牛乳サンプル中のテトラサイクリン抗生物質残留物を測定するための定性イムノアッセイと、それに続く定量的改良型 HPLC

Jun 19, 2023

Scientific Reports volume 12、記事番号: 14502 (2022) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

環境汚染は、人々や野生動物に害を及ぼすいくつかの問題の 1 つです。 現在発生している汚染物質の例としては、水や食品中に存在する可能性のある抗生物質の残留物があります。 抗生物質は人間や動物の感染症を治療または予防することを目的としていますが、成長と飼料効率を促進する能力があるため、動物の栄養補助食品としても使用されています。 この抗菌薬の過剰使用により、食品中に抗生物質の残留物が蓄積され、最終的には人間が消費します。 動物の飼料や乳を直接介して、または植物や土壌を介して間接的に抗生物質に人間が継続的に不必要に曝露されると、多剤耐性菌が出現する可能性が高まり、その結果人間の健康に悪影響を与える可能性があります。 抗生物質の使用に関して新しい規制が課されました。 サウジアラビアでは人間の消費を目的としたさまざまな種類の食品中の抗生物質の残留条件に関するデータが不足しているため、この研究では、動物の乳サンプル中のテトラサイクリン系抗生物質を特異的に検出するための、最適化されたクロマトグラフィー法 (HPLC-DAD) とその後に続くイムノアッセイアプローチを提案しました。 このメソッドは、pH 4 に調整された 0.01 M KH2PO4: アセトニトリル: メタノール (70:20:10、v/v/v) からなる移動相を備えた RP-C18 カラムを使用して実行されました。メソッドには次の点で改善が観察されました。解像度と感度です。 抽出に使用されたタンパク質沈殿法では、85 ～ 101% という高い回収率が実証されました。 この方法は、国際調和会議 (ICH) のガイドラインに従って検証されました。 これらの調査結果から、サウジ市場の乳製品中のテトラサイクリンおよびオキシテトラサイクリン抗生物質の残留量が最大残留限度値 (MRL) を下回っていることは明らかです。

環境汚染は、今世紀に世界が直面している課題です。 この問題は、「通常の環境プロセスに悪影響を与えるほどの、地球/大気系の物理的および生物学的構成要素の汚染」と定義されています1。 自然レベルを超えて存在する物質またはエネルギーは汚染物質とみなされます1。 残留抗生物質は、動物、植物、土壌に存在する環境汚染物質の 1 つであり、耐性微生物の発生を促進する可能性があります。 不必要な抗生物質の使用および抗生物質への曝露によって生じる微生物耐性は、いわゆる多剤耐性病原体に対する特定の抗生物質、あるクラスの抗生物質、または数種類の抗生物質に反応する細菌耐性機構の変化または新しい機構の発達として定義されます。 MDR)2. 抗菌活性を維持するために、規制当局は抗生物質の処方プロセスを制限しています。 しかし、抗生物質は獣医学での使用に加えて、牛や家禽の成長を促進し、生産性を高めるために食品保存料としても使用されています3、4、5。 これまでの研究では、動物の生産性を高めるために高レベルの抗生物質を使用することは、動物由来の食品に残留する抗生物質の存在と関連していることが証明されています6、7、8。 ヒトが抗生物質の残留物に継続的に曝露されると、アレルギー反応を発症したり、正常な腸内細菌叢を破壊したりする可能性が高まり、人体に有害となる可能性があり、また抗生物質耐性菌（ARB）や抗生物質耐性遺伝子（ARG）が動物からヒトに移入する可能性があります5。

テトラサイクリン (TTR)、クロルテトラサイクリン (CTC)、およびオキシテトラサイクリン (OXY) は、有効性と低コストのため、畜産で最も一般的に使用される抗生物質の 1 つです9,10。 多くの研究が、世界中でこれらの抗生物質の不適切な使用とそのような行為の結果を実証しています6,11。 たとえば、動物の混合飼料や食品産業における防腐剤としての抗生物質の管理されていない使用が存在します12、13。 さらに、新鮮な肉の保存期間を延ばすために、抗生物質が屠殺直前に動物に与えられたり、屠殺直後に頸動脈に注入されたりすることがよくあります12。 最終的には、残留抗生物質濃度が欧州連合 (EU) および世界保健機関 (WHO) が許可する最大残留限度 (MRL) を超える可能性があります。

テトラサイクリン系抗生物質 (TC) の測定方法は、さまざまな食品サンプルや環境サンプルにおいて多くの分析方法によって広範囲に研究されてきました。 例えば、Al-Ghamdi らは、サウジアラビア東部地域における家禽製品における TC 抗生物質の誤用を微生物学的手法を用いて確認した 14。 さらに、アル・アフサー地域で行われた他の2件の研究では、動物に抗生物質が残留していることが示されている。 最初の研究では、LC-MS/MS を使用して、ラクダ、ウシ、ヒツジの組織に残留する 9 種類の抗生物質 (キノロン、フルオロキノロン、スルホンアミド、テトラサイクリン) をスクリーニングしました 15。 2 つ目は Al-Nazawi らによるもので、Delvotest P マルチ プレート テストを使用して、乳製品中の主に TC、ストレプトマイシン、およびネオマイシンをスクリーニングしました 16。

現在の文献の多くは、食品および牛乳サンプル中の多種類の抗生物質の検出と定量に最も適切な方法として、液体クロマトグラフィーと質量分析 LC-MS/MS を組み合わせて利用しています 17,18。 乳サンプル中の TC 抗生物質残留物の測定に関する他の技術としては、キャピラリー電気泳動 (CE-FL19 および CE-DAD20)、微生物学的検出 21、分光法 22 などが報告されています。 最近の 2 件の総説論文のデータにより、牛乳中のテトラサイクリン系抗生物質残留物のモニタリング ツールとして免疫学的キットが使用されていることが明らかになりました 12,17。 表 1 は、HPLC-DAD による牛乳サンプル中の TC 抗生物質残留物の定量に関するいくつかの報告されたクロマトグラフィー方法をまとめています。 これらのレビュー記事は、公開されているメソッド間の類似点の多くを正確に示しています。 大多数の研究では、C18 固定相と逆相 HPLC12 が使用されています。 さらに、異なる濃度の有機成分を含む水-アセトニトリルまたは水-メタノールの二成分混合物が、三成分混合物(水-アセトニトリル-メタノール)よりも頻繁に使用されることが注目されています。 シュウ酸、ギ酸、酢酸、クエン酸は、移動相で最も一般的に使用される化学物質の 12,23 です。 複雑なサンプルと抗生物質の混合物を使用した勾配溶出システムが報告されており、これにより分離が可能になります 12。

この研究の主な目的は、DAD 技術と組み合わせた HPLC によって、サウジ市場からの牛乳サンプルに含まれるテトラサイクリン系抗生物質の残留量を測定することでした。

オキシテトラサイクリン (純度 98.07% NMR)、テトラサイクリン (> 98.00%)、クロルテトラサイクリン (> 95.00%) および内部標準オルニダゾール (ORZ、> 99.00%) の標準物質は、Haoyuan ChemExpress Co., Ltd. (上海、中国) から購入しました。 ）。 無水オルトリン酸二水素カリウム (KH2PO4) は Loba Chemie Pvt. から入手しました。 Ltd. (インド、ムンバイ)。 エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物 (Na2EDTA) は、Sigma-Aldrich Chemie Gmbh (シュタインハイム、ドイツ) から入手しました。 オルトリン酸 (H3PO4) は、Avonchem Ltd. (チェシャー、英国) から入手しました。 移動相のアセトニトリルおよびメタノール溶媒は、UHPLC および HPLC グレードのものでした。 すべての実験では脱イオン水を使用しました。 牛乳サンプルは、リヤド市の複数の地元市場と農場から購入されました。 テトラサイクリン迅速イムノアッセイ検査キットは、パーキンエルマー社の Meizheng Biotech Group (北京、中国) から入手しました。 HPLC システム (Waters、米国マサチューセッツ州ミルフォード) は、Waters 1525 バイナリ HPLC ポンプ、Waters 2998 フォトダイオード アレイ検出器、および Waters 2707 オートサンプラーで構成されていました。 データは Waters Empower 3 ソフトウェアを使用して取得および処理されました。

クロマトグラフィー分離は、逆相 Macherey-Nagel C18 カラム (内径 250 × 4.5 mm、粒子サイズ 5 μm) で実行されました。 移動相は、10 mM オルトリン酸二水素カリウム: アセトニトリル: メタノールの比 70:20:10 (v/v/v) の混合物で、0.01 M オルトリン酸で pH を 4 に調整しました。 移動相を 0.45 µm の Whatman 濾紙で濾過し、続いて 10 分間脱気し、その後 1 mL/分の流速で送液しました。 分析は 25 °C で実行され、化合物の溶出は 210 ～ 600 nm のダイオードアレイ検出器 (DAD) で監視されました。 クロマトグラムは 358 nm で記録され、注入量は 50 μl でした。

OXY、TTR、CTC、および内部標準 ORZ の濃度 1 mg/mL の原液 (1) をメタノールで調製しました。 各溶液の濃度が 10 μg/mL の混合ストック溶液 (2) を調製するには、さらに希釈する必要があり、使用した使用濃度は 0.09、0.3、0.5、0.7、および 1 μg/mL でした。 内部標準原液(2)も同様の手順で別途調製しました。 溶液を冷凍庫 (-20 ℃) に保管し、1 か月間遮光して保管しました 24,25。

牛乳サンプル (n = 100) は、主にその種に従って牛、ラクダ、ヤギの乳に分類されました。 その他の分類には、供給源 (地元の商品/輸入商品/地元の農場)、寿命 (新鮮/長寿命)、脂肪含有量 (全脂肪、低脂肪、脱脂粉乳)、飼料 (オーガニック/非オーガニック) が含まれます。 サンプル情報を表 2 に示します。牛乳は、2021 年 10 月から 11 月および 2022 年 2 月の数か月間にわたって、サウジの地元の市場および農場 (リヤド市) から購入されました。

牛乳サンプルの抽出には、タンパク質とキレート剤を沈殿させるための有機溶媒の添加が含まれます。 この手法は一般的であり、多くの研究で利用されています23。 サンプルは以下の手順で作製した。 抽出プロセスは、ポリプロピレン遠心分離管内で、牛乳サンプル 2 mL を 0.4 mL の 0.2 M Na2EDTA およびメタノール 0.6 mL と混合することから始まりました。 均質な溶液が形成されたら、チューブを 16,000 rpm で 20 分間遠心分離し、0.22 μm ワットマン シリンジ フィルターを通して濾過して分析用の HPLC バイアルに入れました。

テトラサイクリン迅速検査キットは、牛乳およびラクダの乳に残留するテトラサイクリン系抗生物質の存在を判定する定性分析です。 キットのコンポーネントは使用前に室温 (20 ～ 25 ℃) に達する必要があります。 牛乳サンプルを振盪し、マイクロウェルに加えました（脱イオン水 100 μL で希釈した牛乳サンプル 200 μL およびラクダ乳サンプル 100 μL）。 内容物をピペットで５回上下させることにより、コーティング複合体粉末を溶解した。 テストストリップをマイクロウェルに入れる前に、サンプル混合物を室温で 2 分間インキュベートしました。 テストストリップの発色を 5 分間観察してから取り出し、結果は 1 分以内に解釈されました。

文献を検討した結果、多くの TC 分析方法は、有機修飾剤としてアセトニトリルとメタノールに加えて、移動相の有機酸溶液としてシュウ酸を使用して実行されていることがわかりました。 これらの条件に関する予備実験により、各移動相成分の影響が明らかになりました。 たとえば、アセトニトリル比率を 20% より高くすると、分解能が大幅に低下します。 基準物質に対するメソッドを最適化するために、さまざまな比率の有機修飾剤を含むさまざまな濃度のシュウ酸が研究されました。 予備的な移動相比は、それぞれ 10 mM シュウ酸溶液、アセトニトリル、メタノール 70:20:10 (v/v/v) でした。 以前の出版物と一致して、我々の結果は、25 mM シュウ酸が他の試験濃度 (0、10、40、50、および 60 mM) よりも最適な分解能を示すことを示しました。 我々の発見は、10 mM シュウ酸ではより短い保持時間が観察されたことも示しています。

有機修飾剤に関しては、有機修飾剤としてアセトニトリルのみを20%の比率で使用した場合、良好な分解能でピーク分離が確認されました。 ただし、アセトニトリルを単独で使用すると、保持時間が最大 30 分に増加します。 これにより、最適な条件にはメタノールとアセトニトリルの両方が必要であることが明らかになりました。 アセトニトリルとメタノールの比率がそれぞれ 20% および 10% を超えると、分解能が大幅に低下しますが、これらの比率を下げると分析時間は長くなります。 これらの発見は、標準標準物質を分析する場合の他の研究の成果を広く裏付けるものである。なぜなら、この方法は乳マトリックスに適用した場合に許容可能な分解能を提供できないからである。 驚くべきことに、ミルクマトリックス成分と TC ピークとの間にピーク干渉が実証されました。 したがって、許容できる解像度は得られず、添加乳マトリックスでのさらなるメソッドの最適化が必要であることが示唆されました。 図 1 および 2 は、薬物を添加したミルクマトリックスに対するシュウ酸濃度の変化の影響に関する実験クロマトグラムの概要を示しています。 予想に反して、これらの裁判では合理的な解決を達成することができませんでした。 これらの方法では、使用した比率や濃度が異なるにもかかわらず、マトリックスのピークを薬物のピークから分離できませんでした。 全体として、これらの発見は、シュウ酸ベースの移動相が​​乳マトリックスには適していないことを示しています。

薬物を添加した牛乳に対するシュウ酸濃度の変化の影響。 (a) 5 mM シュウ酸:ACN:MeOH (70:20:10)。 (b) 10 mM シュウ酸:ACN: MeOH (70:20:10)。 (c) 15 mM シュウ酸:ACN:MeOH (70:20:10)。 クロマトグラフィー条件：注入量：３０μＬ、温度：２５℃、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長：３５８ｎｍ。

薬物を添加した牛乳に対するシュウ酸濃度の変化の影響。 (a) 25 mM シュウ酸:ACN: MeOH (70:20:10)。 (b) 30 mM シュウ酸:ACN: MeOH (70:20:10)。 (c) 50 mM シュウ酸:ACN: MeOH (70:20:10)。 クロマトグラフィー条件：注入量：30μL、温度：25℃、流速：1mL/min、検出波長：358nm。

以前の研究では、TC 抗生物質測定用の有機修飾剤とともに、移動相内の無機塩としてシュウ酸をリン酸二水素カリウム KH2PO4 に置き換える可能性が提起されました。 例えば、乳サンプル中の OXY と TTR の測定は、0.05 M リン酸二水素カリウム (pH 2.8)/ACN (80:20、v/v) の定組成溶出システムを使用して実行されました 26。 予備的な実践実験の結果は有望であり、有機改質剤の異なる比率で異なる KH2PO4 濃度を評価するさらなる研究が奨励されました。

最初に、ACN と MeOH を異なる比率で含む 0.025 M KH2PO4 をテストしました。 ただし、KH2PO4 を 0.01 M に減らすと、分解能が向上しました。 図 3 は、添加乳マトリックスに対する可動性組成物の比率の変更の影響を表しています。 おそらく最も重要な発見は、KH2PO4:ACN:MeOH の比率が 70:20:10 の移動相で良好な分離が達成されることです。 しかし、感度の低下が認められました。これは、TC の化学構造におけるファルマコフォアの喪失と移動相の pH の変化によるものと予想されます。 したがって、感度を高めるために移動相の pH を評価しました。

添加牛乳に対する KH2PO4 濃度の影響。 (a) 25 mM KH2PO4:ACN:MeOH (70:20:10)。 (b) 10 mM KH2PO4:ACN:MeOH (70:20:10)。

pH の影響は、0.1 M オルトリン酸を使用して、0.01 M KH2PO4:ACN:MeOH の移動相混合物を pH 2 ～ 5.5 の範囲で 70:20:10 の比率に調整することによって評価されました。 pHを変化させた場合の解像度と感度への影響を評価しました。 pH 5.5 に向けて解像度の向上が見られましたが、この領域では感度が失われています。 pH を 2 ～ 3 近くまで下げると感度は向上しましたが、解像度は低下しました。 pH 4 では、移動相は満足のいく分離能を示し、研究の目的に許容できる感度を示したので、乳サンプルの評価に移動相が選択されました。 図 4 に、提案された方法のクロマトグラムを示します。

提案手法のクロマトグラム。 クロマトグラフィー条件: 10 mM KH2PO4: ACN: MeOH (70:20:10)、注入量: 50 μL、温度: 25 ℃、流速: 1 mL/min、検出波長: 358 nm。

クロルテトラサイクリン (CTC) は微量しか検出されませんでしたが、移動相の pH を 4 に調整すると、良好な分離能と感度が得られました。 あるいは、注入量を増やして検出率を高め、CTC の定量限界を下げます。 経験則としては、カラムの過負荷とピークの広がりを避けるために、注入量をできるだけ低く保つことです27。 注入量を徐々に増加させて、低濃度の CTC がピークの広がりの兆候なしに検出されることを確認しました。 注入量は装置の能力内である 50 µL に設定しましたが、ピークの広がりの兆候は観察されませんでした (図 4)。

OXY、TTR、CTC の 3 つの薬剤の吸収スペクトルを、200 ～ 600 nm の波長範囲で DAD を使用して調査しました。 3 つの薬剤のスペクトルにより、2 つのラムダ最大値、267 nm と 358 nm が明らかになりました。 サンプルマトリックスは複雑であり、267 nm には多くの干渉ピークが現れるため、358 nm の波長が最適な検出波長として選択されました。 図 5 は、対象となる分析物の吸光度スペクトルを示しています。

標的分析物の吸光度スペクトル (a) オキシテトラサイクリン、(b) テトラサイクリン、(c) クロルテトラサイクリン、および (d) 内部標準。

抽出手順は、濃縮されたサンプルを維持しながら良好な回収率が得られるように開発されました。 以前に報告された方法では、食品マトリックスにはタンパク質含有量が高いことが示されているため、前処理ステップでタンパク質の沈殿が使用されます17。 さらに、TC 分子は、カルシウムやマグネシウム (Ca+2 および Mg+2) などの多価金属カチオンと金属錯体キレートを形成する高い親和性を持っていますが、この錯体形成は、キレート剤をサンプルに添加することで防ぐことができます 12。 エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) およびアセトニトリルやメタノールなどの有機溶媒は、乳サンプルの前処理に広く使用されています 23。 提案された抽出手順では、サンプルの回収率と同心度に影響を与える可能性がある 3 つの重要な要素が特定されました。(1) 有機溶媒の量、(2) キレート剤の濃度、(3) キレート剤の濃度遠心分離の時間と速度。 サンプルの希釈を防ぐために、メタノールの量は最小限に保たれました。 この方法では、EDTA よりも水に溶けやすい EDTA ナトリウム (Na2-EDTA) をキレート剤として使用し、pH をさらに調整する必要はありません。 遠心分離の時間と速度を増加させ、Na2-EDTA の濃度を 0.2 M に増加させると、上清の透明性と回収率が大幅に増加することが実証されました。

方法の検証は、国際調和評議会 ICH28 のガイドラインに従って統計分析によって実行されました。 検証パラメーターは、薬物標準物質と 3 つの異なる乳母材 (ウシ、ラクダ、ヤギ) に基づいて評価されました。 直線性、検出と定量の限界、精度、精度に加えて、乳マトリックスに関する選択性と回収率も調査されました。

各薬物の直線性応答は、薬物濃度に対する IS のピーク面積に対する薬物ピーク面積の比をプロットすることによって決定され、回帰式が確立されました。 検量線は、各薬物の 0.09 ～ 1 μg/mL (90 ～ 1000 ng/mL) の範囲で直線でした。 各薬物の相関係数は > 0.9998 であり、この方法が指定された範囲内で線形であることを示しています。 検量線に使用した濃度は 0.09、0.3、0.5、0.7、および 1 μg/mL でした。

検出限界と定量限界は、信号対雑音比に従って決定されました。 検出限界は信号対雑音比 3:1 として設定され、定量限界は信号対雑音比 10:1 として設定されました。 OXY および TTR の検出限界は 20 ng/mL (0.020 μg/mL) でしたが、CTC の検出限界は 80 ng/mL (0.080 μg/mL) でした。 定量限界は、OXY および TTR については 50 ng/mL (0.050 μg/mL)、CTC については 90 ng/mL (0.090 μg/mL) でした。

精度は、線形範囲内の異なる濃度の薬物混合物と IS として固定濃度のオルニダゾール (0.8 μg/mL) を調製し、回収率 % と相対誤差を計算することによって評価されました。 表 3 は、良好な回収率 (理論濃度/実際濃度 %) と、OXY、TTR、および CTC の相対誤差が小さいことを示しています。 日内の精度については、精度の評価に使用した同じ薬物濃度を同日に 3 回分析し、その後 2 日に分析して日内の精度を評価しました。 相対標準偏差 (RSD) の値は、表 3 の各薬剤および濃度に対して計算されました。低い RSD 値 (< 2) は、精度が高いことを示します。

この方法の選択性は、スパイクされた牛乳および水のサンプルに対するブランクの牛乳サンプル (スパイク前にイムノアッセイおよび HPLC によって検査された分析対象物を含まない) のクロマトグラフを検査することによって評価されました。 3 つの牛乳マトリックスはすべて、分析物の保持時間に干渉するピークを示さなかった。 したがって、この方法は乳マトリックス中の TC に特異的であることが証明されました。 図 6 は、牛乳に対するメソッドの選択性の例を示しています (ブランクの牛乳サンプルと添加した牛乳と水のサンプル)。

牛乳マトリックスの選択性。 移動相: 10 mM KH2PO4:ACN: MeOH (70:20:10)、pH 4。

回収率は、同じ濃度の添加牛乳サンプルと添加水サンプルからの反応の比率として計算されました。 牛乳マトリックス中の OXY、TTR、および CTC の回収率は、指定された範囲 (80 ～ 120%) 内でした。 牛乳中の OXY、TTR、および CTC の平均回収率 ± SD は、それぞれ 94.45% ± 4.00、88.77% ± 3.89、および 89.86% ± 2.41 でした。 ラクダとヤギのミルクでは、OXY、TTR、CTC でそれぞれ 101.20% ± 4.05、98.43% ± 2.28、89.33% ± 11.03、(96.45% ± 2.10、92.73% ± 3.95、86.70% ± 1.95) でした。

3 つの牛乳マトリックス中の各薬物の直線性応答は、IS のピーク面積に対する薬物のピーク面積の比とブランク牛乳サンプル中の添加薬物濃度をプロットすることによって決定され、回帰式が確立されて表に示されています。 4. OXY および TTR の検量線は 0.09 ～ 1 μg/mL の範囲で直線でしたが、CTC の範囲は 0.200 ～ 1 μg/mL (200 ～ 1000 ng/mL) でした。 各薬物の相関係数は ≥ 0.9997 であり、この方法が指定された範囲で線形であることを示しています。 検量線に使用した濃度は 0.09、0.2、0.4、0.6、0.8、および 1 μg/mL でした。

検出限界と定量限界は、信号対雑音比に従って決定されました。 検出限界は信号対雑音比 3:1 として設定され、定量限界は信号対雑音比 10:1 として設定されました。 表 4 は、検出限界 (LOD) と定量限界 (LOQ) に加えて、乳マトリックス中の各薬物の回帰式と r 値を示しています。 牛乳中の CTC の MRL は 0.100 µg/mL でしたが、ここで最も頻繁に検出された牛乳マトリックス中の CTC 濃度は 0.180 µg/mL であり、定量能力はわずか 0.200 µg/mL から始まり、これが欠点と考えられます。方法。

精度と正確性は添加牛乳サンプルで調査され、同じ日と連続する 3 日間に 3 回分析されました。 表 5 は、提案された方法が高度な精度と精度を備えていることを示しています。

この研究で採用された方法論的アプローチは、定性分析と定量分析を組み合わせたものです。 定性的アプローチを採用することで、可能な限り最大のサンプルサイズをスキャンする目的でこの探索的研究を実施することが容易になりました。 イムノアッセイ技術は、陽性サンプルを短時間で識別するのに役立ちます。 使用した TC 迅速検査キットは、牛乳およびラクダの乳中の TC 残留物 (100 μg/kg) を定性的に測定できるラテラル フロー アッセイです。 テストストリップは下端の吸着パッドで構成され、ニトロセルロース膜上の 2 つのライン (T ラインと C ライン) が使用されます。 T ラインは TC 分子に結合するテスト ラインで、C ラインは二次抗体に結合してテスト ストリップの有効性を示すコントロール ラインです。 テストの主成分は金結合テトラサイクリン抗体で、テストストリップを挿入する前にサンプルと混合する必要があります。 このキットは各 TC 抗生物質に対して非選択的であり、その感度値 (検出限界) は、TTR および CTC については 14 μg/kg、OXY およびドキシサイクリンについては 10 μg/kg と記載されています。

図 7 は、陽性サンプルと陰性サンプルのテスト結果と無効な結果を視覚的に表示したものです。 結果の解釈は、サンプル中の TC 残留物が MRL (100 µg/kg) より大きいか制限内であるかを判断するための色の強度の視覚化と比較に基づいているため、バイアスまたは不確実性の原因となるものがあります。観察研究としての結果の自己報告的な性質。 したがって、結果の偽陰性解釈を最小限に抑えるために、このキットは、レベルに関係なく、サンプル中に TC 抗生物質の残留物が存在するかどうかを検出するために使用されました。そして、C ラインは陽性サンプルとみなされ、HPLC-DAD 分析によるさらなる決定のために陽性サンプル (C ラインのみが見えるか、かすかな T ライン) と分類されます。

陰性サンプル (-): T ラインの強度が C ラインよりも大きい場合、サンプルにはテトラサイクリン残基が含まれておらず、それらの強度が類似している場合、限界よりも低くなっています。 陽性サンプル (+): T ラインの強度が C ラインよりも明るい場合、TC 抗生物質残留物は制限値に等しく、C ラインのみが表示される場合は制限値を超えます。 無効な結果: C ラインが表示されない場合。

品質管理のために、100 ng/mL を添加した牛乳サンプルに加えて、陽性対照 (テトラサイクリン: 14 ppm = 14 ng/mL) と陰性対照サンプルを説明書に従って調製し、キットを使用するたびにテストしました。 TC 。 この手順により、保管期間中のキットの感度と有効性が保証されます。 さらに、5 つの陰性サンプルのそれぞれから 1 つのランダム サンプルを HPLC-DAD で分析し、イムノアッセイの結果を確認しました。

まず、牛乳とラクダの乳サンプルをイムノアッセイ キットで TC 抗生物質の残留物についてスキャンしました。 イムノアッセイキットにより、TC 抗生物質残基を含む C ラインと比較して暗い T ラインを示したサンプルのみを陰性サンプルとみなし、HPLC-DAD 分析から除外しました。 C ラインのみ、または強度が薄いか C ラインと同様の T ラインを示すサンプルは、ヤギ乳サンプルとともに HPLC-DAD によって TC 抗生物質残留物を測定しました。 分析当日、クロマトグラフィー システムの適合性を確認するために、スパイクされた水と牛乳のサンプルが準備され、注入されました。 次に、牛乳サンプルを調製し、HPLC-DAD システムに注入しました。 これらのピークの保持時間を、スパイク牛乳サンプルの保持時間および UV スペクトルと比較しました。 次のステップでは、これらのサンプルに既知の濃度の薬剤を添加し、それらを 2 回注入し、マトリックス干渉を排除するためにピーク純度を検査します。 残留 TC 抗生物質のレベルは、既知の濃度の薬物を添加したミルクに対する濃度を計算することによって決定されました。 ワークフローを図 8 に示します。

ワークフローの概略図。

牛乳とラクダのミルクの定性検査 (2 種類の牛乳で 18 件の陽性サンプルがありました。17 件のサンプルは牛乳、1 件のサンプルはラクダのミルクでした)。 これらの陽性サンプルは、TC の抗生物質残留レベルを決定するために提案された方法によってさらに分析されました。

表 6 が示すように、乳製品中の TC 残留物の発生量 (サンプル サイズ = 100) は MRL (0.1 μg/ml) よりも低かった。 検出された顕著な抗生物質は OXY と TTR で、陽性サンプルのほとんどで MRL 未満のレベルでした。 総 TC 抗生物質残留量に関して、MRL を超えたのは 9 サンプル (11.54%) のみでした。 CTC はどのサンプルでも検出されませんでしたが、これはおそらくこの方法の検出限界 (0.180 μg/mL) が MRL よりも高かったためと考えられます。 しかし、陽性サンプルには他の TC 抗生物質が含まれており、CTC の使用は制限されているため、この事実は裏付けられていません。

TC は獣医学で抗生物質または成長促進剤として一般的に使用されます。 不適切な使用や明確な使用手順の欠如により、畜産物中にそれらが残留する可能性があります。 当社の HPLC-DAD メソッドは、ICH のガイドラインに従って検証された分解能と感度パラメータの向上を示しています。 回収率は高く (85 ～ 100%)、マトリックスの影響は最小限に抑えられます。 私たちの調査結果は、サウジ市場から入手した牛乳サンプルの大部分において、TC 残留物が TTR と OXY の MRL を下回っていることを示しています。 唯一の例外は、TTR の MRL を超えるサンプルの 7.5%、および TTR と OXY の合計の MRL を超えるサンプルの 11.5% でしたが、OXY 単独では超えませんでした。 私たちのデータは、サウジアラビアにおける動物の飼養と治療における使用という点で、これら 2 つの TC の優れた臨床実践を反映しています。 私たちの方法は、定量限界が MRL の 2 倍であるため、乳サンプル中の CTC の測定には適していませんでした。したがって、この方法で乳サンプル中の CTC 残留物を測定できるようにするには、感度をさらに最適化する必要があります。 私たちは、TC の日常的なモニタリングにおいてイムノアッセイなどの他の分析技術を併用すること、ならびに使用中止期間や治療プロトコルの実践をより詳細に調査するために、個々の農場および非営利乳からの牛乳を含むサンプルを拡張することを推奨します。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開記事に含まれています。

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サウジアラビア、リヤドのキング・サウード大学薬学部薬化学科

モニーラ・N・アルナスララ、ノーラ・Z・アルゾマン、アリヤ・アルモメン

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転載と許可

Alnassrallah, MN、Alzoman, NZ & Almomen, A. 牛乳サンプル中のテトラサイクリン抗生物質残留物を定量するための定性イムノアッセイと、それに続く定量的改良型 HPLC-DAD メソッド。 Sci Rep 12、14502 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-18886-2

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受信日: 2022 年 4 月 26 日

受理日: 2022 年 8 月 22 日

公開日: 2022 年 8 月 25 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-18886-2

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