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Jun 18, 2023

Scientific Reports volume 12、記事番号: 9322 (2022) この記事を引用

3351 アクセス

9 オルトメトリック

メトリクスの詳細

製剤開発段階における動物モデルでの前臨床薬物動態 (PK) 研究は、ヒトでの臨床研究の前に予備的な証拠と薬物および/またはその剤形の PK 挙動のほぼ明確な全体像を提供し、規定に従って剤形を調整するのに役立ちます。期待され必要な臨床行動。本研究は、ニュージーランドシロウサギを用いたベンラファクシン（VEN）の徐放性（ER）固形経口剤形に関する、この種のものとしては初となる前臨床PK研究を報告する。 VEN は高度に処方されており、世界中でさまざまな種類のうつ病の治療に使用されている最も安全で効果的な治療薬の 1 つです。この目的のために開発された多重反応モニタリング (MRM) LC-MS/MS メソッドは、ウサギ血漿中の VEN とその等価代謝物 O-デスメチルベンラファキシン (ODV) を同時に定量するのに十分な信頼性を示しました。説明されているメソッドでは、サンプル前処理に固相抽出を使用し、その後に超高速 LC-MS/MS 分析を実行します。クロマトグラフィーによる分離は、RPLC を使用することにより、主に極性の移動相を使用して均一濃度で達成されました。 MRM モードで動作するトリプル四重極 LC/MS/MS システムは、正極性のイオン源として ESI プローブを使用しました。検証結果は、米国 FDA の推奨事項および生物分析法の検証に関する許容基準の許容範囲内にあります。

徐放性（ER）経口固体剤形（錠剤やカプセルも含む）における薬物放出の前臨床試験には、適切な動物モデルでのインビトロ溶解およびインビボ薬物動態（PK）研究が含まれます。好ましい動物モデルは、前臨床研究下で特定の種類の ER 製剤を収容できる能力を備えている必要があります 1、2、3。前臨床 PK 研究から得られたデータは、薬物の吸収速度と部位、および薬物の分布、代謝、および排出の考えられるメカニズムに関する予備的な証拠を提供します。動物モデルで収集されたこの前臨床 PK データは、ヒトでの臨床 PK 研究に最適な剤形の開発と選択をサポートするプロトタイプ ER 製剤のスクリーニングにも役立ちます 4,5。

ベンラファクシン (VEN)、(RS) 1-[2-(ジメチルアミノ)-1-(4-メトキシフェニル)エチル]シクロヘキサノールは、セロトニンノルアドレナリン再取り込み阻害剤 (SNRI) の薬理学的クラスに属し、比較的新しく、構造的に新規な抗うつ薬です。この薬剤6は、1993年にワイエスによって導入された。この薬剤は、三環系、四環系、その他の抗うつ薬7,8とは化学的に無関係であり、現在頻繁に処方されており、うつ病障害の治療に使用される望ましくない副作用が少ない最も効果的な薬剤の1つである9。 VEN は、即時放出 (IR) 剤形と ER 剤形の両方で経口投与されます 10、11。ヒトにおける VEN とその主要な活性代謝物である O-デスメチルベンラファクシン (ODV)12 (図 1) の抗うつ作用は、中枢神経系における神経伝達物質活性の増強と関連しています。ヒト血漿では、代謝が遅い人を除いて、ほとんどの人で ODV が VEN13 よりも優勢であり、VEN は ODV14、15 よりも高濃度で検出されています。 VEN と ODV は両方とも、セロトニンとノルアドレナリンの再取り込みの強力な阻害剤であり、ドーパミンの再取り込みも弱く阻害します 16。ベンラファクシンはラセミ体であるため、R-(-) および S-(+) 鏡像異性体が等量で存在し、両方ともその抗うつ活性に寄与します。 VEN の R-エナンチオマーはシナプトソームのセロトニンとノルアドレナリンの再取り込みを強力に阻害しますが、S-エナンチオマーはセロトニンの再取り込みをより選択的に阻害します。しかし、VEN の鏡像異性体は両方とも、ノルアドレナリンの鏡像異性体とは対照的に、セロトニン再取り込みの阻害においてより強力です 17、18、19。 ODV のエナンチオマーもノルアドレナリンとセロトニンの両方の再取り込みを阻害し、R-エナンチオマーの方がより強力です 20。

(a) ベンラファクシンおよび (b) O-デスメチルベンラファクシンの化学構造図。

ニュージャージー州プリンストンのWyeth-Ayerst Researchの薬物代謝部門は、マウス、ラット、イヌ、アカゲザルを対象とした、鏡像異性体を含むVEN（WY-45,030）およびODV（WY-45,233）の初期前臨床PKおよび代謝素質研究を報告した。 VEN と ODV はまだ開発中です。動物にVENおよびODVの純粋な水溶液を投与した後に得られた血漿および尿の分析は、いかなる種類の投与製剤でもなく、静脈内(iv)および/または胃内(ig)に投与され、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって行われた。 UV検出による方法。 Wyeth-Ayerst Research は、ラット、イヌ、マウスの血漿中の VEN と ODV を同時に推定するための HPLC 法も報告しました 18、21、22、23。臨床使用が承認されてからの過去 30 年間に、ヒトの血漿および尿中の VEN および ODV を定量するためのかなりの数の生物分析方法が文献で報告されていますが、同じことは前臨床動物モデルには当てはまりません。現在までに入手可能な文献を包括的にレビューした結果、動物で VEN および ODV の前臨床 PK 研究を実施するための以下の生物分析方法が見つかり、これらのほとんどすべてが、VEN および ODV の水溶液を純粋な形で経口投与することを報告しています。またはigルート。 da Fonseca と Bonato は、UV 検出を備えたキラル HPLC 分離を使用した、雄 Wistar ラットの肝臓ミクロソーム調製物中の代謝物に対する VEN の in vitro エナンチオ選択的生体内変換研究を報告しました 24。張ら。雄の Wistar ラットにおける VEN 固体分散体の pK 研究のために、質量分析検出 (LC-MS) を備えた HPLC メソッドを開発しました 25。タンデム質量分析法 (MS/MS) は、より高い特異性と、高い S/N 比、精度、再現性などの改善を備え、HPLC と組み合わせることで、非常に低い検出限界に適したより効果的なツールとなり、さまざまな用途に広く応用されています。現在のPK研究26。多くの論文が、ラット血漿中の VEN および ODV を定量するための HPLC および超高速液体クロマトグラフィー (UHPLC/UPLC) タンデム質量分析法 (LC-MS/MS) を報告しています。シャーら。（2009）およびAhmad et al。らは、ラット血漿中の VEN と ODV を同時に推定するための、液液抽出 (LLE) および固相抽出 (SPE) ベースの LC-MS/MS 法をそれぞれ報告しました 27,28。アリヤルら。らは、LC-MS/MS 法を利用して、薬剤の iv および ig 投与後のマウス血漿および脳透析液中の VEN および ODV の PK パラメーターを調査することに成功しました 29。別の研究で、da Fonseca と Bonato は、ラット経口投与後のラット血漿中の VEN、ODV、および N-デスメチルベンラファクシン (NDV) の動態を評価するための LC-MS/MS 法のような、より選択的で感度の高い技術の開発を報告しました。 VEN30 は、以前に開発された HPLC-UV 法 24 によって達成された定量限界が in vitro 生体内変換研究にのみ適切であったためです。 Zhang らは LC-MS/MS 法を使用しました。 ODV のフェノールエステルの濃度を決定するために、Liu et al. 動物に薬物水溶液を静脈内および経口投与した後の両方の実験において、雄のウィスターラットの血漿、脳、および視床下部におけるODVの合成プロドラッグ、およびビーグル犬のPKパラメータを推定することである31,32。ラット血漿中の VEN と ODV を同時に測定するために開発された UPLC-MS/ESI 法の検証と、VEN 溶液を経口投与した後の雄の Wistar ラットの PK 研究での使用が Dubey らによって検証されました 33。パンら。らは、薬物相互作用研究のためにスパイクされたラット血漿中のメサドン、フルオキセチン、VEN、およびそれらの代謝産物を同時に推定するための完全に検証された UPLC-MS/MS メソッドを開発し、さらにそれを PK 研究にも適用したと主張しています 34。ラット血漿中の VEN とその 5 つの代謝産物を同時に定量する効果的な UHPLC-MS/MS 法が Gu らによって報告されています。そしてラットに経口投与された VEN の PK 研究に適用されました 35。チェンら。らは、ラット肝ミクロソームにおける VEN に対するボノプラザンの効果の根本的なメカニズムを調査するための UPLC-MS/MS 法と、薬物経口投与後の雄の Sprague-Dawley ラットにおける VEN および ODV の PK プロファイルへの影響を調査するための UPLC-MS/MS 法を報告しました。ラット血漿中のベンラファクシンを推定するための SPE ベースのガスクロマトグラフィー質量分析 (GC-MS) 方法と、Sprague-Dawley ラットにおける VEN とフルオキセチン間の PK 相互作用を評価するためのその応用が、Song らによって報告されています 37。 Shahnawaz らによって報告された、スパイクされたラット血漿中の VEN を推定するための分光蛍光分析法が 1 つあります。文献にも記載されています38。

Nerkar と Gattani は 2 つの別々の研究で、HPLC-UV 法を使用したニュージーランドシロウサギにおける VEN を含む静脈内投与、経口液剤および口腔粘膜付着性ゲル製剤（クレス種子および亜麻仁ベース）の比較 PK プロファイルを報告しました 39,40。 Peng らによって報告された別の PK 研究では、ウサギに VEN 食塩水と感熱性 VEN-キトサンヒドロゲルを皮下注射した後、HPLC 法が VEN の測定に使用されています 41。アリら。また、ウサギにおける VEN 含有経口溶液および徐放性ヒドロゲル複合体の PK 研究に HPLC-UV 法を採用しました 42。 Sher らによって開発され、ウサギ血漿で検証された HPLC-UV メソッド。は、アルビノウサギにおける VEN の経口投与後の PK 分析に適用されています 43。

入手可能な文献を徹底的に検討した結果、動物モデルで実施された VEN を含むプロトタイプ ER 固形経口投与製剤の前臨床 PK 研究の報告は 2 件だけ見つかりました。 1 つ目は、Rowley et al. で報告された VEN ER 錠剤のものです。 Wyeth による米国特許 US 20050136109A1。この特許では、ビーグル犬で行われた VEN ER 錠剤の PK 研究について言及していますが、イヌの血漿から VEN と ODV を推定するために利用された生物分析方法については特許公報に記載されていません 44。もう 1 つは、Zhang らによって行われた VEN を含むキトサン - カルボマーマトリックス錠剤の in vivo PK 研究です。 HPLC法を用いたビーグル犬における45。

本研究は、我々の知る限り、ニュージーランドシロウサギにおけるベンラファクシンのER固形経口製剤の前臨床PK研究に関する最初の報告である。この研究には、SPE ベースの堅牢で信頼性が高く、検証済みの超高性能 LC-MRM-MS を使用した、自社製造の VEN ER 錠剤と米国 FDA 参照リストに掲載された医薬品 (RLD) Efexor XR 37.5 mg の生物学的同等性 (BE) 評価が含まれます。ウサギ血漿中の VEN と ODV を同時に定量するための /MS メソッド。

それぞれ純度 99.83% および 99.82% の塩酸ベンラファクシンおよび O-デスメチルベンラファクシンの作業標準は、Vivan Life Sciences (インド) から購入しました。 99.46 原子％の D-等方性濃縮および 99.68％純度の重水素標識ベンラファクシン-D6 塩酸塩（VEN-D6）および 99.92 原子％の D-等方性濃縮および 99.02％純度の Rac-O-デスメチルベンラファクシン-D6 コハク酸塩水和物（ODV-D6）も Vivan Life Sciences (インド) から購入し、内部標準 (IS) として使用しました。試薬グレードのギ酸アンモニウム、HPLC グレードのアセトニトリルおよびメタノールは、Honeywell Specialty Chemicals (GmbH) から入手しました。試薬グレードのオルトリン酸と液体アンモニアは、Thermo Fisher Scientific (インド) から入手しました。試薬グレードのギ酸は、Sigma-Aldrich Chemicals (インド) から入手しました。すべての水溶液と緩衝液は、超純度の Milli-Q 水を使用して調製されました。 SPE カートリッジ (Bond Elut PLEXA、30 mg/1 cc) は Agilent (USA) から入手しました。ヘパリンナトリウム含有採血管、BD VACUTAINER は、Becton Dickinson (USA) から購入しました。 Efexor XR 37.5 mg は、Pfizer Ireland Pharmaceuticals (アイルランド) から購入しました。

VEN および ODV の原液 (1 mg mL-1) は、正確に秤量した標準化合物をメタノールに溶解することによって調製されました。 10 ～ 5000 ng mL-1 の範囲の作業溶液は、原液を希釈剤 (50% メタノール水溶液、v:v) で希釈することによって調製されました。校正標準 (CS) および品質管理 (QC) サンプルは、希釈剤とスパイクインウサギ血漿 (% スパイク ~ 5%) を使用して作業溶液から調製しました。検量線 (CC) は、両方の分析物について約 0.5 ～ 250.0 ng mL-1 の範囲でした。 QC サンプルは、定量限界 (LOQQC)、低濃度 (LQC)、中濃度 (M1QC、MQC)、および高濃度 (HQC) の濃度レベルで調製されました。ウサギ血漿中で調製された CS および QC サンプルの名目濃度を表 1 に示します。

サンプル調製のために、ウサギ血漿から VEN と ODV を抽出するための SPE メソッドが開発されました。冷凍サンプルを室温で解凍した後、ボルテックス混合して内容物を均質化しました。ポリプロピレンチューブ内のウサギ血漿の 80 μL アリコートに、50 μL の IS 希釈液 (約 25.0 ng mL-1 の VEN-D6 および ODV-D6 を含む) に続いて 400 μL の前処理溶液 (10% オルトリン酸を含む水) を加えます。、v:v) を加えてボルテックスしました。サンプルをSPEカートリッジ(0.5 mLのメタノール、続いて0.5 mLのMilli-Q水でプレコンディショニングし、各添加後に2000 rcfで1分間遠心分離した)に移し、プレコンディショニングと同じrcfで1分間遠心分離した。カートリッジを、１ｍＬの洗浄溶液（水中５％アンモニア溶液、ｖ：ｖ）およびＭｉｌｌｉ－Ｑ水で、それぞれの添加後に２０００ｒｃｆで１分間遠心分離機を作動させることによって洗浄した。２０００ｒｃｆで１分間遠心分離することによってサンプルを１ｍＬのメタノールで溶出し、５０±４℃および約２０±５ｐｓｉの窒素蒸気下で乾燥させた。乾燥したサンプル残留物を 300 µL の移動相で再構成し、ボルテックスして、得られたサンプルのアリコートを分析のために LC-MS/MS システムに注入しました。

2 台の Nexera X2 LC-30AD ポンプ、Nexera X2 SIL-30AC MP オートサンプラー、オンライン DGU-20ASR 脱気ユニット、および CTO-20AC Prominence HPLC カラムオーブンで構成される Shimadzu Nexera X2 UHPLC システムを LC に使用しました。クロマトグラフィーによる分離は、ACQUITY UPLC BEH C18 で流速 0.300 mL min-1 での移動相 (2 mM ギ酸アンモニウム緩衝液 (v:v) 中の 60% メタノール + 0.1% ギ酸 L-1) の定組成溶出によって達成されました。カラム (2.1 × 100 mm、1.7 µm)、合計実行時間は 3 分です。各分析には 5 µL の注入量を使用しました。分析対象物とそれぞれの安定同位体標識内部標準 (SIL-IS) の保持時間を表 2 に示します。オートサンプラーとカラムオーブンの温度はそれぞれ 10 ± 1.0 °C と 40 ± 1.0 °C に設定しました。使用したリンス溶液の組成は、90% アセトニトリル水溶液 (v:v) でした。

続いて、LC から溶出したサンプルを、多重反応モニタリング (MRM) モードで動作する AB SCIEX トリプル四重極 (QqQ) API 4000 LC/MS/MS システムを使用して分析しました。使用したイオン源は、正極性のエレクトロスプレーイオン化 (ESI) プローブである TURBO ION SPRAY でした。 2 つの MRM トランジション、Q1 (プリカーサーイオン) と Q3 (プロダクトイオン)、滞留時間 200 ms で分析物 (VEN および ODV) とその SIL-IS (VEN-D6 および ODV-D6) を同時に定量および同定します。質量電荷比 (m/z) 計算に基づいて、化合物に依存するパラメーターが最適化されました。

LC/MS/MS データは、AB SCIEX の ANALYST ソフトウェアバージョン 1.6.3 を使用して処理されました。 CC は重み付き (X-1、X-2、およびなし、X = 濃度) 線形回帰によって生成され、傾き、切片、および相関係数 (R) の値が得られました。 VEN および ODV の濃度は、CC に基づいて分析物/IS のピーク面積比をプロットすることによって決定されました。平均、標準偏差（SD）、精度（%CV）、精度（%公称）は、MS Excelソフトウェアを使用して計算されました。

開発されたメソッドは、米国 FDA 産業生物分析法検証ガイダンス 200146、米国 FDA 産業生物分析法検証ガイダンス 201847、および米国 FDA ICH 調和ガイドライン M10 生物分析法検証 (2018)48 に従って検証されました。検証は、FDA の推奨事項および生物分析の許容基準に従って、CC の直線性、LOQ での感度、選択性、マトリックス効果、キャリーオーバー、精度と精度 (PA)、回収率、および発生サンプル再分析 (ISR) に関して行われました。メソッドの検証。

直接圧縮法を使用して、7.25 mm の円形凹型ツールを備えたロータリー打錠機を使用して、重量 140.0 mg、硬度約 4 ～ 5 kPa の VEN ER 錠剤を製造しました。インビトロ溶解試験は、USP 35「溶解手順」<711>に従って、USP 装置 α (パドル) 法を使用し、37 °C で 900 mL の溶解媒体中で 50 rpm で実施しました。採取された溶解サンプルは、光路長 5 mm のキュベットを使用して 225 nm で分光測光的に分析されました。

開発された生物分析法は、ウサギ血漿中の VEN と ODV の同時定量に使用され、ニュージーランドシロウサギの前臨床 PK 研究の実施に適用されました。動物実験は、カシミール大学薬学部の施設内動物倫理委員会 (IAEC) によって承認されました。 No. F(IAEC 承認)KU/2017/09]。動物実験は、インドの関連法[動物の繁殖および実験(管理および監督)規則 1998 年、修正規則 2001 年、および修正規則 2006 年]、および ARRIVE ガイドラインに従って実施されました。体重 3 ～ 4 kg の健康なウサギ 4 ペア（オス/メス）が、カシミール州ウーサン（パッタン）の政府ウサギ農場から提供されました。ウサギを参照グループと試験グループに分けました。参照グループのウサギ 4 匹にはそれぞれ Efexor XR 37.5 mg のカプセルを経口投与し、同様に試験グループのウサギには社内で製造した VEN ER 錠剤を投与しました。投与後、BD VACUTAINER を含むヘパリンナトリウム中で、0、1、2、3、4、6、8、12、24、および 36 時間の時点で辺縁耳静脈から 2 mL の血液を採取しました。抗凝固処理された血液からの無細胞血漿は、WHO の「診断検査における抗凝固剤の使用 2002 ガイドライン」に従って、血液サンプルを 3000 rcf、17 °C で 15 分間遠心分離することによって得られました。得られた血漿サンプルは、さらなる分析まで -40 °C で凍結されました。

メソッドの開発中に、SPE は血漿から溶解した塩 (電解質) やタンパク質などの干渉物をより選択的に除去することが判明しました。この方法の信頼性は、優れた再現性を実現する回収実験の結果から確認されました。ウサギ血漿の 80 µL アリコートが必要なため、サンプルの無駄も少なくなります。 Log P > 1.5 および pKa 6 ～ 10 の分析対象物の一次抽出には、非イオン性および無極性のベースロード法が選択され、この目的には、親水性の無極性スチレンジビニルベンゼンポリマー吸着剤を含む SPE カートリッジが使用されました。吸着剤のコンディショニングは 100% メタノールで達成され、その後 100% 水で平衡化されました。オルトリン酸による血漿の酸性処理は、タンパク質の沈殿を促進し、血漿を抽出負荷の準備が整った状態にしました。ローディング中、親水性吸着剤表面の極性勾配により、分析物がより疎水性のポリマーコアに相転移し、洗浄とその後の溶出に先立って保持されます。大きな内因性マトリックス成分はポリマー表面に結合できないため、コアに到達しませんでした。液体アンモニアによる洗浄処理により、分析対象物が浸出することなく妨害物質が除去されました。血漿サンプルを 100% メタノールで溶出することで、回収率の高いきれいな抽出物が得られました。

LC では、調査中の分析対象について高分解能で鋭いピークを取得し、最大の MS/MS 感度と組み合わせた高効率を達成することに重点を置きました。クロマトグラフィー分離は、逆相 LC (RPLC) を使用して定組成的に実現されました。イソクラティック分離の基本的な分離方程式によれば、分離能はカラム効率に依存し、それ自体が固定相の粒子サイズの影響を受けます。より小さい粒子 (2 μm 未満) により高いクロマトグラフィー分解能が得られるため、RPLC には UPLC BEH C18 カラムが選択されました。このカラムの固定結合相には、独自のエンドキャッピングプロセスを利用して疎水性三官能性 C18 リガンドと結合した、高効率の 1.7 µM エチレン架橋エチルシロキサン/シリカハイブリッド (BEH) 粒子が含まれています。結合相のリガンド密度は 3.1 μMol M-2、炭素負荷は 18% です。 RPLC での保持力は主に溶質の疎水性に関係しているため、より疎水性の高い分子を分離するには、より疎水性の低いリガンドを使用する必要があります。 VEN と ODV は親水性の高い分子であるため、疎水性の強い三官能性 C18 リガンドは、目的の分離に十分な結合を提供できました。移動相の極性を適切に調整することは、RPLC で溶質分子を分離するための無極性カラムの選択と同様に重要です。主に極性溶媒であるメタノールが移動相として最適化され、ギ酸アンモニウムによって移動相の適切な緩衝能力が維持されました (pKa = 3.75、緩衝範囲は 3.76 ～ 5.76)。移動相の流量は、逆相分離における小分子の分離に重要な役割を果たすため、流量を 0.300 mL/min に調整すると、分析物の高い分離が得られます。

MS/MS 条件を最適化する際に考慮される 2 つの主な目標は、適切な感度と選択性を達成することでした。サンプル抽出、クロマトグラフィー開発、および MS の初期調整はすべて感度と選択性に影響しますが、MS の最適化はメソッドの感度に大きな影響を与えます。 MS の初期調整中の最初のステップは、分析物のイオン化を決定することでした。ガス流量やイオン化電圧などのイオン化源/ガスパラメータ (表 3) は、検体に合わせて調整され、検体にとって最適なイオン化条件が得られ、その後の感度が決まりました。この MS の初期調整中に、MS/MS 分析を実行するための陽イオン化モードが決定されました。適切なイオン化モードと検出極性は、検体の極性と LC 動作条件に基づいて選択されました。 ESI の使用により得られる主な改善点は、断片化がほとんどなくプロトン化または脱プロトン化された分子が形成されることであり、これは感度の最大化を含め、前駆体イオンの選択に理想的です。

タンデム質量分析は主に、プリカーサーイオンの選択 (Q1)、主に衝突誘起解離 (CID) によるその断片化、および形成されたプロダクトイオンの m/z 測定 (Q3) に基づいています。最初に各分析物について 2 ～ 3 つの MRM トランジションをスクリーニングすることで、正しい分析物がモニタリングされているという確信が得られ、この選択性は実際の生体サンプルを分析するメソッド開発の後の段階で役立ちます。各化合物の最適化された MS パラメータを表 4 に示します。分析物は、VEN、VEN-D6、ODV、ODV の MRM および質量遷移イオンペア (前駆体 - プロダクトイオン遷移) を使用した衝突誘起 MS/MS によって検出されました。 -D6 は、それぞれ m/z 278.2 → 58.1、m/z 284.2 → 64.1、m/z 264.0 → 58.1、m/z 270.0 → 64.1 として選択されました。 MRM 質量スペクトルと分析物と SIL-IS の断片化を図 1 と 2 に示します。 2、3、4、5。

MRM 質量スペクトルとベンラファクシンの断片化。

MRM 質量スペクトルとベンラファクシン D6 の断片化。

MRM 質量スペクトルと O-デスメチルベンラファキシンの断片化。

O-デスメチルベンラファキシン-D6 の MRM 質量スペクトルと断片化。

MRM-MS 分光法ベースの生物分析法の開発と SIL-IS の使用による定量精度の組み合わせにより、分析物の定量における変動制御を通じて感度と選択性が向上しました。また、光と光の質量を同時にモニタリングすることにも役立ちました。重い前駆体イオン。 MRM は質量に基づいて化合物を識別するため、使用されるクロマトグラフィー法によってサンプル中に存在するすべての単一成分を分離する必要がなくなります。したがって、QqQ MS プラットフォーム上の MRM-MS 分光分析は、複数の遷移 (Q1/Q3 ペア) を検出する速度と精度を提供し、高速 LC 分析とサンプル準備時間の短縮を可能にしました。さらに、MRM-MS ベースの VEN とその活性代謝物の同時定量により、同じ実行で両方の形態を注入できるハイスループットの生物分析法の開発が可能になり、サンプル固有の感度や実行ごとの変動を調和させることができます。イオン抑制、および保持時間の偏差。 MS 定量のゴールドスタンダードとも称される SIL-IS で MRM を使用することにより、開発された生物分析法の精度と再現性の一貫性が実現しました。開発された MRM-MS 分光分析法の再現性は、ISR 評価結果によって実証されたように信頼できることがわかりました。 ISR データは、VEN と ODV の再分析された定量値が、それぞれ再分析サンプルの総数の 93.35% と 86.96% で平均の ± 20% であることを示しました。

すべてのブランク、CS、および QC サンプルは、研究サンプルと同じウサギから得られた血漿で調製されました。 LOQ を含む 8 つの非ゼロ CS レベルを含み、定量範囲をカバーするスパイク血漿サンプルの 3 つのバッチを、CC の直線性について実行しました。すべての実行には、各 LQC、M1QC、MQC、および HQC の 2 つの反復も含まれます。ゼロ以外のすべての CS レベルは、FDA の承認基準に従って公称濃度の ± 15% であることが判明しました。濃度と反応の関係は最も単純な回帰モデルに適合することが判明し、CC の線形特性を示しました。各分析物の平均 CC パラメーターを表 5 に示します。

CC 上のゼロ以外の最低の CS レベルが LOQ を定義します。 FDA の承認基準では、LOQ がゼロ CS レベル (ブランク) の分析対象物の応答の 5 倍以上であり、公称濃度の ± 20% の精度で、± 20% (%CV) の精度で再現可能であることが求められています。 LOQ での感度は、CC 範囲の PA 評価の一部として行われ、3 つの日内の PA バッチで 6 回の反復で LOQQC (図 6) を実行することによって決定されました。表 6 に示す結果は、LOQ が許容可能な精度および精度基準内で定量的に決定されたことを示しています。

(a) ベンラファクシンおよび (b) O-デスメチルベンラファクシンの LOQQC の代表的なクロマトグラム。

FDA ガイドラインでは、マトリックスの潜在的な干渉内因性成分による干渉を軽減または回避し、測定対象の物質が目的の分析物であることを確認するために、バリデーション中に選択性を実行することを求めています。選択性は、ウサギ血漿の 10 個のブランクサンプル (ダブルブランク)、およびブランクマトリックスと抽出された LOQ の両方における分析物 (VEN および ODV) および IS (VEN-D6 および ODV-D6) の保持時間におけるピーク面積応答を分析することによって実証されました。を測定した（図７）。使用した抽出方法は、サンプルの調製「サンプルの調製」で述べたものと同じです。 VEN および ODV の抽出 LOQ における分析物の平均ピーク面積応答に対するブランクマトリックスの面積 % は、それぞれ 1.25 ～ 4.22% および 1.07 ～ 9.22% でした。 VEN-D6 と ODV-D6 の両方の IS について、抽出された LOQ における IS の平均ピーク面積応答に対するブランクマトリックスの面積 % は 0.00 ～ 0.02% でした。結果は FDA の許容基準内に十分収まり、ブランクには分析対象物に対する干渉がないことが示され (抽出された LOQ サンプルと比較してブランク中の分析対象物のピーク面積応答が 20% 未満)、ブランクの IS 応答が分析対象物の 5% を超えなかったことが示されました。 CS と QC の平均的な IS 応答。

(a) ベンラファクシンと (b) O-デスメチルベンラファクシンのダブルブランクの代表的なクロマトグラム。

FDA の推奨事項では、LC-MS および LC-MS/MS メソッドの適用全体を通じて精度、選択性、感度が損なわれないように、マトリックスサンプルのマトリックス効果をテストすることが求められています。マトリックス効果は、通常、サンプルマトリックス中の未知の干渉成分の存在による分析対象物の応答の変化として観察されます。マトリックス効果は、マトリックス係数 (MF) の観点から定量的に測定され、存在下 (抽出および抽出後にスパイク) の LQC および HQC レベル (図 8、9) で得られた分析物のピーク応答の比として推定されました。マトリックスイオンが存在しない（純粋な標準溶液）。さらに、IS-normalized-MF または Absolute-MF は、分析物の MF と IS の MF の比として計算されました。 SIL-IS を使用すると、実効的な IS 正規化 MF の変動が減少するため、6 ロットの独立した行列サンプルで MF または IS 正規化 MF を決定する必要はありません50。 %CV (表 7) によって決定される MF のばらつきは、FDA ICH 調和ガイドラインの許容基準 (15% 未満) 内に十分収まっていることがわかりました。

(a) LQC (スパイク)、(b) LQC (純粋な標準溶液)、(c) HQC (スパイク)、および (d) HQC (純粋な標準溶液) レベルでのベンラファクシンの代表的なクロマトグラム。

(a) LQC (スパイク)、(b) LQC (純粋な標準溶液)、(c) HQC (スパイク)、および (d) HQC (純粋な標準溶液) レベルでの O-デスメチルベンラファクシンの代表的なクロマトグラム。

分析方法では、前のサンプルからのサンプルへの分析物の流入により、サンプル間のキャリーオーバーが発生する可能性があります。 FDA ガイドラインでは、キャリーオーバーは LOQ の 20% を超えてはならず、キャリーオーバーを排除するとともに、研究サンプルの定量に及ぼす影響があればモニタリングすることを求めています。キャリーオーバーは、高い CS レベル (HQC) の後に 3 つのブランクマトリックスサンプル (ダブルブランク) を注入することによってモニタリングされました。 VEN および ODV の抽出 LOQ における分析物の平均ピーク面積応答に対する 3 つのブランクマトリックスサンプルの面積%は、それぞれ 5.17%、3.11%、2.43%、および 2.72%、2.26%、5.98%でした。同様に、VEN-D6 および ODV-D6 では、抽出された LOQ における IS の平均ピーク面積応答に対するブランクマトリックスの面積 % は、0.00 ～ 0.02% の範囲内に留まりました。結果は、キャリーオーバーが無視できる程度であり、検体および IS の保持時間におけるピーク面積応答の向上はなく、キャリーオーバーが開発されたメソッドの PA に影響を及ぼさないことを保証しています (図 10)。

(a) ベンラファクシン HQC、(b) その後のベンラファクシンダブルブランク、(c) O-デスメチルベンラファクシン HQC、および (d) その後の O-デスメチルベンラファクシンダブルブランクの代表的なキャリーオーバークロマトグラム。

FDA ガイドラインに従って、PA の計量によるメソッドの検証は、研究サンプルの分析のメソッドの適格性を確立するために不可欠であり、定量範囲全体で 4 つの QC レベル (LOQQC、LQC、MQC、および HQC) を評価することが含まれます。バッチ間 (日中) とバッチ内 (日内) の PA は、それぞれ異なる日 (n = 18) と同日 (n = 6) に CC に対して VEN および ODV QC 反復を実行することによって決定されました。各実行には、新たに調製した CS と QC を使用しました。少なくとも 3 回の独立した PA 実行が、各実行に含まれる CC とともに実行されました。バッチ間およびバッチ内でのすべての PA 実行における QC のパフォーマンスに基づくと、表 8 に示す結果から、このメソッドの PA は FDA の承認基準を十分に満たしていることが明らかです (精度と確度: 公称濃度の ± 15%)。 LOQQC での ± 20% を除く QC)。

メソッド開発中に使用される抽出プロセスの効率と再現性は、分析物と IS の回収を最適化することによって確立されます。 FDA のガイドラインでは、回復が 100% である必要はないが、回復の程度が一貫しており、再現可能であることが維持されていると述べています。回収は、LQC、MQC、および HQC で抽出された各 QC サンプルの 6 つの複製の分析物のピーク面積 (カウント) と、抽出後に分析物をスパイクしたブランクの対応する抽出物 (約 100% の回収率を表す) を比較することによって実行されました。 IS の回収率は、抽出された IS サンプルの 18 回の複製を使用して同様の方法で推定されました。表 9 に示す回収実験の結果は、VEN、ODV、およびそれらの IS を同時に推定する方法の開発に使用された SPE の一貫性と再現性を確認しています。

品質によるデザイン (QbD) アプローチを使用して、VEN の ER 錠剤製剤を開発するために、さまざまな放出制御ポリマーをスクリーニングしました。前臨床 PK 評価用に最適混合実験計画 (DOE) を使用して生成された最適化された製剤には、それぞれ 13.1%、19.25%、および 36.4% の carbopol 971P、Blanose 7HXF、および Avicel 112 が含まれていました。 Ligamed MF-2-V と Aerosil 200 の適切なレベルも調整され、堅牢な製剤が生成されました。最適な混合設計は、特定の要件を満たすようにターゲットをカスタマイズするのに役立ちます51。この場合、それは in vitro 薬物放出を RLD の放出と一致させることでした。

pH 4.5 酢酸緩衝液、pH 5.5 酢酸緩衝液、および pH 6.8 リン酸緩衝液における最適化された ER 錠剤と RLD の溶解プロファイルの比較は、米国 FDA 経口投与医薬品の産業、バイオアベイラビリティおよび生物学的同等性研究に関するガイダンス - 全般に従って実施されました。考察 (2002)52、モデルに依存しないアプローチによる類似性係数 (f2) を使用53。異なる溶解媒体における類似性係数 f2 値を表 10 に示します。最適化された ER 錠剤と RLD の溶解データは、50 ～ 100 の間で得られた f2 値で f2 曲線類似性試験 (試験対基準) の適格性を確認しました。これにより、一貫性が確保され、 2 つの溶解プロファイル曲線の in vitro 同等性。

検証済みの LC-MS/MS メソッドは、見出し 2.9 で説明されているように、最適化された ER 錠剤と RLD を経口投与した後のウサギ血漿中の VEN と ODV のタンデム定量に効率的に適用されました。表 11 にまとめた PK 評価は、WinNonlin 8.1 を使用したノンコンパートメント分析 (NCA) によって実行され、追加の統計計算は SAS 9.4 で実行されました。参照製品と試験製品間の主要な PK パラメーターのバイオアベイラビリティ比較を使用した BE 評価は、同様であることが判明しました。表 12 に示す生物学的同等性の統計的保証は、参照製品と試験製品の対数変換された PK パラメーター (Cmax、AUClast、および AUCINF_obs) の分散分析を使用して計算されました。 VEN および ODV の平均血漿濃度対時間のプロットを図 11 に示します。VEN および ODV の血漿濃度は、サンプリング期間 (36 時間) を通じて標準定量範囲内および LOQ (0.5 ng mL-1) を超えていました。参照製品と試験製品の VEN および ODV Cmax の代表的なクロマトグラムを図 12 に示します。

ニュージーランドシロウサギに試験ER錠剤とEfexor XR 37.5 mgを単回経口投与した後の平均血漿濃度対時間のプロット。

(a) ベンラファクシン Cmax テスト、(b) ベンラファクシン Cmax Ref、(c) O-デスメチルベンラファクシン Cmax テスト、および (d) O-デスメチルベンラファクシン Cmax Ref の代表的なクロマトグラム。

製剤開発段階で、限られた数の動物および血漿サンプルを使用した小規模な研究から得られた前臨床 PK データは、必要な臨床 PK 挙動を達成するための薬物およびその剤形に関する重要な PK 情報を提供できます。この研究では、ニュージーランドシロウサギを用いた、VEN の 2 つの ER 製剤、Efexor XR、および自社製造の VEN ER 錠剤の前臨床 BE 評価研究を報告しています。この目的のために、VEN と ODV を並行して定量するための信頼性が高く、迅速な SPE ベースの LC-MRM-MS/MS 生物分析法が開発され、FDA の推奨および承認基準の許容限界と一致して効果的に検証されました。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開記事に含まれています。

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著者らは、ハリヤナ州グルグラムにある研究開発センターでこの研究を実施することを許可してくれたサン・ファーマシューティカルズ・インダストリーズ・リミテッド・インド（臨床薬理学および薬物動態学）に感謝している。著者らはまた、カシミール州スリナガルのハズラトバルにあるカシミール大学食品科学・技術学部での動物投与実験の実施を許可してくださったFA Masoodi教授とAdil Gani博士に感謝しています。

カシミール大学薬学部、ハズラトバル、スリナガル、190006、インド

アブドゥル・アーラ・ファズリ、サイド・ナイエム・ラザ、タハ・ウマイル・ワニ、ニサール・アフマド・カーン

Sun Pharmaceuticals Industries Limited (R&D Center)、グルグラム、ハリアナ州、122021、インド

バラ・クリシュナ・パニグラヒー、シャヴェジ・アハマド、アルシャド・クルーー

Viatris Inc (製剤開発研究)、ジガニ、バンガロール、560105、インド

ヴァリンダー・クマール

チャンディーガル大学薬学研究所、モハリ、パンジャブ、140413、インド

ビラル・アハマド・ザーガー

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この研究は、もともと AAF と NAKAAF によって考案された製剤開発研究 (FDR) プロジェクトの一部であり、SA が製剤開発設計を準備し、AAF が実験作業を実行しました。 AAF と BKP は LC-MS/MS 作業計画を設計し、AKBAZ の監督の下でそれを実行し、取得した LC-MS/MS データの技術的評価を実施しました。 AAF、SNR、TUWは動物実験を実施した。 AAF と VK は薬物動態研究のために動物データを評価しました。 AAF、SNR、および NAK はこの原稿を改訂しました。

ニサール・アフマド・カーンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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Fazli、AA、Panigrahy、BK、Kumar、V 他。ウサギの前臨床薬物動態研究におけるベンラファクシンとその O-デスメチル代謝物の多重反応モニタリング (MRM) LC-MS/MS 定量。 Sci Rep 12、9322 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-13389-6

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受信日: 2021 年 12 月 4 日

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公開日: 2022 年 6 月 4 日

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