001;183:5163–70。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Buendia AM、Enenkel B、Köplin R、Niehaus K、Arnold W、Pünier A. メガプラスミド 2 の Rhizobium meliloti exoZ1 exoB フラグメント: ExoB は UDP-グルコース 4-エピメラーゼとして機能し、ExoZ は Rhizobium Leguminosarum biovar viciae 株の NodX と相同性を示しますトム。モル微生物。 1991;5:1519–30。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Schäper S、Wendt H、Bamberger J、Sieber V、Schmid J、Becker A. 二機能性 UDP-Sugar 4-エピメラーゼは、Sinorhizobium meliloti における複数の細胞表面多糖類の生合成をサポートします。 J バクテリオール。 2019;201:e00801–18。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Jiao J、Zhang B、Li ML、Zhang Z、Tian CF。 α-プロテオバクテリアのジンクフィンガーを持つ異種サイレンサーMucRは、適応と規制の完全性のバランスをとっている。 ISME J. 2022;16:738–49。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Jiao J、Tian CF。アルファプロテオバクテリアの祖先ジンクフィンガー含有タンパク質MucR：新規異種サイレンサー? Comput Struct Biotechnol J. 2020;18:3623–31。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

アコスタ・フラド S、フエンテス・ロメロ F、ルイス・サインツ JE、ヤンザレク M、ビナルデル JM。根粒菌外多糖類：その合成の遺伝的調節とマメ科植物との共生との関連性。 Int J Mol Sci. 2021;22:6233。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ブロックウェル J、ボトムリー PJ. 接種技術の最近の進歩と将来の展望。土壌生物生化学。 1995;27:683–97。

記事 CAS Google Scholar

Zhao R、Liu LX、Zhang YZ、Jiao J、Cui WJ、Zhang B、他共進化した挿入配列によって媒介される根粒菌の共生適合性の適応進化。 ISME J. 2018;12:101–11。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ヨークGM、ウォーカーGC。サクシノグリカンのスクシニルおよびアセチル修飾は、リゾビウムメリロティグリカナーゼ ExoK および ExsH による切断に対するサクシノグリカンの感受性に影響します。 J バクテリオール。 1998;180:4184–91。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cui W、Zhang B、Zhao R、Liu L、Jiao J、Zhang Z 他マメ科根粒の技術革新に先立って行われたコア経路の系統特異的な再配線が、共生効率を形作る。 mSystems 2021;6:e01299–20。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sallet E、Roux B、Sauviac L、Jardinaud MF、Carrère S、Faraut T、他 EuGene-P による原核生物ゲノムの次世代アノテーション: Sinorhizobium meliloti 2011 への応用。DNA Res. 2013;20:339–53。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jia RZ、Wang ET、Liu JH、Li Y、Gu J、Yuan HL、他エンシファーメリロティ株とアルファルファ品種のさまざまな組み合わせの有効性と、在来の根粒菌の根粒形成に対するそれらの影響。土壌生物生化学。 2013;57:960–3。

記事 CAS Google Scholar

ワドワ・N、バーグHC。細菌の運動性: 機械とメカニズム。 Nat Rev 微生物。 2021;20:161–73。

論文 PubMed Google Scholar

ヘルシャー T、コヴァチ ÁT. 表面を滑らせる: アクティブなモーターなしで細菌が拡散します。環境微生物。 2017;19:2537–45。

論文 PubMed Google Scholar

ライナ JB、フェルナンデス V、ランバート B、ストッカー R、シーモア JR。共生における微生物の運動性と走化性の役割。 Nat Rev 微生物。 2019;17:284–94。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Krol E、Becker A. 脂肪酸輸送体 FadL の根粒菌ホモログは、長鎖アシル-ホモセリンラクトンシグナルの認識を促進します。 Proc Natl Acad Sci USA。 2014;111:10702–7。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Daniels R 、 Reynaert S 、 Hoekstra H 、 Verreth C 、 Janssens J 、 Braeken K 、他。 Rhizobium etli の群集形成に影響を与えるバイオサーファクタントとしてのクオラムシグナル分子。 Proc Natl Acad Sci USA 2006;103:14965–70。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ベッテンワース V、スタインフェルド B、ドゥイン H、ピーターセン K、ストライト WR、ビショフス I 他細菌のクオラムセンシングシステムにおける表現型の不均一性。 J Mol Biol 2019;431:4530–46。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ying YC、Hao SB、Tan TMC、Mattmann ME、Geske GD、Igarashi J、他 Burkholderia pseudomallei 多剤排出ポンプによるクオラムセンシングの制御。 J バクテリオール。 2007;189:4320–4。

記事 Google Scholar

ピアソン JP、ヴァンデルデン C、イグルスキー BH。活発な排出と拡散は、緑膿菌の細胞間シグナルの輸送に関与しています。 J バクテリオール。 1999;181:1203–10。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Daniels R、Vanderleyden J、Michiels J. 細菌のクォーラムセンシングと群集移動。 FEMS 微生物改訂版 2004;28:261–89。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Acosta-Jurado S、Alias-Villegas C、Almozara A、Espuny MR、Vinardell JM、Pérez-Montaño F. Sinorhizobium fredii HH103 のクオラムセンシングシステムの共生的重要性を解読します。微生物 2020;8:68。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

A. tumerfaciens KYC55(pJZ372)(pJZ384)(pJZ410) を共有および提供してくださった南京農業大学の Zengtao Zhong 教授と中国農業大学の Honli Yuan 教授に感謝します。この研究は、中国国家重点研究開発プログラム (助成金番号 2019YFA09004700)、中国国立自然科学財団 (助成金番号 32070078)、農業バイオテクノロジー国家重点研究所の革新的プロジェクト (助成金番号 2020SKLAB1-5) によって支援されました。中国農業大学の2115人材育成プログラム。

中国農業大学、北京、中国農業バイオテクノロジー国家重点実験室および生物科学院

Yuan-Yuan Ji、Biliang Zhang、Pan Zhang、Liu-Chi Chen、You-Wei Si、Xi-Yao Wan、Can Li、Ren-He Wang、Yu Tian、Ziding Zhang、Chang-Fu Tian

MOA 土壌微生物学重要研究所および根粒菌研究センター、中国農業大学、北京、中国

Yuan-Yuan Ji、Biliang Zhang、Pan Zhang、Liu-Chi Chen、You-Wei Si、Xi-Yao Wan、Can Li、Ren-He Wang、Yu Tian、Chang-Fu Tian

深セン合成生物学研究所 (iSynBio) 深セン先端技術研究所 (SIAT)、中国科学院、518055、深セン、中国

パン・ジャン

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

CFT がこのプロジェクトを発案しました。 CFT と YYJ が調査を企画しました。 YYJ は、PZ、LCC、YWS、XYW、CL、RHW、および YT の協力を得てすべての実験を実行しました。 YYJとBLZはZZの協力を得てTn-seqデータを解析した。 CFTとYYJが論文を作成した。 CFT は論文をレビューし、編集しました。すべての作成者が最終バージョンを承認しました。

Chang-Fu Tian への通信。

中国農業大学は、CFTとYYJが発明者として記載されているfadL変異体の農業応用の側面を含む仮特許出願を提出した。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

オープンアクセスこの記事はクリエイティブコモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブコモンズライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Ji、YY.、Zhang、B.、Zhang、P. 他。細胞外長鎖AHLのFadL-ExoFQP調節によって媒介される根への根粒菌の移動。 ISME J 17、417–431 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41396-023-01357-5

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 3 月 2 日

改訂日: 2022 年 12 月 28 日

受理日: 2023 年 1 月 4 日

公開日: 2023 年 1 月 10 日

発行日：2023年3月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01357-5

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

マイクロバイオーム (2023)

前: 再利用してバイオ燃料としてリサイクルできる、より強力な紙袋が未来になる可能性がある次: 新しい論文は「中位」を求めている

お問い合わせを送信

送信