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Jun 17, 2023

Communications Biology volume 5、記事番号: 1290 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

細菌と真菌は、非酸化的ペントースリン酸経路を利用して、ヌクレオシドのリボース部分を中心的な炭素代謝に導きます。 多くの古細菌はこの経路を持たず、代わりにサーモコッカスはリボース-1,5-二リン酸 (R15P) イソメラーゼとリブロース-1,5-二リン酸 (RuBP) カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ (Rubisco) が関与するペントース二リン酸経路を利用します。 興味深いことに、好塩性古細菌の複数のゲノムは R15P イソメラーゼのみを保有しており、ルビスコは保有していないようです。 本研究では、グアノシンホスホリラーゼ、ATP依存性リボース-1-リン酸キナーゼ、R15Pイソメラーゼ、RuBPホスファターゼ、リブロース-1-リン酸アルドラーゼ、およびグリコールアルデヒドレダクターゼから構成される、好塩性古細菌におけるこれまで認識されていなかったヌクレオシド分解経路を同定した。 この経路は、グアノシンのリボース部分をジヒドロキシアセトンリン酸とエチレングリコールに変換します。 グアノシンからR15Pを介してRuBPに至る代謝経路は、サーモコッカー目のペントース二リン酸経路と類似しているが、その下流経路はルビスコを利用せず、好塩性古細菌に特有である。

古細菌が細菌や真菌には見られない独特の代謝酵素と経路を示すことは十分に確立されています1、2、3。 代表的なものはペントース代謝です。 細菌と真核生物はペントースリン酸経路 4 を利用して、核酸のペントース部分を合成または分解します。 酸化的ペントースリン酸経路 (OPP 経路) は、グルコース 6-リン酸から核酸前駆体リブロース 5-リン酸 (Ru5P) およびリボース 5-リン酸 (R5P) を合成し、NADPH の形で還元等価物を生成します。 非酸化的ペントースリン酸経路（NOPP経路）は、ペントース（Ru5PおよびR5P）とフルクトース6-リン酸およびグリセルアルデヒド3-リン酸の間の相互変換を実行し、ヌクレオシドのリボース部分を中心炭素代謝の中間体に変換できます（補足図） .1a)。 しかし、多くの古細菌は OPP および NOPP 経路を持っていません。 代わりに、リブロース一リン酸 (RuMP) 経路を利用して核酸生合成に必要なペントースを生成し 5,6,7 、フルクトース 6-リン酸を Ru5P とホルムアルデヒドに変換します。 例外として、ほとんどの好塩性古細菌は OPP 経路を持っています 7、8、9、10 が、サーモプラズマトータ、タウマルチャエオタ、ハロラブダス、メタノコッカス、およびメタノカルドコッカスのメンバーを含む多くの古細菌種は、NOPP 経路を構成する遺伝子相同体を保有すると予測されています。 ただし、Methanocaldococcus jannaschii は NOPP 経路と RuMP 経路の両方を保有していますが 11、R5P は RuMP 経路によって生成されるようである 12 ことに注意する必要があります。

ヌクレオシド分解に関しては、超好熱性古細菌サーモコッカス・コダカレンシスはペントース二リン酸経路を利用します13、14、15（図1aおよび補足図1b）。 この経路の代謝産物はペントースリン酸経路の代謝産物とは大きく異なり、多くの独特な酵素が関与しています。 細菌や真核生物と同様に、ヌクレオシドは、ウリジン、グアノシン、アデノシンを認識する 3 つのヌクレオシド ホスホリラーゼ (それぞれ TK1479、TK1482、TK1895) によってリボース-1-リン酸 (R1P) と核酸塩基に変換されます。 R1P はペントースリン酸経路で R5P に変換されますが、R1P は T. kodamarensis の ADP 依存性リボース-1-リン酸キナーゼ (ADP-R1PK; TK2029) によってリン酸化され、リボース-1,5-二リン酸 (R15P) が生成されます。 次に、R15P イソメラーゼ (TK0185) は R15P をリブロース-1,5-二リン酸 (RuBP) に変換し、その後、リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ (Rubisco) のカルボキシラーゼ活性によって 3-ホスホグリセリン酸 (3-PGA) に変換されます。 ;TK2290)16、17、18、19。 T. kodamarensis は、AMP、CMP、および UMP のリン分解を触媒する独特のヌクレオシド-5'-一リン酸ホスホリラーゼ (NMP ホスホリラーゼ、以前は AMP ホスホリラーゼ; TK0352 と呼ばれていた) も保有しています 14,15。 これにより、NMP から R15P への直接変換が可能になるだけでなく、R1P および R15P を介したヌクレオシドから NMP への変換も可能になります (図 1a および補足図 1b)。 したがって、R15P は、ヌクレオシドおよびヌクレオチド代謝を中心炭素代謝と結び付けるノードとして機能します 13,20。

a Thermococcus で同定された古典的なペントース二リン酸経路は、ヌクレオシドの分解および/またはヌクレオシドの NMP への変換に関与していると予測されています。 NMP シャントは、NMP ホスホリラーゼ、R15P イソメラーゼ、および Rubisco で構成され、NMP を 3-PGA に分解します。 b この研究で提案された非カルボキシル化ペントース二リン酸経路を示します。 赤い矢印は、この研究で特定された経路に特異的な反応であり、古典的なペントース二リン酸経路には存在しない反応を示します。 この研究でその組換えタンパク質が検査された酵素をコードする遺伝子座タグが示されている。 括弧付きの遺伝子座タグは、H. salinarum の無細胞抽出物でその活性が検出された酵素をコードすると予測される遺伝子です。 VNG_6270G に関しては、天然酵素と組換え酵素の両方が調査されました。 NMP ヌクレオシド-5'-一リン酸、R1P リボース-1-リン酸、R15P リボース-1,5-二リン酸、RuBP リブロース-1,5-二リン酸、3-PGA 3-ホスホグリセレート、Ru1P リブロース-1-リン酸、DHAP ジヒドロキシアセトンリン酸。

ペントース二リン酸経路の分布を調べると、NMP ホスホリラーゼ、R15P イソメラーゼ、および Rubisco のホモログが広範囲の古細菌で見つかります。 アーケオグロバル目、ロキアーキオータ目、メタノ微生物目、メタノサルシナ目、サーモコッカスのほとんどのメンバー、ならびにデスルフロコッカス目、ハロバクテリア目、メタノコッカスの一部のメンバー、およびサーモプロテア目のほとんどのサーモフィルム種。 さらに、メタゲノム解析により、多くの細菌種にこれらの遺伝子が存在することが示唆されたことが最近報告されました 21。 このことは、ペントース二リン酸経路のこの部分（ここでは「NMPシャント」と呼ぶ）が多くの古細菌およびいくつかの細菌種で機能している可能性を提起する。 一方、ADP-R1PK ホモログの分布は、Palaeococcus 属、Pyrococcus 属、および Thermococcus 属を含む Thermococcales のメンバーに限定されているようです。 しかし、サーモコッカー目のADP依存性キナーゼには、リン酸供与体としてATPに依存する他の古細菌の対応物があることはよく知られています。 これらには、解糖におけるグルコキナーゼ 22、23、24 およびホスホフルクトキナーゼ 25、26、アミノ酸代謝におけるセリンキナーゼ 27、28、さらには R1P キナーゼそのもの 13、29 が含まれます。 同じリン酸受容体を認識するこれらの ATP 依存性キナーゼと ADP 依存性キナーゼは、通常、互いに類似性を示しません。 したがって、ゲノム配列のみに基づいて R1P キナーゼ活性の分布を正確に結論付けることは困難です。 古細菌にはリン酸受容体が同定されていない糖キナーゼとして注釈が付けられているタンパク質が多数あり、これらには未同定の R1P キナーゼが含まれる可能性があります。

興味深いことに、我々は、多くの好塩性古細菌が R15P イソメラーゼ相同体を保有しているが、NMP ホスホリラーゼと Rubisco については相同体を持たないことを発見しました。 さらに、R1P キナーゼの明確な相同体は好塩菌ゲノムのいずれにも存在しません。 したがって、ゲノム配列は、これらの好塩菌には、基質を供給したり、R15P イソメラーゼの生成物を利用したりする酵素が存在しないことを示唆しています。 この研究では、明らかに独立した R15P イソメラーゼに関連する酵素を探索し、好塩性古細菌のペントース二リン酸 R15P と RuBP が関与するこれまで知られていなかった代謝経路を特定しました。

この研究は、ペントース二リン酸経路全体が発見される前に開始されましたが、当時は NMP から NMP ホスホリラーゼ、R15P イソメラーゼ、および Rubisco からなる 3-PGA への経路しか知られていませんでした 14,15 (図 1a)。 多くの古細菌種は 3 つの酵素すべての相同体を保有していましたが、興味深いことに、一部の好塩性古細菌は R15P イソメラーゼ相同体のみを保有していました 15。 これらには、T. kodamarensis (TK0185) の R15P イソメラーゼと 48.1% 同一である VNG_1853G タンパク質を持つ Halobacterium salinarum が含まれますが、NMP ホスホリラーゼや Rubisco のホモログは持ちません。 表1に示した63種の好塩性古細菌のうち、19種でそのようなケースが観察されている(表1、VNG_1853G欄の赤色またはオレンジ色)。 一方、14 種の好塩性古細菌は完全な相同体セットを保有しています (TK0352/VNG_1853G/TK2290 カラムの青色)。一方、11 種は R15P イソメラーゼと Rubisco 相同体のみを保有しています (VNG_1853G/TK2290 カラムの緑色)。

我々は、R15P イソメラーゼホモログが実際にリボース-1,5-二リン酸イソメラーゼ反応を触媒するかどうかを調べました。 H. salinarum (VNG_1853G) および Haloterrigena turkmenica (Htur_0571) の対応する遺伝子が大腸菌で過剰発現されました。 H. turkmenica からの Htur_0571 タンパク質のみが可溶性形態で取得でき、見かけの均一性まで精製できました (補足図 2a)。 RuBPは、精製Htur_0571タンパク質の存在下でR15Pから生成され（図2a）、このタンパク質がR15Pイソメラーゼ活性を示し、Ht-R15Pイソメラーゼと命名されたことを示しています。 この結果は、好塩性古細菌における R15P と RuBP が関与する未知の経路の存在を示唆しました。

a Ht-R15Pイソメラーゼ酵素の存在下または非存在下で、R15PからのRuBPの生成を調べた。 黒、ピンク、青、緑の線は、それぞれ酵素なしの反応生成物、酵素ありの反応生成物、20 mM R15P 標準化合物、および 10 mM RuBP 標準化合物を示します。 b Hx-RbsKタンパク質の存在下または非存在下で、R1PからのR15Pの生成を調べた。 黒、ピンク、青、緑の線は、それぞれ酵素なしの反応生成物、酵素ありの反応生成物、10 mM R1P 標準化合物、および 20 mM R15P 標準化合物を示します。 c Hx-RbsKおよびHt-R15Pイソメラーゼタンパク質によるR1Pの変換を調べました。 Hx-RbsKによるキナーゼ反応後、Ht-R15Pイソメラーゼによるイソメラーゼ反応を行った。 反応生成物をＨＰＬＣで分析した。 ピンクと黒の線は、それぞれ 2 回目の反応における Ht-R15P イソメラーゼを使用した反応生成物と、Ht-R15P イソメラーゼを使用しない反応生成物を示します。 カラムで分離された化合物は示差屈折率検出器でモニタリングされました。

R15PやRuBPの代謝に関与する酵素を同定するために、ゲノム配列を用いて候補遺伝子を検索した。 スタンドアロンの R15P イソメラーゼ相同体を持つ好塩性古細菌には、H. salinarum30、Halopiger xanaduensis31、Halorubrum lacusprofundi32、H. turkmenica33、好塩性古細菌 DL31、Natrinema pellirubrum、Natronobacterium gregoryi、および Natronococcus occultus が含まれます。 これら 8 種で R15P イソメラーゼ ホモログとオペロンを形成する遺伝子を探したところ、「シュガー キナーゼ、リボキナーゼ」/「PfkB ドメイン タンパク質」(rbsK) と注釈が付けられた遺伝子が 8 つのケースすべてで R15P イソメラーゼ ホモログとオペロンを形成していることがわかりました。 「ウリジンホスホリラーゼ」（ウルドパーゼ）遺伝子は6つのケースでオペロンを形成しました（図3）。 R15P イソメラーゼ相同体は持つが、Rubisco および NMP ホスホリラーゼ相同体は持たない 19 のゲノムのうち、Halorhabdus tiamatea を除くすべてのゲノムが、rbsK とウルドパーゼ相同体の両方を持ちます (表 1、VNG_1851G/VNG_1850G 列)。 これは、2 つの遺伝子産物が R15P イソメラーゼと代謝的に関連していることを示唆しました。

関連する遺伝子のカラーコードを図に示します。 白と灰色の矢印のボックスは、注目した 5 つの遺伝子とともにオペロンを形成する可能性が最も高い遺伝子です。 灰色の矢印のボックスでは、遺伝子の長さは各矢印ボックスの幅に反映されていません。 黒い矢印は予測されたオペロンを示します。

H. salinarum、H. turkmenica、および H. xanaduensis 由来の組換え RbsK タンパク質 (それぞれ VNG_1851G、Htur_0569、および Halxa_1682 によってコードされる Hs-RbsK、Ht-RbsK、および Hx-RbsK) を大腸菌で生成しました。 Hs-RbsK は封入体を形成しており、Ht-RbsK 遺伝子の発現レベルは低かった。 十分な量の可溶性 Hx-RbsK タンパク質が得られ、部分的に精製されました（補足図 3a）。 部分精製された Hx-RbsK タンパク質のキナーゼ活性は、ATP またはリン酸供与体としてヌクレオシド三リン酸 (NTP) の混合物を使用して、さまざまなリン酸受容体基質 (補足表 1) に対してテストされました (補足図 4)。 ヌクレオシド、アルドース、アミノ糖、アルコール、ケトース、ヌクレオチド、糖リン酸、二糖類、糖アルコール、デオキシ糖を含む 85 の基質を調べました。 反応時間と酵素量で正規化すると、ヌクレオシド-5'-二リン酸（NDP）の生成はリボース-1-リン酸（R1P）で最も高かった（468 nmol AD​​P min-1 mg-1）。 生成物の形成速度は反応期間全体を通じて必ずしも一定ではないため、これらの測定値を反応速度として指定することは控えます。 次に高い値はキシルロース (62 nmol NDP min-1 mg-1)、続いて 2'-デオキシグアノシン (57 nmol NDP min-1 mg-1)、d-リブロース (49 nmol NDP min-1 mg-1) で観察されました。 1)。 Hx-RbsK 組換えタンパク質は、さらなる生化学分析のために精製されました（補足図 2b）。 R1Pをリン酸受容体として使用すると、酵素はNTPの中でATPを優先しました（補足図5a）。 Hx-RbsK 反応生成物の HPLC 分析により、R15P が R1P から生成されたことが示されました (図 2b)。 さらに、Hx-RbsK生成物であるR15Pは、Ht-R15PイソメラーゼによってRuBPに異性化されました（図2c）。 Hx-RbsKはキナーゼ活性に塩を必要とし、2.0Mが最適なKCl濃度でした（補足図5b）。 4 mM ATP および 20 mM R1P の存在下では、30.1 μmol min-1 mg-1 の比活性が観察されました。 Halxa_1682 タンパク質の分析により、タンパク質 Hx-RbsK が R15P イソメラーゼの基質を生成する ATP 依存性リボース-1-リン酸キナーゼ (ATP-R1PK) であることが示されました。

好塩性古細菌のほぼすべてのゲノムには、ウリジン ホスホリラーゼとして注釈が付けられた 2 つのタンパク質が含まれています (表 1、VNG_1850G/VNG_0893G 列)。 一部の種では、VNG_1850G ホモログは R15P イソメラーゼおよび ATP-R1PK 遺伝子とともにオペロンを形成しますが、VNG_0893G ホモログの位置はオペロンと関連していません。 ここでは前者を Urdpase1、後者を Urdpase2 と呼びます。 それらは系統発生的に区別することができ（補足図6）、それらの機能および/または酵素特性が異なることを示唆しています。 この研究では、Urdpase1 タンパク質が研究されました。 Urdpase1 はヌクレオシド ホスホリラーゼ反応を触媒し、ATP-R1PK の基質である R1P を生成すると考えられていましたが、どのヌクレオシドがこの酵素によって認識されるかは不明でした。

H. salinarum、H. xanaduensis、H. lacusprofundi、および H. turkmenica からの 4 つの Urdpase1 組換えタンパク質 (それぞれ、VNG_1850G、Halxa_1684、Hlac_2318、および Htur_0567 によってコードされる Hs-、Hx-、Hl-、および Ht-Urdpase1) を調製しました。大腸菌を使って。 Hl-Urdpase1 と Ht-Urdpase1 は可溶性タンパク質として得られ、他の 2 つは封入体を形成しました。 Hl-Urdpase1組換えタンパク質は、見かけ上均一になるまで精製されました（補足図2c）。 精製されたHl-Urdpase1のヌクレオシドホスホリラーゼ活性を、6つのヌクレオシド、アデノシン、イノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、およびチミジンに対して調べました（図4aおよび補足図7）。 Hl-Urdpase1 はグアノシンに対して最も高い活性を示し、アデノシンとイノシンは低い程度で認識できました。 驚くべきことに、KCl濃度が高くなると活性は低くなりました（補足図8a）。 しかし、この酵素は 2 ～ 4 M KCl でもかなりのグアノシン ホスホリラーゼ活性を保持しました。 酵素の最適反応温度とpHは、それぞれ30℃と7.5でした（補足図8b、c）。 グアノシンおよびリン酸に対する速度論的分析により、速度論パラメータ Vmax および Km は、グアノシンに対して 1.5 ± 0.1 μmol min-1 mg-1 および 56 ± 10 μM (補足図 9a)、および 2.1 ± 0.1 μmol min-1 mg-1 であることが明らかになりました。リン酸塩に対してそれぞれ4.8±0.8mM（補足図9b）。 この結果は、Hlac_2318 がグアノシン ホスホリラーゼをコードしていることを示唆しています。 グアノシンホスホリラーゼ、ATP-R1PK、およびR15Pイソメラーゼの同定は、グアノシン、リン酸、ATPをR1PおよびR15Pを介してRuBP、グアニン、ADPに変換する代謝経路の存在を示唆しました（図1b）。 R1P キナーゼのリン酸供与体は ATP ですが、グアノシンから RuBP への代謝経路は、Thermococcus で同定されているペントース二リン酸経路の代謝経路に対応しています 13。

放出された核酸塩基をHPLCで定量することにより、Hl-Urdpase1のヌクレオシドホスホリラーゼ活性を6つのヌクレオシドに対して分析しました。 b Hx-HADヒドロラーゼのホスファターゼ活性は、放出されたリン酸をマラカイトグリーンで定量することにより、11個の糖リン酸およびpNPPに対して調査されました。 G1P グルコース-1-リン酸、G6P グルコース-6-リン酸、G16P グルコース-1,6-二リン酸、F1P フルクトース-1-リン酸、F6P フルクトース-6-リン酸、F16P フルクトース-1,6-二リン酸、R5P リボース-5 -リン酸、Ru5P リブロース-5-リン酸、pNPP p-ニトロフェニルリン酸。 c DHAPと6つのアルデヒドを縮合したHx-FucAのアルドラーゼ活性を、カップリング酵素との反応後の残留DHAPを定量することによって調べました。 活性は、n = 3 の独立した実験から計算されました。 エラーバーは標準偏差を示します。

R15P イソメラーゼを除けば、Rubisco は基質として RuBP を利用することが知られている唯一の酵素です。 ルビスコを持たない好塩性古細菌においてRuBPを生成する代謝経路の存在は、RuBPの変換に関与する未確認の酵素の存在を示唆した。 私たちは、系統解析とともに比較ゲノミクスアプローチを採用し、この代謝に関与している可能性のある酵素を特定しました。 私たちは、フクロース-1-リン酸アルドラーゼ（fucA）として注釈が付けられた遺伝子が、独立したR15Pイソメラーゼを保有する19個の好塩性古細菌のうち17個に特異的に存在することを発見しました。 FucA ホモログは好塩性古細菌に広く分布していますが、R15P イソメラーゼの発生との関係は容易には明らかではありません。 ただし、系統解析（補足図10）により、スタンドアロンのR15Pイソメラーゼとの共起を示し（表1、VNG_1201G [7番目の列]、FucAと指定）、他のものと区別できるFucAホモログのグループが明らかになりました（表1、 VNG_1201G [11 番目の列]、FucA* と指定)。 独立した R15P イソメラーゼを保有するが、FucA を保有しない生物は 2 つだけ (H. tiamatea と Halohasta lichfieldiae) でした。 一方で、ハロ酸デハロゲナーゼ（HAD）スーパーファミリー加水分解酵素（HAD加水分解酵素、ハドラーゼ）として注釈が付けられた別の遺伝子も、17種類の好塩菌に特異的に存在することを発見しました（表1、VNG_1202C列）。 さらに、これら 2 つの遺伝子は、17 種類の好塩性古細菌すべてでオペロンを形成します (図 3)。 さらに、Ｈ．ｌａｃｕｓｐｒｏｆｕｎｄｉでは、Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ ｓｐ． PV6、および Halorubrum ezzemoulense、ATP-R1PK、R15P イソメラーゼ、HAD ヒドロラーゼ、および FucA をコードする 4 つの遺伝子は、オペロンを形成します。 fucA とハドラーゼの 2 つの遺伝子は、グアノシン ホスホリラーゼ、ATP-R1PK、および R15P イソメラーゼをコードする 3 つの遺伝子と顕著な共起を示し、これら 5 つのタンパク質が代謝的に関連している可能性が強く高まっています。

我々は、HAD加水分解酵素およびFucAとして注釈が付けられたタンパク質がRuBP代謝に関与している可能性を調べた。 シロイヌナズナ由来のHADスーパーファミリー加水分解酵素は、リボース5-リン酸（R5P）のリボースへのホスファターゼ反応を触媒することが知られている（補足図11a）34。 R5PとRuBPの構造的類似性に基づいて（補足図11a、b）、本発明者らは、この酵素がRuBPホスファターゼ反応を触媒するという仮説を立てた。 H. xanaduensis 由来の HAD ヒドロラーゼ (Halxa_2271) をコードする遺伝子を大腸菌で過剰発現させ、組換えタンパク質 (Hx-HAD ヒドロラーゼ) を見かけの均一性まで精製しました (補足図 2d)。 12 個の糖リン酸に対するホスファターゼ活性を測定しました。 RuBPを基質として使用した場合にのみ顕著なリン酸生成が観察されました（図4b）。これは、この酵素がRuBPに対して厳密な基質特異性を備えたホスファターゼであることを示唆しています。 最適な KCl 濃度は 2.5 M より高く (補足図 12a)、反応の最適 pH は約 6 でした (補足図 12b)。 酵素のカチオン特異性は幅広く、1 mM Mg2+、Mn2+、Co2+、および Ni2+ の存在下でも同様のレベルの活性が検出されました（補足図 12c）。 RuBPに対する速度論的分析（補足図13）により、RuBPに対するVmaxおよびKmがそれぞれ31±2μmol min-1 mg-1および2.2±0.5 mMであることが明らかになりました。 この結果は、HADヒドロラーゼ(Halxa_2271によってコードされる)として注釈が付けられていたこの酵素が、これまで知られていなかった生物学的反応であるRuBPの脱リン酸化を触媒する酵素であることを示唆した。 この酵素を RuBP ホスファターゼと名付けます。

RuBP の脱リン酸化により、リブロース-1-リン酸 (Ru1P)、リブロース-5-リン酸 (Ru5P)、およびリブロースの 3 つの反応生成物が生成されます。 したがって、反応生成物の 1 H-NMR分析を実行しました（補足図14）。 RuBP に由来する化学シフトも検出されましたが、以前のレポート 35 で示された環化 Ru1P に特有の化学シフトが反応生成物で確認されました (補足図 14b、c)。 これは、RuBPホスファターゼがRuBPのC5位のリン酸基の加水分解を触媒し、Ru1Pを生成することを示唆した（図1b）。

古典的な FucA は、フクロース-1-リン酸 (Fu1P) のアルドラーゼ反応を触媒する酵素です。 Fu1Pは、ジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）とL-ラクトアルデヒドに切断されます（補足図11c）。 Ru1P と Fu1P の化学構造は類似しており、違いは C6 メチル基のみにあることに注意しました（補足図 11b、c）。 さらに、我々は、生理学的基質である DHAP および L-ラクトアルデヒドに対する活性レベルが 10% にすぎないにもかかわらず、大腸菌由来のフクロース -1-リン酸アルドラーゼは、大腸菌由来の FucA に対して 33.8% の同一性を示すという事実に注目しました。 H. xanaduensis (Hx-FucA) は、DHAP とグリコールアルデヒドを認識できました 36。 したがって、組換えHx-FucAは大腸菌を使用して調製され、見かけ上均一になるまで精製されました（補足図2e）。 Ru1P は市販されていないため、残留 DHAP を定量することにより、Hx-FucA が DHAP とアルデヒドを縮合するアルドラーゼ反応を触媒できるかどうかを調べました。 試験したアルデヒドは、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、イソブチルアルデヒド、dl-グリセルアルデヒド、dl-ラクトアルデヒド、およびグリコールアルデヒドでした（補足図15）。 このタンパク質は、DHAPおよび試験したすべてのアルデヒドに対してアルドラーゼ活性を示しました（図4c）。 この結果は、この酵素の基質特異性は広いにもかかわらず、Ru1P を DHAP とグリコールアルデヒドに切断するアルドラーゼ反応を触媒できることを示唆しました。 HPLCを使用して、Hx-FucAとDHAPおよびグリコールアルデヒドとの反応生成物が、RuBPホスファターゼ反応生成物の溶出時間と同一の溶出時間を示すことをさらに確認した（補足図16a）。 反応混合物に ZnCl2 を添加すると活性の増加が観察されましたが、EDTA を添加すると減少が観察され、酵素が亜鉛カチオンに依存していることを示唆しています（補足図17）。 さらに、Hx-RuBP ホスファターゼと Hx-FucA タンパク質が一緒になって RuBP から DHAP を生成できるかどうかを調べました。 両方のタンパク質が反応混合物中に存在する場合にのみ、DHAP が RuBP から生成されました (補足図 16b)。 さらに、酵素の速度論的分析により、グリコールアルデヒドに対する Vmax と Km はそれぞれ 2.0 ± 0.0 μmol min-1 mg-1 と 3.4 ± 0.3 mM であり（補足図 18a）、DHAP に対する Vmax と Km は 2.0 ± 0.0 μmol min-1 であることが明らかになりました。それぞれ 1 mg-1 および 3.5 ± 0.3 mM (補足図 18b)。 これらの結果に基づいて、Halxa_2272によってコードされ、FucAとして注釈が付けられていたタンパク質は、DHAPおよびグリコールアルデヒドを含むさまざまなアルデヒドを認識するRu1Pアルドラーゼであると結論付けられます。

ここで得られた結果に基づいて、スタンドアロンのR15Pイソメラーゼは、グアノシンのリボース部分をグリコールアルデヒドとDHAPに変換するこれまで未確認のヌクレオシド代謝経路の構成要素であると提案します（図1b）。 この経路にはルビスコが関与していないため、ここではこの経路を非カルボキシル化ペントース二リン酸経路と名付けます。

DHAP は中枢糖代謝によって代謝されますが、グリコールアルデヒドの運命はまだ不明でした。 しかし、ゲノム情報からグリコールアルデヒドを代謝する候補酵素を特定することはできませんでした。 グリコールアルデヒドを変換する可能性がある H. salinarum 無細胞抽出物中の酵素活性を測定したところ、NADH を電子供与体として使用してグリコールアルデヒドに対する還元活性を検出することができました。

ヌクレオシドとともに培養されたH. salinarumの無細胞抽出物から、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性を示すタンパク質を見かけの均一性まで精製しました（補足図2f）。 液体クロマトグラフィー質量分析 (LC-MS) 分析により、精製されたタンパク質は、sn-グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼとして注釈が付けられた VNG_6270G 遺伝子の産物であることが示されました。 酵素分析により、最適な KCl 濃度は 4 M より高く、最適な反応温度と pH はそれぞれ 40 °C と ~6 であることが明らかになりました (補足図 19)。 グリコールアルデヒドに対する速度論的分析(補足図20a)は、酵素が基質阻害を受けることを示した。 Vmax、Ks1、およびKs2の値は、それぞれ33±4μmol min-1 mg-1、10±2 mM、および35±8 mMでした。 元の注釈を考慮して、タンパク質がsn-グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼ反応を触媒するかどうかをさらに調べました（補足図20b）。 精製された酵素は、グリセロール-1-リン酸の酸化や DHAP の還元に対して顕著なレベルの活性を示さなかった。 さらに、組換えVNG_6270Gタンパク質は大腸菌を使用して調製され、部分的に精製されました（補足図3b）。 予想どおり、組換えタンパク質 (Hs-GaR) は高レベルのグリコールアルデヒド レダクターゼ活性 (40.7 ± 0.4 μmol min-1 mg-1) を示しました。

sn-グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼは、DHAPをグリセロール-1-リン酸に還元することによって古細菌の膜脂質前駆体の生合成に寄与すると推定されているため、この酵素はすべての古細菌に必須であると考えられます。 しかし、我々は、H. salinarum (VNG_0406C) を含むすべての好塩性古細菌に分布する sn-グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼという注釈が付けられた別の遺伝子を発見しました (表 1、VNG_0406C 列)。 Methanothermobacter thermaautotrophicus 由来の特徴付けられた古細菌グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼ 37,38,39 は、VNG_6270G タンパク質 (22.5% 同一) よりも VNG_0406C タンパク質 (50.7% 同一) と高い類似性を示します。 これは、VNG_6270G遺伝子がsn-グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼではなくグリコールアルデヒドレダクターゼをコードしていること（図1b）、そして本物のsn-グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼをコードしている遺伝子はVNG_0406Cである可能性が最も高いことを示唆しています。

VNG_6270G 遺伝子ホモログの分布 (表 1、VNG_6270G 列) に関しては、それらの分布はわずか 10 個の好塩性古細菌に限定されており、H. salinarum のホモログはプラスミド上にコードされています。 半分は非カルボキシル化ペントース二リン酸経路を形成する完全な遺伝子セットを持っていますが、残りの半分は持っていません。 ゲノム解析で配列が見落とされたプラスミドが存在する可能性は排除できなかったが、好塩性古細菌におけるヌクレオシド分解に対する VNG_6270G ホモログの寄与は限られている可能性があり、グリコールアルデヒド代謝には他の経路が存在する可能性がある。

上記の生化学分析には、さまざまな種の好塩性古細菌の酵素が含まれます。 提案された経路が単一種に存在することを確認するために、H. salinarum の無細胞抽出物の酵素活性を調べました。 無細胞抽出液を含む反応液に各基質を添加すると、グアノシンホスホリラーゼ（R1P）、ATP依存性R1Pキナーゼ（R15P）、RuBPホスファターゼ（Ru1P）、グリコールアルデヒドレダクターゼ（エチレングリコール）の反応生成物が検出されました（補足図21a、b、d、f)。 一方、R15P を反応混合物に添加した場合、R15P イソメラーゼの生成物である RuBP は検出できませんでした。 ただし、RuBP の代わりに、Ru1P の生成を観察できました (補足図 21c)。 この結果は、R15P イソメラーゼによって R15P から生成された RuBP が、その後 RuBP ホスファターゼによって Ru1P に変換されたことを示唆しました。 Ru1P は市販されていないため、Ru1P アルドラーゼ活性を確認するために、RuBP ホスファターゼと Ru1P アルドラーゼによって触媒されるカップリング反応を調べました。 その結果、RuBPおよびZnCl2を添加すると、Ru1PアルドラーゼによってRu1Pから生成されると推定されるDHAPが明確に検出された（補足図21e）。 6 つの遺伝子によってコードされる酵素の予測活性は H. salinarum で検出可能であり、この生物に非カルボキシル化ペントース二リン酸経路が存在することが示唆されました。

この研究の結果に基づいて、好塩性古細菌におけるこれまで認識されていなかったヌクレオシド分解経路である非カルボキシル化ペントース二リン酸経路を提案します（図1b）。 R15P を介したグアノシンから RuBP への代謝は、サーモコッカー目のペントース二リン酸経路の代謝と似ていますが、下流の経路は独特です。 この経路の生理学的役割は、ヌクレオシドのリボース部分を DHAP とエチレングリコールに変換することであると推測できます。 DHAP は、グリセルアルデヒド 3-リン酸を介したピルビン酸への酸化、糖新生、膜脂質生合成やオスモライト生成に利用するためのグリセロールへの変換など、さまざまな代謝に利用できます。 一方、エチレングリコールの代謝運命はまだ不明であり、細胞がペントースに由来する2つの炭素を利用するかどうか、またどのように利用するかを理解するにはさらなる調査が必要である。

我々の結果と遺伝子ホモログの分布は、好塩性古細菌におけるヌクレオシド分解経路の複数のバリエーションの存在を示唆しており、そのすべてにペントース二リン酸 R15P と RuBP が関与しています。 好塩性古細菌で見られるヌクレオシド分解経路に共通する特徴の 1 つは、サーモコッカー目で見られる ADP-R1PK が、この研究で同定された ATP-R1PK に置き換えられていることです (図 1 および 5)。 表 1 に示すように、ゲノム配列が決定されている 63 種の好塩性古細菌のうち、44 種がゲノム上に R15P イソメラーゼ相同体を保持しており、これらの生物においてペントース二リン酸 R15P および RuBP が関与する代謝が存在することが示唆されています。 このうち 25 種が RuBP の代謝に Rubisco を利用していると考えられます。 この研究で同定された非カルボキシル化ペントース二リン酸経路は、RuBP ホスファターゼと Ru1P アルドラーゼを利用しており、17 種の好塩菌種に存在し、また広く分布しています。 R15P イソメラーゼを持つ残りの 2 種には、Rubisco も RuBP ホスファターゼ/Ru1P アルドラーゼも含まれていません。 NMP ホスホリラーゼに関しては、ホモログは Rubisco を持つ種でのみ見つかります。 ルビスコを含む 25 種のうち、14 種は NMP ホスホリラーゼ相同体を保持していますが、11 種は持っていません。 したがって、好塩菌のペントース二リン酸経路には 3 つの主要なバリエーションがあり、表 1 に示した 63 種のうち 42 種を占めているようです。 (i) Thermococcales のメンバーで見られるように、Rubisco と NMP ホスホリラーゼを含むもの (図 5a)、(ii) Rubisco を含むが NMP ホスホリラーゼを含まないもの (図 5b)、および (iii) 同定された非カルボキシル化ペントース二リン酸経路この研究では (図 1b および 5c)。 好塩性古細菌間のこれらの変異の分布は、それらの起源生物の系統関係とは関連していません（図6）。 興味深いことに、ヌクレオシド ホスホリラーゼおよび ATP-R1PK に対応する一連の相同体を保有する種がまだ 10 種存在しており (表 1、VNG_1851G/VNG_1850G 列の黄色)、これらはヌクレオシドのリボース部分を R15P に変換すると考えられます。 このことは、好塩性古細菌にはペントース二リン酸が関与するヌクレオシド分解経路のさらに多くのバリエーションが存在する可能性を高めています。

この研究で得られた結果と関連遺伝子の分布は、好塩性古細菌において 3 種類のヌクレオシド分解経路が存在することを示唆しています。 3 つの代謝経路は、NMP ホスホリラーゼと Rubisco を使用する (a)、Rubisco を使用するが NMP ホスホリラーゼを使用しない (b)、Rubisco または NMP ホスホリラーゼを使用しないが RuBP ホスファターゼと Ru1P アルドラーゼを使用する (c) です。

系統樹は、16S rRNA 遺伝子配列を使用して構築されました。 Thermoplasma volcanium (tvo) からの配列をアウトグループとして使用しました。 円の色は図 5 のヌクレオシド代謝経路の色に対応しています。赤とピンクのコードで示された生物は、図 3 に示した好塩性古細菌を示します。赤のコードで示された生物は、今回の研究で実際にタンパク質を調べた生物を示します。 。

上で示したように、ゲノム配列からカルボキシル化/非カルボキシル化ペントース二リン酸経路の欠如が示唆されている好塩性種が 21 種あります。 その中で、Halorhabdus utahensis と Halorhabdus tiamatea は細菌や真核生物に見られる古典的な NOPP 経路のホモログを保有しており、NOPP 経路はこれらの種のヌクレオシド分解に関与している可能性があります。 しかし、ゲノム配列がヌクレオシド分解をどのように実行するのかについて何の手がかりも提供していない好塩性古細菌がまだ 19 種類存在します。 これらの種がヌクレオシドを利用しない可能性を排除することはできませんが、この研究では Ru1P アルドラーゼとして同定されたものとは異なる FucA* ホモログに注目しました (表 1、最後の列)。 このホモログは、Haloarcula、Haloplanus、Halohasta の 9 種を含むこれらの好塩性生物で発生する傾向があり、ヌクレオシドまたはペントースの代謝に関与する追加の経路を特定する手がかりを提供する可能性があります。

組換え H1-Urdpase1 の分析により、この酵素がホスホリラーゼ反応のヌクレオシド基質としてグアノシンを好むことが示されました。 興味深いことに、この酵素 (Hlac_2318) は、T. コダカレンシスにおいて、グアノシン ホスホリラーゼ (TK1482) (18.7% 同一) よりもウリジン ホスホリラーゼ (TK1479) (40.2% 同一) とより高い類似性を示します。 グアノシン ホスホリラーゼに加えて、ほとんどすべての好塩性古細菌は 2 番目のウリジン ホスホリラーゼ ホモログである Urdpase2 を保有しています。 これらの 2 番目のホモログはペントース二リン酸経路の遺伝子とオペロンを形成しませんが、遺伝子産物もヌクレオシドリン酸分解を介して R1P を生成する可能性が高くなります。 系統解析により、Urdpase1 と Urdpase2 が異なることが明確に明らかになり (補足図 6)、2 つのサブグループのメンバーの酵素特性が互いに異なることを示唆しています。 Urdpase2 のヌクレオシド基質を同定することで、好塩性古細菌におけるヌクレオシド分解の理解が深まるでしょう。 興味深いことに、2 つのヌクレオシド ホスホリラーゼ遺伝子のうちの 1 つであるグアノシン ホスホリラーゼ遺伝子だけが、非カルボキシル化ペントース二リン酸経路の遺伝子とオペロンを形成しています。 これは、H. salinarum などの好塩性古細菌のゲノムにおける GC 含量の高さ (67.9%) に関連している可能性があります 30。 グアニンおよびシトシンを含むヌクレオシド/ヌクレオチドは、これらの細胞内でより高い濃度で維持される可能性があります。

以前の研究では 2 つの R1P キナーゼが同定されています。 超好熱性古細菌 T. kodamarensis 由来の ADP 依存性 R1P キナーゼ (TK2029) と超好熱性古細菌 Pyrobaculum calidifontis 由来の ATP 依存性 R1P キナーゼ (Pcal_0041)。 この研究で同定された ATP 依存性 R1P キナーゼ (Halxa_1682) は、TK2029 タンパク質と 25% 同一であり、Pcal_0041 タンパク質と 36.8% 同一でした。 3 つの酵素の特性を比較すると、T. kodamarensis の R1P キナーゼは ADP 依存性ですが、P. calidifontis および H. xanaduensis/H. の酵素は ADP 依存性です。 サリナルムはATP依存性です。 一方、T. kodamarensis および H. xanaduensis の酵素は R1P に対して厳密な基質特異性を示しますが、P. calidifontis の R1P キナーゼは R1P29 に加えてシチジンおよびウリジンを認識できます。 R15P イソメラーゼも NMP ホスホリラーゼ遺伝子ホモログも P. calidifontis には存在せず、上記のヌクレオシド ホスホリラーゼと ATP-R1PK ホモログのみを持つ 10 種類の好塩性古細菌の場合に似ています。 一方で、大腸菌における R1P キナーゼの存在が示唆されています 40。 5-ホスホ-D-リボシル-1-二リン酸（PRPP）シンターゼ遺伝子の欠失を抑制できる酵素/遺伝子の検討により、R5P→R1P→R15P→PRPPという反応順序を持つ経路が提案されました。 R15P に対してキナーゼ活性を示し、PRPP の生成を引き起こす、phnN によってコードされるタンパク質が同定されました。 提案されている 2 番目の反応に関与するタンパク質は、未確認ではありますが、R1P キナーゼと考えられます。 大腸菌は、R1P キナーゼ活性を示す古細菌タンパク質との類似性を示すいくつかの酵素を持っています。 これらには機能が解明されていないタンパク質も含まれているため、その中にはR1Pキナーゼも含まれる可能性があります。 R1P キナーゼとその産物である R15P は、これまでの予想よりも古細菌や細菌を通じて広く分布している可能性があります。

特に明記しない限り、化学試薬はナカライテスク（日本、京都）、富士フイルム和光純薬（日本、大阪）、またはメルク（ドイツ、ダルムシュタット）から購入しました。 この研究で使用した株とプラスミドを補足表2に示します。好塩性古細菌ハロバクテリウム・サリナルムとそのゲノムDNAは、日本の文部科学省/AMEDのナショナルバイオリソースプロジェクトを通じて理化学研究所バイオリソース研究センターから提供されました。 H. salinarum は、塩化ナトリウム 250 g l-1、MgSO4・7H2O 20 g l-1、クエン酸三ナトリウム 3 g l-1、塩化カリウム 2 g l-1、トリプトン 5 g l-1、および 3 g l−1 酵母エキス (この研究では高塩培地と定義)。 必要に応じて、ヌクレオシドを培地に添加した。 プラスミド構築に使用した大腸菌 DH5α 株と、遺伝子発現に使用した大腸菌 BL21 CodonPlus(DE3)-RIL および Rosetta (DE3) 株を、アンピシリン (100 mg l-1) を含む溶原性ブロス (LB) 培地中で 37 °C で培養しました。 ）。

Hs-R15PイソメラーゼおよびHs-Urdpase1をコードする遺伝子を発現するプラスミドを以下のように構築した。 Hs-R15PイソメラーゼおよびHs-Urdpase1遺伝子のコード領域を、H. salinarum由来のゲノムDNAを鋳型として、expHs-R15Pi-F/-RおよびHs-Urdpase1-F/-Rをプライマーセットとしてそれぞれ使用してPCRによって増幅した。 プライマーは、増幅された DNA 断片の 5' 末端と 3' 末端にそれぞれ NdeI および BamHI 制限部位が導入されるように設計されました。 これらのプライマーの配列を補足表 3 に示します。NdeI および BamHI で消化した後、DNA 断片を同じ制限酵素で消化した pET-21a(+) と個別にライゲーションしました。 得られた発現プラスミドは、pET-Hs-R15PイソメラーゼおよびpET-Hs-Urdpase1と呼ばれます（補足表2）。

Ht-R15P イソメラーゼ、Hs-RbsK、Ht-RbsK、Hx-RbsK、Ht-Urdpase1、Hx-Urdpase1、Hl-Urdpase1、Hx-HAD ヒドロラーゼ、Hx-FucA、および Hs-GaR をコードする遺伝子の発現プラスミド（補足表） ２）以下のように調製した。 遺伝子は、その GC 含量を減少させ、コドンを最適化して大腸菌における遺伝子発現を増強するように設計および合成されました (Integrated DNA Technologies、アイオワ州コーラルビル)。 それぞれ5'末端と3'末端にNdeIおよびBamHI部位を有する設計遺伝子をNdeIおよびBamHIで消化し、同じ制限酵素で消化したpET-21a(+)と連結した。 上記の 2 つのプラスミドを使用して得られた 10 個の発現プラスミドすべて (補足表 2) について、DNA 配列分析を実行し、意図しない突然変異がないことを確認しました。 各遺伝子の設計された配列を補足図22に示します。

構築した発現プラスミドを大腸菌ロゼッタ（DE3）（R15Pイソメラーゼ、RbsK、HAD加水分解酵素、FucAをコードする遺伝子の場合）または大腸菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL（Urdpase1およびGaRをコードする遺伝子の場合）に導入しました。 形質転換体を OD660 が 0.4 ～ 0.8 に達するまで 37 °C で培養し、イソプロピル-β-d-チオガラクトピラノシド (IPTG) を最終濃度 0.1 mM で添加することによって遺伝子発現を誘導しました。 さらに 37 °C で 4 時間培養した後、細胞を回収しました。

Hs-GaR、Ht-R15Pイソメラーゼ、Hx-RbsK、およびHx-FucA組換えタンパク質を発現する細胞を50 mM Tris-HCl (pH 7.5)で再懸濁し、超音波処理により破壊した。 遠心分離 (5000 x g、15 分、4 °C) 後、上清を 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) で平衡化した陰イオン交換カラム (Resource Q、GE Healthcare、Little Chalfont、バッキンガムシャー、英国) にアプライしました。 タンパク質は、50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 中の NaCl の直線勾配 (0 ～ 1.0 M) で溶出しました。 GaR 以外の 3 つのタンパク質については、関連する画分のバッファーを 2 M NaCl を含むリン酸ナトリウムバッファーに変更し、次の条件で平衡化したセラミック ハイドロキシアパタイト アフィニティー カラム (Bio-Scale CHT 10-1、Bio-Rad、カリフォルニア州ハーキュリーズ) に適用しました。 2 M NaCl を含む 7 mM リン酸ナトリウム (pH 7.5)。 タンパク質は、2M NaCl中のリン酸ナトリウムの直線勾配(7～280mM)で溶出されました。 関連する画分を収集し、２Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で平衡化したゲル濾過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でさらに精製した。 同じ緩衝液を移動相として使用した。 Hs-GaRについては、陰イオン交換クロマトグラフィー後の関連画分を、2M KClを含む50mM Tris-HCl(pH7.5)で平衡化したゲル濾過カラムに適用した。

Hl-Urdpase1 および Hx-HAD ヒドロラーゼ組換えタンパク質は、Bio-Scale CHT 10-1 および Superdex200 を使用して精製されました。 Hl-Urdpase1およびHx-HADヒドロラーゼタンパク質を産生する細胞を、それぞれ2M NaClを含む5mMおよび7mMリン酸ナトリウム(pH7.5)に再懸濁し、超音波処理により破壊した。 遠心分離後、上清を細胞懸濁液に使用したのと同じ緩衝液で平衡化した Bio-Scale CHT 10-1 に適用しました。 Ｈ１－Ｕｒｄｐａｓｅ１およびＨｘ－ＨＡＤヒドロラーゼを、２Ｍ ＮａＣｌ中のリン酸ナトリウムの直線勾配（それぞれ５～５００ｍＭおよび７～２８０ｍＭ）で溶出した。 Hl-Urdpase1およびHx-HADヒドロラーゼを、それぞれ使用した緩衝液を用いて、2M KClを含む50mMリン酸ナトリウム(pH7.5)および2M KClを含む50mM Tris-HCl(pH7.5)で平衡化したSuperdex200カラムを用いてさらに精製した。移動相として。

精製酵素の濃度は、ウシ血清アルブミン (BSA) (Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA) を標準として、Protein Assay System (Bio-Rad) で測定しました。 タンパク質の均一性は、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) によって確認されました。

H. salinarum を、4 つのヌクレオシド (アデノシン、ウリジン、グアノシン、およびシチジン: 各 0.5 mM) を補充した 200 ml の高塩培地中で培養しました。 細胞密度（OD660）が0.7に達した後、細胞を採取し、2M KClを含む5mMリン酸ナトリウム（pH7.5）5mlで再懸濁し、超音波処理により破壊した。 遠心分離 (5000 x g、15 分、4 °C) 後、上清を 2 M KCl を含む 5 mM リン酸ナトリウム (pH 7.5) で平衡化した Bio-Scale CHT 10-1 カラムにアプライしました。 タンパク質は、2 M KCl中のリン酸ナトリウムの直線勾配(5～500 mM)で溶出されました。 グリコールアルデヒドレダクターゼ活性を示す画分を収集した。 ２Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを用いてさらなる精製を行った。 同じ緩衝液を移動相として使用した。 タンパク質濃度を上記のように決定した。

グリコールアルデヒド還元酵素活性を示す精製タンパク質のアミノ酸配列をLC-MS分析により同定した。 SDS-PAGEで分離した後、銀染色でタンパク質を染色しました。 標的タンパク質を含むゲル部分を切り出し、Silver Stain MS Kit で脱色しました。 ゲル内のタンパク質を還元、アルキル化し、トリプシンで消化し、In-Gel Tryptic Digestion Kit (Thermo Fisher Scientific) を使用して抽出しました。 トリプシン消化ペプチドを、LTQ-Orbitrap XL ハイブリッド質量分析計 (Thermo Fisher Scientific) を使用して、ナノフロー逆相液体クロマトグラフィーとその後のタンデム MS によって分析しました。 サンプルは、ペプチドを脱塩および濃縮するためのインジェクターバルブに取り付けられたペプチド L トラップカラム OSD (5 μm; AMR、東京、日本) に PAL システム (CTC アナリティクス、スイス、ツヴィンゲン) を使用して自動的に注入されました。 0.1% TFA 酸と 2% アセトニトリルを含む MS グレードの水 (溶媒 C) でトラップを洗浄した後、ペプチドをナノ HPLC キャピラリー カラム (ゲル粒子サイズ 3 μm、0.1 × 150 mm で充填された C18;日京テクノス、東京、日本）。 溶離液は、A、0.5% 酢酸塩を含む 100% 水、B、0.5% 酢酸塩を含む 80% アセトニトリルでした。 カラム内でアセトニトリルの濃度勾配を増加させました。60 分で 5% B から 45% B、1 分で 45% B から 95% B、95% B を 19 分間維持、95% B から 5% B 1 分間で平衡化し、最後に 5% B で 9 分間再平衡化します。 アセトニトリルの濃度勾配を用いて、流量を200 nl min-1から500 nl min-1に加速しました。 Xcalibur 2.1 システム (Thermo Fisher Scientific) を使用して、m/z 350 ～ 1500 の質量範囲内のペプチド スペクトルを分析し、m/z 150 ～ 2000 の質量範囲内の情報依存データ収集で MS/MS スペクトルを分析しました。 断片化は衝突誘起解離 (CID) によって実行されました。 MS/MS 実験には、良好な断片化特性を持つ複数の荷電ペプチドが選択されました。 MS/MS スペクトルを解釈し、Proteome Discoverer 1.4 および 2.0 (Thermo Fisher Scientific) を使用してピーク リストを作成しました。 遺伝子検索はSEQUEST-HT（Thermo Fisher Scientific）を用いて行った。

R15P イソメラーゼ活性は、基質としてリボース-1,5-二リン酸 (R15P) を使用し、生成物 RuBP を HPLC で検出して調べました。 反応混合物 (100 μl) は、50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、5 mM R15P (東京化成工業、東京、日本)、10 mM MgCl2、1.84 M KCl、および 2 または 3 μg の精製組換え体で構成されました。 Ht-R15P イソメラーゼタンパク質。 R15Pを含まない反応混合物を47℃で3分間プレインキュベートした。 反応は、R15P の添加によって開始され、47 °C で 15 分間実行され、氷上で急速に冷却し、Amicon Ultra-0.5 遠心分離フィルター ユニット (MWCO: 10 K) (EMD Millipore) を使用した限外濾過によって酵素を除去することによって停止しました。 、マサチューセッツ州ビレリカ）。 反応生成物を、Asahipak NH2P-50 4E カラム (Shodex、東京、日本) を使用し、移動相として 300 mM リン酸ナトリウム (pH 4.4) を使用する HPLC によって分析しました。 溶出された化合物は示差屈折率検出器で監視されました。 LC-10A または Nexera X2 システム (島津製作所、京都、日本) で測定した HPLC クロマトグラム データは、LCsolution 1.22 SP1 または LabSolutions 5.57 を使用して収集しました。

Hx-RbsK のキナーゼ活性は、共役酵素であるピルビン酸キナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼ (PK/LDH) により NTP から生成される NDP の量を定量することによって測定されました。 PK はホスホエノールピルビン酸と NDP をピルビン酸と NTP に変換します。 LDH は、ピルビン酸と NADH の乳酸と NAD+ への変換を触媒します。 生成された NDP は、NADH に由来する 340 nm での吸光度 (A340) の減少を測定することによって計算されました。

Hx-RbsKの活性を測定するために、NDP産生を以下のように調べた。 キナーゼ反応混合物 (100 μl) には、50 mM トリス-HCl と 50 mM ビシン-NaOH (pH 8.3 または 8.4) の混合物、リボース-1-リン酸 (R1P) を含む 25 mM リン酸受容体 (Toronto Research Chemicals Inc.,トロント、カナダ）、NTP（4 mM ATP [ORIENTAL YEAST、東京、日本]、4 mM ATP と各 2 mM GTP/UTP/CTP、各 2 mM ATP/GTP/UTP/CTP/TTP、または 4 mM ATP と各 1.5 mM (GTP/UTP/CTP/TTP)、20 mM MgCl2、1.8 M または 4 M NaCl、および 2、2.5、または 4 μg の部分精製 Hx-RbsK タンパク質。 基質としてテストした 85 個のリン酸受容体と反応条件を補足表 1 にまとめます。 NTP を含まない反応混合物を 42 または 47 °C で 3 分間インキュベートし、NTP の添加によって反応を開始し、15 分間実行しました。 30分、または60分。 氷上で１０分間急冷することにより反応を停止させ、上記のように限外濾過により酵素を除去した。 PK/LDH 反応混合物 (100 μl) は、15 または 50 mM MES-NaOH (pH 6.5)、25 ～ 50 μl のキナーゼ反応混合物、5 または 20 mM ホスホエノールピルビン酸 (PEP)、0.2 mM NADH (ORIENTAL YEAST) で構成されました。 )、PK 5 単位、LDH 7 単位。 カップリング酵素を含まない PK/LDH 反応混合物の A340 を測定しました。 カップリング酵素を添加し、減少が観察されなくなるまで A340 を室温で監視しました。 他に記載がない限り、吸光度は分光光度計、Ultrospec 3000 (GE Healthcare) または Ultrospec 6300 pro (GE Healthcare) を使用して測定しました。 NADH の適用されたモル吸光係数は ε340 nm = 6.22 × 103 M−1 cm−1 でした。 リン酸アクセプター基質を使用せずに反応を実行し、その値をアクセプター基質を使用して得られた値から差し引いた。 生成された NDP の量は、反応時間 (分) とタンパク質の量 (mg) で割ることによって正規化されました。

NTP 特異性を調べる場合、25 mM R1P、4 mM NTP、0.8 M NaCl、1.2 μg の精製タンパク質、および上記のその他の成分の存在下、42 °C で 5 分間反応を実行しました。 R1P に対する比活性を測定するために、20 mM R1P、4 mM ATP、2 M KCl、および上記のその他の成分を含む反応混合物を使用して、反応を 47 °C で 3、4、および 5 分間実行しました。 KCl 依存性を調べるために、NaCl を KCl (0 ～ 3 M) に置き換え、15 mM R1P、4 mM ATP、および上記のその他の成分の存在下で 47 °C で比活性を測定しました。 HPLCによるHx-RbsK反応生成物の分析では、10mM R1P、30mM ATP、2M KCl、1μgの精製タンパク質、および上記の他の成分を100μlの反応混合物に含めた。 反応は47℃で15分間実施した。 氷上で１０分間急冷し、限外濾過してＨｘ－ＲｂｓＫを除去した後、濾液を上記のようにＨＰＬＣで分析した。 Hx-RbsKとHt-R15Pイソメラーゼの共役反応のために、濾液の50μlアリコートを、5mM AMPを含み、R15Pを含まないHt-R15Pイソメラーゼ反応混合物に添加した。 47℃で3分間インキュベートした後、反応を開始し、15分間実行した。 ＲｕＢＰの形成は、上記のようにＨＰＬＣによって検出された。

H1-Urdpase1のヌクレオシドホスホリラーゼ活性は、放出された核酸塩基をHPLCで定量することによって測定した。 特に記載のない限り、反応混合物 (100 μl) には、50 mM リン酸ナトリウム (pH 7.5)、2 mM ヌクレオシド (アデノシン、イノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、またはチミジン)、2 M KCl、および 1 μg の精製酵素が含まれていました。 ヌクレオシドを含まない反応混合物を37℃で3分間インキュベートした後、ヌクレオシドを添加することによって反応を開始した。 37℃でさまざまな時間インキュベートした後、氷上で20分間急冷することによって反応を停止し、上記のように限外濾過によって酵素を除去した。 ＨＰＬＣの場合、等量の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、２０％メタノール溶液を濾液に添加した。 反応生成物は、20 mM リン酸ナトリウム (pH 7.5)、10% メタノールで平衡化した COSMOSIL 5C18-PAQ 充填カラム (4.6 ID x 250 mm、ナカライテスク) を使用し、温度 40 °C で HPLC によって分析しました。 放出された核酸塩基は、260 nm での UV 吸光度によって検出されました。 アデノシン、アデニン、イノシン、ヒポキサンチン、グアノシン、グアニン、ウリジン、ウラシル、シチジン、シトシン、チミジン、およびチミンを標準化合物として利用して、標準曲線を作成した。

一般的な酵素特性を決定するには、KCl 濃度 (0 ～ 4 M)、反応温度 (20 ～ 90 °C)、反応 pH (pH 2.0 ～ 5.0 の場合はリン酸ナトリウム緩衝液、pH 5.5 ～ 7.0 の場合は MES-NaOH 緩衝液、HEPES) を変化させます。 -NaOH バッファー (pH 7.0 ～ 8.0)、Bicine-NaOH バッファー (pH 8.0 ～ 9.0) をテストしました。 グアノシンに対する動態解析では、さまざまな濃度のグアノシン (0 ～ 1000 μM) を 50 mM リン酸ナトリウム (pH 7.5) および 2 M KCl の存在下、30 °C でテストしました。 リン酸に対する反応速度論的分析は、1 mM グアノシンの存在下、30 °C、2 M KCl でさまざまな濃度のリン酸ナトリウム (0 ～ 32 mM) を使用して実行されました。 酵素のすべての速度論的分析では、カーブフィッティングと Vmax および Km 値の計算を IGOR Pro バージョン 6.03AJ を使用して実行しました。

Hx-HAD 加水分解酵素のホスファターゼ活性は、マラカイト グリーン アッセイで放出されたリン酸塩を定量することによって決定されました。 反応混合物 (100 μl) には、50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、5 mM 糖リン酸、2 M KCl、5 mM MgCl2、および 1 μg の精製 Hx-HAD ヒドロラーゼ組換えタンパク質が含まれていました。 12 個の基質、グルコース-1-リン酸 (G1P)、グルコース-6-リン酸 (G6P)、グルコース-1,6-二リン酸 (G16P)、フルクトース-1-リン酸 (F1P)、フルクトース-6-リン酸 (F6P)、フルクトース-1,6-二リン酸（F16P）、リボース-5-リン酸（R5P）、リボース-1-リン酸（R1P）、リボース-1,5-二リン酸（R15P）、リブロース-5-リン酸（Ru5P）、リブロース-1,5-ビスホスフェート (RuBP) および p-ニトロフェニルホスフェート (pNPP) を調べました。 基質を含まない反応混合物を 37 °C で 5 分間インキュベートした後、基質を添加して反応を開始しました。 10分間のインキュベーション後、氷上で急速に冷却し、上記のように限外濾過によって酵素を除去することによって反応を停止させた。 放出された遊離リン酸塩は、マラカイト グリーン リン酸アッセイ キット (BioAssay Systems、カリフォルニア州ヘイワード) を使用して定量しました。 反応生成物を最終容量80μlとなるように適切に希釈し、その後、20μlの特定の試薬と混合した。 室温で 30 分間インキュベートした後、660 nm での吸光度を分光光度計で測定しました。

一般的な酵素特性を決定する際、50 mM Tris-HCl (pH 7.5) または 50 mM MES (pH 6.1)、10 mM RuBP、2.5 M KCl、5 mM MgCl2、および精製酵素0.5μg。 塩の影響は、KCl 濃度 (1 ～ 3 M) を変えるか、NaCl (3 M) を使用して調べました。 pH の影響は、50 mM 酢酸 (pH 4.4 ～ 5.9)、MES (pH 6.1 ～ 7.4)、または PIPES (pH 7.5 ～ 8.5) を使用して検査されました。 二価金属カチオンの影響は、5 mM MgCl2、CaCl2、MnCl2、CoCl2、NiCl2、または EDTA を使用して検査されました。 RuBP に対する反応速度解析は、50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、さまざまな濃度の RuBP (0 ～ 20 mM)、2 M KCl、5 mM MgCl2、および 0.5 μg の精製酵素を含む 100 μl 反応混合物中で実行されました。 。 5分間のプレインキュベーション後、RuBPを添加することによって反応を開始した。 反応時間は、0.1 ～ 0.5 mM RuBP の場合は 1、3、および 5 分、その他の濃度の反応では 1、4、および 7 分でした。

Hx-FucA のアルドラーゼ活性を、ジヒドロキシアセトンリン酸 (DHAP) およびさまざまなアルデヒドを基質として測定しました。 縮合反応後の残留 DHAP は、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GPDH) を用いて NADH 消費量を測定することにより定量されました。 アルドラーゼ反応混合物 (100 μl) には、50 mM トリス-HCl (pH 8.0)、5 mM DHAP、25 mM アルデヒド (アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、イソブチルアルデヒド、dl-グリセルアルデヒド、dl-ラクトアルデヒド、またはグリコールアルデヒド)、2 M KCl、1 mM ZnCl2、および 4 μg の精製酵素。 アルデヒドを含まない反応混合物を47℃で3分間インキュベートした後、個々のアルデヒドを添加することによって反応を開始した。 さらに 47 °C でインキュベート (3 ～ 20 分) した後、氷上で 5 分間急速冷却して反応を停止し、上記のように限外濾過によって酵素を除去しました。 カップリング反応混合物(100μl)は、50mM Tris-HCl(pH7.5)、第1反応混合物の適切に希釈したアリコート5μl、0.2mM NADH、および1.7単位のGPDHを含んでいた。 GPDH の添加後、減少が観察されなくなるまで A340 を Ultrospec 6300 pro でモニタリングし、消費された NADH の量に基づいて残留 DHAP を定量しました。

Hx-FucA 反応と結合した Hx-HAD 加水分解酵素反応を、RuBP からの DHAP 生成を検出することによって調べました。 反応混合物（１００μｌ）は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＲｕＢＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ ２ 、２Ｍ ＫＣｌ、１ｍＭ ＺｎＣｌ ２ 、Ｈｘ－ＨＡＤ加水分解酵素およびＨｘ－ＦｕｃＡをそれぞれ１μｇ含んでいた。 RuBP を使用せずに 47 °C で 3 分間インキュベートした後、RuBP を添加して反応を開始しました。 3時間のインキュベーション後、氷上で急速に冷却し、限外濾過によって酵素を除去することによって反応を停止させた。 DHAPを定量するための反応混合物(100μl)は、50mM Tris-HCl(pH7.5)、40μlの第1反応混合物、0.3mM NADH、および1.7単位のGPDHを含んでいた。 DHAP産生は上記のように定量化した。

DHAPおよびグリコールアルデヒドに対するHx-FucAタンパク質の速度論的パラメータは以下のように決定した。 反応混合物(100μl)には、50mM Tris-HCl(pH8.0)、基質グリコールアルデヒドおよびDHAP、2M KCl、1mM ZnCl2、および2μgの精製Hx-FucAタンパク質が含まれていた。 さまざまな濃度の DHAP (1 ～ 20 mM) またはグリコールアルデヒド (1 ～ 30 mM) を、一定濃度のグリコールアルデヒド (50 mM) または DHAP (20 mM) でそれぞれテストしました。 47℃で3分間インキュベートした後、DHAPまたはグリコールアルデヒドを添加して反応を開始しました。 12、16、および20分間のインキュベーション後、氷上で5分間急速冷却し、限外濾過カラムでタンパク質を除去することによって反応を停止させた。 生成したRu1Pを、Asahipak NH2P-50 4EカラムおよびUV検出器(200nm)を使用するHPLCによって定量した。 カラムを 300 mM リン酸ナトリウム緩衝液 (pH 4.4) で 40 °C で平衡化し、同じ緩衝液を移動相として使用しました。

Ru1P は市販されていないため、Hx-HAD 加水分解酵素タンパク質を利用して Ru1P を生成し、Ru1P の標準曲線を作成しました。 反応は以下のように行った。 反応混合物 (100 μl) には、50 mM MES-NaOH 緩衝液 (pH 6.0)、10 mM RuBP、2 M KCl、5 mM MgCl2、および 1 μg の Hx-HAD 加水分解酵素タンパク質が含まれていました。 RuBP を使用せずに 37 °C で 5 分間インキュベートした後、RuBP を添加して反応を開始しました。 37℃で5時間インキュベートした後、氷上で5分間急冷して反応を停止し、限外濾過カラムでタンパク質を除去した。 HPLCによりRuBPが完全に消費されたことを確認した後、生成されたRu1Pの濃度を10mMと推定し、これを使用してRu1Pの標準曲線を作成した。

グリコールアルデヒドおよび DHAP に対するレダクターゼ活性は、UV 分光光度計 UV-1800 (島津製作所) で反応混合物中の NADH 消費 (A340) をモニタリングすることによって測定し、データは UVProbe 2.52 で収集しました。 反応混合物 (1 ml) には、50 mM Tris-HCl (pH 7.5) または 50 mM/100 mM MES-NaOH (pH 6.0)、7.5 または 20 mM グリコールアルデヒド/7.5 mM DHAP、0.2 mM NADH、2 M KCl、および精製されたグリコールアルデヒド還元酵素 0.2 または 2 μg。 NADHまたは組換えタンパク質を含まない反応混合物を40℃で1分間インキュベートした後、NADHまたは精製組換えタンパク質をそれぞれ添加することによって反応を開始した。 データ分析は、UVProbe 2.52 ソフトウェアを使用して実行されました。

30 °C での 50 mM MES-NaOH (pH 6.5) 中の KCl 濃度 (0 ～ 4 M)、50 mM MES-NaOH (pH 6.5) と 4 M KCl の反応温度 (20 ～ 90 °C) の影響、およびpH 値 (MES-NaOH [pH 5.5 ～ 7.0]、HEPES-NaOH [7.0 ～ 8.0]、Bicine-NaOH [8.0 ～ 9.0]、40 °C、4 M KCl 存在下) をテストしました。グリコールアルデヒドに対する速度論的パラメーター50 mM MES-NaOH (pH 6.0)、さまざまな濃度のグリコールアルデヒド (0 ～ 70 mM)、0.2 mM NADH、3 M KCl、および精製した 0.2 μg を含む反応混合物 (1 ml) 中で 40 °C で測定しました。酵素。

sn-グリセロール-1-リン酸に対するオキシダーゼ活性を以下のように調べた。 反応混合物（１ｍｌ）には、５０ｍＭ ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）、７．５ｍＭ ｓｎ－グリセロール－１－リン酸、０．２ｍＭ ＮＡＤ＋、２Ｍ ＫＣｌ、および０．２μｇの精製グリコールアルデヒドレダクターゼが含まれていた。 NAD+ を含まない反応混合物を 40 °C で 1 分間インキュベートした後、NAD+ を添加して反応を開始し、NADH 由来の A340 を UV-1800 で測定して DHAP 生成を計算し、データを UVProve 2.52 で収集しました。

Hx-HAD加水分解酵素の反応生成物をNMRにより分析した。 反応混合物 (300 μl) には、100 mM 酢酸アンモニウム (pH 6.65)、10 mM RuBP、2 M KCl、5 mM MgCl2、および 1 μg の精製酵素が含まれていました。 RuBPを含まずに反応混合物を37℃で5分間インキュベートした後、RuBPを添加することによって反応を開始した。 10分間のインキュベーション後、上記のように限外濾過カラムを用いて酵素を除去することにより反応を停止した。 反応生成物を真空乾燥により３回濃縮し、Ｄ２Ｏ（Ｄ、９９．９６％）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州テュークスベリー）で適切に希釈し、１Ｈ−ＮＭＲで分析した。

1H-NMR 測定は、ECA-600 分光計 (JEOL、東京、日本) を使用して 600 MHz、5 °C で実行され、データは Delta 4 で収集されました。 1H-NMR スペクトルは、水の事前飽和を組み込んだパルスシーケンスを使用して取得されました。抑制。 事前飽和電力は 56 dB で、これは水のピークを完全に抑制するために必要な最小値です。 １ Ｈ−ＮＭＲスペクトルの化学シフトは、４．６２ｐｐｍのＤ２Ｏの外部標準を使用して、溶媒のシグナルに対してｐｐｍで与えられた。 得られたNMRデータはAlice2バージョン6で解析しました。

H. salinarum は、2 mM アデノシン、100 mM ウリジン、2 mM グアノシン、および 100 mM シチジンを補充した高塩培地で培養されました。 グアノシンホスホリラーゼ活性を測定する場合、添加されたヌクレオシドに由来するバックグラウンドシグナルを減少させるために、ヌクレオシドなしで細胞を培養しました。 無細胞抽出物は、GaR の精製について記載されているように調製されました。 バックグラウンドピークを減らすために、限外濾過により50 mM リン酸緩衝液（pH 7.5）で8倍に希釈することにより、細胞抽出物中の小分子を減らしました。 反応混合物 (100 μl) には、50 mM リン酸ナトリウム (pH 7.5)、1500 μg の無細胞抽出物、および基質が含まれていました。 基質、その濃度、および反応時間/温度は、グアノシンホスホリラーゼの場合は 1 mM グアノシン (5 時間/40 °C)、R1P キナーゼの場合は 20 mM ATP および 20 mM MgCl2 を含む 40 mM R1P (17 時間/47 °C)、40 R15P イソメラーゼの場合は mM R15P (12 時間/40 °C)、RuBP ホスファターゼの場合は 20 mM RuBP および 20 mM MgCl2 (15 分/40 °C)、Ru1P アルドラーゼの場合は 20 mM MgCl2 および 1 mM ZnCl2 を含む 100 mM RuBP (12 時間) /40 °C)、グリコールアルデヒド還元酵素用の 40 mM グリコールアルデヒドおよび 30 mM NADH (1 時間/40 °C)。 基質を添加する前に、インキュベーションを 3 分間実行しました。 それぞれグアノシン、ATP、R15P、RuBP、RuBP、NADH。 氷上で10分間急速冷却することにより反応を停止させ、限外濾過により酵素を除去した。 反応生成物は、グリコールアルデヒドレダクターゼの場合は COSMOSIL 5C18-PAQ 充填カラムと 40 °C の H2O の移動相を使用し、Asahipak NH2P-50 4E カラムと 40 の 300 mM リン酸ナトリウム (pH 4.4) の移動相を使用して HPLC によって分析しました。他のタンパク質の場合は °C。 生成物 (R1P、R15P、RuBP、Ru1P、DHAP、およびエチレングリコール) は示差屈折率検出器によってモニターされました。 標準化合物は、市販の R1P (10 mM)、R15P (10 mM)、DHAP (5 mM)、およびエチレングリコール (15 mM)、および RuBP (5 mM) から酵素的に調製された Ru1P (上記) でした。

タンパク質の相同性検索は、BLAST Search プログラム (https://www.genome.jp/tools/blast/) を利用して、KEGG Genes データベースに対して実行されました。 好塩菌由来の 16S リボソーム RNA 遺伝子の配列は、KEGG Genes データベースから取得しました。 1 つの生物内に複数の 16S リボソーム RNA が存在する場合、1 つの配列がランダムに選択されます。 系統解析はClustalWプログラム(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)を用いて行い、系統樹はTreeViewバージョン1.6.6を用いて構築した。

データの再現性は、n = 3 の独立した実験を実行してデータを収集し、平均値と標準偏差を決定して提供することによって実行されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

遺伝子座タグと生物コードはデータベース「京都遺伝子・ゲノム大百科」（https://www.genome.jp/kegg/）から採用した。 補足図に示すゲル画像のトリミングされていないゲル画像。 図2および3は補足図23に表示されます。図4a〜cの棒グラフのすべてのデータは補足データ1に示されています。Ht-R15Pイソメラーゼ、Hs-RbsK、Ht-RbsK、Hx-RbsK、 Ht-Urdpase1、Hx-Urdpase1、Hl-Urdpase1、Hx-HAD ヒドロラーゼ、Hx-FucA、および Hs-GaR は、アクセッション番号 LC735265、LC735266、LC735267、LC735268、LC735269、LC735270、LC73527 で GenBank に寄託されています。 1、LC735272、LC735273 、LC735274 とそれぞれなります。

Bräsen, C.、Esser, D.、Rauch, B. & Siebers, B. 古細菌の炭水化物代謝: 珍しい酵素と経路、およびそれらの制御に関する最新の洞察。 微生物。 モル。 バイオル。 改訂 78、89–175 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

佐藤、T. & 跡見、古細菌の新しい代謝経路。 カー。 意見。 微生物。 14、307–314 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Verhees、CH et al. 古細菌の解糖経路のユニークな特徴。 生化学。 J. 375、231–246 (2003)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wamelink, MM、Struys, EA & Jakobs, C. ペントースリン酸経路の生化学、代謝および遺伝的欠陥: 総説。 J.継承します。 メタブ。 ディス。 31、703–717 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kata, N.、Yurimoto, H. & Thauer, RK 細菌および古細菌におけるリブロース一リン酸経路の生理学的役割。 生物科学。 バイオテクノロジー。 生化学。 70、10–21 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

折田 功 他リブロース一リン酸経路は、古細菌サーモコッカス コダカラエンシスで欠損しているペントースリン酸経路を代替します。 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 188、4698–4704 (2006)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Soderberg, T. 古細菌におけるリボース-5-リン酸とエリスロース-4-リン酸の生合成: 古細菌ゲノムの系統解析。 Archaea 1、347–352 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Aitken、DM & Brown、AD 好塩菌、Halobacterium salinarium におけるクエン酸塩とグリオキシル酸塩のサイクル。 ビオチム。 生物物理学。 Acta 177、351–354 (1969)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ファルブ、M.ら。 好塩性古細菌の代謝。 Extremophiles 12、177–196 (2008)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pickl, A. & Schönheit, P. 塩古細菌 Haloferax volcanii の酸化的ペントースリン酸経路には、新種のグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、つまり古細菌のツヴィッシェン発酵が関与しています。 FEBSレター。 589、1105–1111 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ブルト、CJ 他メタン生成古細菌、Methanococcus jannaschii の完全なゲノム配列。 サイエンス 273、1058–1073 (1996)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Grochowski、LL、Xu、H. & White、RH Methanocaldococcus jannaschii におけるリボース-5-リン酸生合成は、ペントース-リン酸経路の非存在下で起こります。 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 改訂 187、7382–7389 (2005)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aono, R.、Sato, T.、Imanaka, T. & Aomi, H. 古細菌におけるヌクレオシド分解のためのペントース二リン酸経路。 ナット。 化学。 バイオル。 11、355–360 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

青野 良 ほか古細菌のAMP代謝経路で機能するAMPホスホリラーゼとリボース-1,5-二リン酸イソメラーゼの酵素的特徴付け。 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 194、6847–6855 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

佐藤、T.、跡見、H. & 今中、T. AMP 代謝の経路における古細菌 III 型 RuBisCO の機能。 サイエンス 315、1003–1006 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ezaki, S.、Maeda, N.、Kishimoto, T.、Aとみ, H. & Imanaka, T. 超好熱性古細菌、Pyrococcus kodakaraensis KOD1 における構造的に新規なタイプのリブロース二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼの存在。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 274、5078–5082 (1999)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

北野和也ほか五角形対称性を有する新規型古細菌ルビスコの結晶構造。 構造 9、473–481 (2001)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

前田 直也 ほか超好熱性古細菌 Pyrococcus kodakaraensis KOD1 由来のリブロース二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼは、大きなサブユニットのみで構成され、五角形構造を形成します。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 293、57–66 (1999)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Watson、GM、Yu、JP、Tabita、FR 酸素欠乏性古細菌の珍しいリブロース 1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ。 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 黙示録 181、1569 ～ 1575 年。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hove-Jensen, B.、Brodersen, DE & Manav, MC 放蕩化合物: 代謝における重要な役割を果たすリボシル 1,5-二リン酸の​​復活。 微生物。 モル。 バイオル。 Rev. 83、e00040–18 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ライトン、KCら。 古細菌から知られるヌクレオシド経路の RubisCO は、細菌の多様な未培養門に見られます。 ISME J. 10、2702–2714 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hansen, T.、Reichstein, B.、Schmid, R. & Schönheit, P. 超好熱性新古菌 Aeropyrum pernix 由来の最初の古細菌 ATP 依存性グルコキナーゼは、幅広いヘキソース特異性を持つ単量体の非常に好熱性の ROK グルコキナーゼです。 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 184、5955–5965 (2002)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kengen、SW、Tuininga、JE、de Bok、FA、Stams、AJ & de Vos、WM 超好熱性古細菌 Pyrococcus furiosus 由来の新規 ADP 依存性グルコキナーゼの精製と特性評価。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 270、30453–30457 (1995)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

桜庭博、三谷裕、合田伸、カワラバヤシY.、大島T. 好気性超好熱性古細菌 Aeropyrum pernix 由来の最初の古細菌 ATP 依存性グルコキナーゼのクローニング、発現、および特性評価。 Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． 133、219–224 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Hansen, T. & Schönheit, P. 超好熱菌 Desulfurococcus amylolyticus から初めて同定された古細菌の ATP 依存性 6-ホスホフルクトキナーゼ、極めて好熱性の非アロステリック酵素の精製と特性。 アーチ。 微生物。 173、103–109 (2000)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Tuininga、JE et al. 超好熱性古細菌 Pyrococcus furiosus 由来の ADP 依存性ホスホフルクトキナーゼの分子的および生化学的特性評価。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 274、21023–21028 (1999)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

牧野 裕也 ほかシステイン生合成とセリン代謝に関与する古細菌の ADP 依存性セリンキナーゼ。 ナット。 共通。 7、13446 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

森 祐也 ほか超好熱性古細菌 Staphylothermus marinus 由来の古細菌 ATP 依存性セリンキナーゼの同定と酵素分析。 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 203、e0002521 (2021)。

論文 PubMed Google Scholar

アジズ、I.ら。 Pyrobaculum calidifontis 由来のホスホフルクトキナーゼ相同体は、ピリミジン ヌクレオシドおよびリボース 1-リン酸に対してキナーゼ活性を示します。 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 200、e00284–18 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ng、WV et al. ハロバクテリウム種NRC-1のゲノム配列。 手順国立アカデミー。 科学。 米国 97、12176–12181 (2000)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

アンダーソン、I. et al. Halopiger xanaduensis 型株 (SH-6T) の完全なゲノム配列。 立つ。 ジェノム。 科学。 6、31–42 (2012)。

記事 CAS Google Scholar

アンダーソン、IJら。 南極ハロルブルム・ラクスプロファンディ型株ACAM 34の完全なゲノム配列。スタンド。 ジェノム。 科学。 11、70 (2016)。

記事 Google Scholar

サンダース、E.ら。 Haloterrigena turkmenica 型株 (4kT) の完全なゲノム配列。 立つ。 ジェノム。 科学。 2、107–116 (2010)。

記事 Google Scholar

Caparrós-Martín, JA、McCarthy-Suárez, I. & Culiáñez-Macià, FA 基質スクリーニングによって明らかにされた HAD 加水分解酵素機能: シロイヌナズナのサブクラス I リン酸糖ホスファターゼ AtSgpp の酵素的特性評価。 Planta 237、943–954 (2013)。

論文 PubMed Google Scholar

Imker、HJ、Fedorov、AA、Fedorov、EV、Almo、SC & Gerlt、JA RuBisCO スーパーファミリーの機構の多様性: Geobacillus kaustophilus のメチオニンサルベージ経路の「エノラーゼ」。 生化学 46、4077–4089 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

マサチューセッツ州ガランボールと EC 州ヒース l-フコースの代謝。 II. L-フクロース 1-リン酸の酵素的切断。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 237、2427–2433 (1962)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Koga, Y.、Kyuragi, T.、Nishihara, M. & Sone, N. 古細菌と細菌の細胞は非細胞前駆体から独立して発生しましたか? エナンチオマーのグリセロリン酸骨格を持つ膜リン脂質の出現が 2 系統の分離を引き起こしたという仮説。 Ｊ．Ｍｏｌ． 進化。 46、54–63 (1998)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

西原 M. および古賀 Y. Methanobacterium Thermoautotrophicum の sn-グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼ:古細菌のエーテルリン脂質の鏡像異性グリセロリン酸骨格の生合成における重要な酵素。 Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． 117、933–935 (1995)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

西原 M. & 古賀 Y. Methanobacterium Thermoautotrophicum からの sn-グリセロール-1-リン酸デヒドロゲナーゼの精製と特性: 古細菌のエーテル極性脂質の鏡像異性グリセロリン酸骨格の生合成酵素の特性評価。 Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． 122、572–576 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Hove-Jensen, B.、Rosenkrantz, TJ、Haldimann, A. & Wanner, BL リボース 1,5-ビスホスホキナーゼ活性 (ホスホリボシル二リン酸形成) をコードする大腸菌 phnN: ホスホン酸分解と NAD 生合成経路における二重の役割。 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 185、2793–2801 (2003)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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NMR 解析については日下枝里子氏と藤田晴夫氏に感謝いたします。 LC-MS 分析用の装置を提供して頂いた浜地至教授に感謝いたします。 この研究は、JSPS 科研費 (助成金番号: 18K05411) および TS の野田科学研究所、および科学技術振興機構 CREST プログラム (助成金番号: 10104047)、JSPS 科研費助成金番号 18H03934 および JP19H05679 (Post-コッホ エコロジー)、JP19H05684 to HA

京都大学大学院工学研究科合成化学・生物化学専攻

Takaaki Sato, Sanae (Hodo) Utashima, Yuta Yoshii, Kosuke Hirata, Shuichiro Kanda, Yushi Onoda, Jian-qiang Jin, Suyi Xiao, Ryoko Minami, Hikaru Fukushima & Haruyuki Atomi

京都大学カーボンネガティブサイエンス統合研究センター（京都市）

Takaaki Sato & Haruyuki Atomi

大阪大学大学院理学研究科化学専攻

Ayako Noguchi, Yoshiyuki Manabe & Koichi Fukase

大阪大学最前線研究センター（大阪市）

Yoshiyuki Manabe & Koichi Fukase

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HAとTSが作品をデザインしました。 SUはR15Pイソメラーゼを分析した。 SU、AN、YM、KF は R1P キナーゼを調べました。 YY, SU は RuBP ホスファターゼを調査しました。 YY、SU、JJ は Ru1P アルドラーゼを検査しました。 SK、HFはグアノシンホスホリラーゼを調べました。 KH、RMは天然のグリコールアルデヒド還元酵素を研究しました。 SX は組換えグリコールアルデヒド還元酵素を調べました。 YO は、H. salinarum 細胞の酵素活性を研究しました。 TS、SU、YY、KH、SK、YO、JJ、SX、HAが原稿を書きました。

Correspondence to Haruyuki Atomi.

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Bettina Siebers と他の匿名の査読者に感謝します。 主な担当編集者:Nis​​hith Gupta と Karli Montague-Cardoso。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

佐藤、T.、歌島 S.(.、吉井、Y. et al. A non-carboxylating pentose bisphosphate pathway in halophilic Archaea. Commun Biol 5, 1290 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003 -022-04247-2

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受信日: 2022 年 7 月 28 日

受理日: 2022 年 11 月 10 日

公開日: 2022 年 11 月 24 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04247-2

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