RPによるヘンプオイル注入製品中のカンナビジオールとテトラヒドロカンナビノールのアッセイ測定のための分析方法の検証

Mar 09, 2023

Scientific Reports volume 12、記事番号: 12453 (2022) この記事を引用

4334 アクセス

4 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ヘンプオイル注入製品に含まれるカンナビジオールとテトラヒドロカンナビノールのアッセイ測定用に、簡単な定量的逆相高速液体クロマトグラフィー (RP-HPLC) 法が開発され、検証されました。 RP-HPLC メソッドは、移動相の組成、流量、カラムの選択、検出器の波長に合わせて開発および最適化されました。 サンプルの定組成溶出は、SOLAS 100 Å C18 150 mm × 4.6 mm、5 μm カラムで、75/25 アセトニトリル/水 v/v を含む移動相を使用し、紫外線を使用して流速 1.5 mL/min で実行されました。 214 nm で動作する可視 (UV/Vis) 検出器。 RP-HPLC メソッドは、特異性、精度、範囲、直線性、精度、システム適合性、堅牢性を含む規制要件を満たすことが検証されています。 検証されたアッセイ試験方法は、錠剤、ソフトジェルカプセル、植物抽出油、経口ドロップ、チンキ剤、飲料強化剤などの市販のヘンプオイル注入製品に含まれるカンナビジオールとテトラヒドロカンナビノールの定量に適用されることに成功しました。 すべてのテスト結果は ICH ガイドラインに従って許容できるものであることが判明し、これにより、ヘンプオイル注入製品のカンナビジオールおよびテトラヒドロカンナビノールの定期的な品質管理およびアッセイでの使用を目的としたこの方法の実現可能性が確認されました。

ヘンプを注入した製品の市場が成長するにつれて、消費者はこれらの製品がテストされる品質基準をより意識するようになりました。 さらに、医療用大麻の場合、患者は特定の治療効果を求めるため、正確な検査が重要です。 このため、ヘンプ/大麻業界は、これらの製品の強度と純度を定量化するために、より多くの実際のテストに努めています。 大麻はアサ科に属する植物であり、さまざまな天然成分が含まれています。 合計 565 の化合物が C. sativa 種から単離および同定されており、そのうち 120 はカンナビノイドのカテゴリーに属します 1,2。 カンナビノイドは、炭素原子数 21 のテルペノフェノール化合物のグループに属し、化学構造に従ってさらに 11 のサブグループに分類されます。 これは、カンナビジオール (CBD) 7 化合物、カンナビゲロール (CBG) 16 化合物、Δ9-テトラヒドロカンナビノール (Δ9-THC) 23 化合物、Δ8-テトラヒドロカンナビノール (Δ8-THC) 5 化合物、カンナビノール 11 化合物で構成されます。 (CBN)、カンナビクロメン (CBC) の 9 化合物、カンナビエルソイン (CBE) の 5 化合物、カンナビノジオール (CBND) の 2 化合物、カンナビシクロール (CBL) の 3 化合物、カンナビトリオール (CBT) の 9 化合物、残りの 30 化合物は以下に属します。雑多なタイプ３． CBD、THC、CBG、CBN、および CBC は中性カンナビノイドであり、それぞれの天然に存在する酸形態 (CBDA、THCA、CBGA、CBNA、および CBCA) の脱炭酸反応によって合成されます。 120 種類のカンナビノイドのうち、CBD と THC が市販のヘンプオイルサンプルの 2 つの主要なバイオマーカーです4。 CBD（図1a）は、薬用ヘンプオイル製品に含まれる医薬品有効成分（API）であり、抗精神病薬、抗不安薬、制吐薬、食欲増進薬、鎮痛薬、筋弛緩薬などのいくつかの治療特性を示します。効果５． 一方、THC (図 1b) は大麻の主な精神活性成分であり、大麻が娯楽用麻薬として使用される理由です5。 2018年の米国農場法案によると、ヘンプは「植物カンナビス・サティバL.およびその種子を含むその植物のあらゆる部分、およびすべての誘導体、抽出物、カンナビノイド、異性体、酸、塩、および異性体の塩」と定義されています。成長しているかどうか、デルタ-9 テトラヒドロカンナビノール濃度が乾燥重量ベースで 0.3 パーセント以下であること。 このため、ヘンプ製品に含まれる CBD と THC の両方を同時に測定する定量的方法の必要性が非常に重要になります。 CBD と THC の両方のレベルの組成は、最終製品の合法性と生理学的効果に強い影響を与えます。

(a) カンナビジオールと (b) テトラヒドロカンナビノール - CBD と THC の構造図。 化学式: C21H30O2; 分子量: 314.464 g/mol。

広範な文献調査により、大麻植物抽出物中のカンナビノイドを定量するための分析方法がいくつかあることが明らかになり、最も一般的に使用される方法は、ガスクロマトグラフィー (GC) と質量分析 (MS) 検出器を組み合わせたものです7、8、9、10、11、12、13。 、14． GC メソッドでは、熱い注入口とオーブンの条件による脱炭酸の結果、酸性類似体の定量が制限されます。 さらに、脱炭酸プロセスが不完全であり、定量分析が困難であることが判明しました。 GC では、酸性カンナビノイドの測定には広範な誘導体化ステップ 15 が必要であり、商業研究所にとっては時間と費用がかかる可能性があります。 酸性カンナビノイドと中性カンナビノイドの両方の定量には、高速液体クロマトグラフィー (HPLC)16、薄層クロマトグラフィー (TLC)17、質量分析と組み合わせた HPLC (HPLC/MS)18、超高速超臨界流体クロマトグラフィー ( UHPSFC)19、MS と組み合わせた液体クロマトグラフィー (LC-MS)20、21、22、23、および遠心分離クロマトグラフィー技術 24 が報告されています。 純粋な分離株中の CBD の定量的測定を示す方法も以前に発表されました 25。 すべての方法の中で、HPLC 法は酸性と中性の両方の形態の測定が可能であり、高価な MS 検出器も必要としないため、最も簡単であることがわかりました。 HPLC を利用するいくつかの方法が公開されています 26、27、28、29、30、31 が、これらの方法のほとんどは緩衝液移動相と勾配溶出技術を使用しています 32、33。 さらに、これらの方法は、CBD および THC 以外のいくつかのカンナビノイドを含むカンナビノイド混合物の分離を実証しています28、34、35、36、37。 最も単純な HPLC メソッドでは、移動相が有機修飾剤のみからなるアイソクラティック溶出技術を使用することも報告されています 38,39。 ヘンプ業界では、急速に変化する規制要件に対応するために、CBDやTHCなどの主要成分を定量するための、シンプルで堅牢、正確かつ効率的な分析方法の開発が求められています。 ヘンプオイルは現在、いくつかの新しい消費者製品や栄養補助食品の配合に使用されています。 このような製品の例には、飲料強化剤、チョコレート、カプセル、局所薬、焼き菓子、さらには錠剤、チンキ剤、カプセル、経口点滴剤、および舌下点滴剤の形態の一般用医薬品が含まれます。

ここでは、ヘンプオイル製品中の CBD と THC を信頼性が高く迅速に定量するための逆相 HPLC (RP-HPLC) 法の実現可能性を実証します。 このメソッドは定組成溶出を使用するため、標準的な HPLC システムで実行可能です。 また、このメソッドは周囲温度条件でも良好に機能し、有機修飾剤のみの移動相を使用します。 分析法の特異性、直線性、精度、範囲、精度、およびロバスト性は、国際調和審議会 (ICH) 品質ガイドライン Q2(R1)「分析手順の検証: 試験と方法論」に指定されているアッセイ法の検証要件に従って決定されました。 「液体クロマトグラフィーによる CBD および THC の定量用」40。

RP-HPLC 分析は、内蔵のオートサンプラー (AS-4150)、オンポンプ付きクォータナリ ポンプ (PU-4180) に接続された Jasco Extrema (JASCO, Inc.、28600 Mary's court, Easton, Maryland 21601, USA) で実行されました。ラインデガッサー、カラムオーブン (CO-4061)、UV/Vis 検出器 (UV-4075)、およびインターフェイスボックス LC-NetII/ADC。 クロマトグラフィーデータは、ChromNAV Ver.2 ソフトウェアを使用して収集および分析されました。 2 番目の HPLC システム (Agilent 1100 シリーズ) には、可変波長検出器 (G1314A VWD)、オートサンプラー (G1313A)、およびアイソクラティック ポンプ システム (G1310A) が装備されています。 このシステムは Chemstation (Agilent テクノロジーズ) ソフトウェアで自動化され、中程度の精度 (再現性) テストとデータ収集に使用されました。 クロマトグラフィー分離は、SOLAS 100 Å C18 150 mm × 4.6 mm 5 µm カラム (Glantreo Limited、アイルランド) を使用して達成されました。 SOLAS ODS C18 150 mm × 4.6 mm 5 µm、SOLAS ODS C18 150 mm × 4.6 mm 3 µm、SOLAS BDS C18 150 mm × 4.6 mm 5 µm、SOLAS BDS C18 150 mm × 4.6 mm 3 µm、EIROSHELL などのさまざまな HPLC カラムこのメソッド開発の目的には、C18 150 mm × 4.6 mm 2.6 μm (Glantreo Limited) が使用されました。 各化学物質および試験サンプルは、化学天秤（Adventurer Pro AS214、オーハウス社、米国ニュージャージー州パインブルック）を使用して正確に秤量した。

Alfa Aesar (Thermo Fisher Scientific、英国ランカシャー) のアセトニトリルや社内施設の蒸留水を含む、HPLC または分析グレードのすべての試薬および化学薬品を使用しました。 カンナビジオール (CBD) およびΔ9-テトラヒドロカンナビノール (Δ9-THC または THC) 参照標準は、Cerilliant (Cerilliant Corporation、米国テキサス州ラウンド ロック) から購入しました。 フィトカンナビノイド混合物 10 は、Cayman Chemical (Cayman Chemical company、1180 East Ellsworth Road、Ann Arbor、Michigan 48108 USA) から購入しました。 Prism Science LLC, 30403 Kings Valley Dr., Conifer, CO 80433 は、テスト用に CBD 錠剤 (Santeer LUV 5 mg CBD 錠剤 - 中) とプラセボ錠剤を提供してくれました。 Millex-LCR PTFE 0.45um 膜フィルターは、アイルランド、コルク州、キャリグツーヒル、タラグリーンのメルク ミリポア社から購入しました。

アセトニトリルと水 75/25 v/v の移動相を、アイソクラティック流速 1.5 mL/min で使用しました。 カラム温度は 25 °C に維持され、検出は 214 nm で行われました。 10 μL の標準溶液とサンプル溶液を HPLC システムに注入しました。実行時間は CBD 標準の場合は 10 分、システム適合性とアッセイサンプルの場合は 20 分でした。 メソッド開発のために、20 μL のフィトカンナビノイド混合物 10 作業標準溶液を HPLC システムに注入しました。

100 μg/mL CBD および 100 μg/mL THC の標準ストック溶液は、メスフラスコ中で 1.0 mL の CBD および THC 参照標準を 10 mL のアセトニトリルに別々に溶解することによって調製されました。 1.0 mL の THC ストック標準溶液を 10 mL のアセトニトリルで希釈し、10 μg/mL の THC を含む最終標準ストックとして使用しました。

クロマトグラフィーのメソッドパラメータを最適化するために、1.0 mL の CBD ストック標準をアセトニトリルで 10 mL に希釈することによって調製した 10 μg/mL CBD の作業標準溶液。 250 μg/mL 標準溶液 1.0 mL をアセトニトリルで 10 mL に希釈して調製した 25 μg/mL フィトカンナビノイド混合物-10 作業標準溶液を使用しました。 60/40 v/v から 80/20 v/v アセトニトリル/水まで変化する移動相を考慮し、1.5 mL/min および 2.0 mL/min の流速を検討しました。 移動相と流速パラメータを最適化した後、さまざまな波長 (214 nm、228 nm、230 nm、240 nm、280 nm、および 305 nm) でテストを実施しました。 さまざまな粒子サイズとカラムの化学的性質を備えた 150 × 4.6 mm のクロマトグラフィー カラムをテストしました。 検討したカラムは、SOLAS C18 5 μm、SOLAS ODS 5 μm および 3 μm、SOLAS BDS 5 μm および 3 μm、および EIROSHELL C18 2.6 μm です。 より優れた分離効率を示したクロマトグラフィー カラムが最終テストに選択されました。

1.0 mL の CBD および THC ストック標準溶液をメスフラスコ内で 10 mL のアセトニトリルで希釈し（それぞれ濃度 10 μg/mL CBD および 1 μg/mL THC の標準混合物）、アッセイ方法に使用しました。 この溶液は、HPLC で 6 回の注入が行われ、プレート数、テーリングファクター、分離能、および再現性 (6 回の注入の保持時間、ピーク面積、および高さの RSD パーセント) を決定するシステム適合性テストに使用されました。

アッセイの直線性は、公称サンプル濃度 (0.1 mg/mL) の 50 ～ 150% の範囲内で 5 つの標準溶液を調製することによって実証されました。 各溶液は単一ストックから段階希釈によって調製され（CBD の場合は 5 ～ 15 μg/mL、THC の場合は 0.5 ～ 1.5 μg/mL）、3 回に分けて注入されました。 線形回帰分析は、原点をデータポイントとして考慮せずに実行されました。

特異性を高めるために、プラセボブレンド錠剤 1 錠の重量に相当するプラセボの重量を量ることによりスパイクされていないプラセボ溶液を調製し (20 錠の重量を量り、平均重量を計算)、50 mL のメスフラスコに移し、35 mL のアセトニトリルを加え、20 分間超音波処理しました。 アセトニトリルで一定量まで希釈し、よく混合しました（スパイクされていないプラセボストック）。 この溶液 1.0 mL をアセトニトリルで 10 mL に希釈し、よく混合し、0.45 μm Millex PTFE フィルターユニットを使用して 2.0 mL の濾液を廃棄した後、オートサンプラーバイアルに濾過しました。 プラセボ製剤を二重に注射した。 スパイクされていないプラセボストックを個別に調製し、アセトニトリルで 1.0 ～ 10 mL に希釈し、1.0 mL の CBD ストック標準溶液と 1.0 mL の THC 最終ストック標準溶液を加え、よく混合し、ろ過して、活性物質を 100% 含む 2 つの別々のスパイク溶液を調製しました。 0.45 µm Millex PTFE フィルターユニットを使用して 2.0 mL の濾液を廃棄した後のオートサンプラーバイアル。 (スパイク濃度: CBD - 10 μg/mL および THC - それぞれ 1 μg/mL)。 特異性を確認するために、スパイクされたサンプルを 2 回注入しました。

アッセイ法の範囲は、公称メソッドサンプル濃度の CBD (10 μg/mL) および THC (1 μg/mL) の 50 ～ 150% の範囲でスパイクされたプラセボ溶液を分析することによって実証されました。 5 つの濃度レベルのそれぞれで 3 つの分銅を用意し、各溶液を 3 回分析しました。 線形回帰分析は、原点をデータポイントとして考慮せずに実行されました。

アッセイ方法の精度と回収率は、検証の範囲部分でスパイクされたプラセボ溶液から得られたデータを分析することによって検証されました。 個々のサンプル重量の回収率と各濃度レベルでの平均を求めました。

精度を高めるために、アッセイサンプル溶液は次のように調製されます。

5 つの錠剤 (最小) を正確に秤量し、平均錠剤重量を計算し、次に錠剤を微粉末に粉砕しました。 5 mg の CBD に相当する秤量サンプルを 50 mL メスフラスコに移し、約 35 mL のアセトニトリルを加え、得られた溶液を断続的に振盪しながら 15 分間超音波処理しました。 次いで、サンプルをアセトニトリルで所定の容量まで希釈し、よく混合した。 この溶液 1.0 mL をアセトニトリルで 10 mL に希釈し、よく混合し、最初の 2 mL のサンプル溶液を廃棄した後、一部を Millex PTFE 0.45 μm サンプル濾過キットを通して HPLC バイアルに濾過しました。 この手順に従って、サンプルには 10 μg/mL CBD が含まれると計算されました。 続いて、10 μL のサンプル溶液を HPLC システムに注入しました。

メソッドの精度 (再現性) のために、6 つのアッセイサンプルを調製し、CBD および THC のラベルクレームのパーセントをサンプルごとに決定しました。 この方法の中程度の精度は、2 番目の分析者を使用して再現性実験を再度実行することによって実証されました。 この分析者は、最初の分析者とは異なる溶液調製、試薬、操作条件、カラム、および HPLC システムを使用し、異なる日にテストしました。

メソッドの堅牢性は、通常の使用時における提案された分析メソッドの信頼性を示すために、クロマトグラフィー パラメーターの変化によって確立されました。 考慮されたクロマトグラフィーパラメータは、移動相組成、カラムオーブン温度、および移動相流量の変動でした。 移動相組成では、提案された方法条件から主成分を 5% および 10% 増加させ、カラムオーブン温度を 5 °C 増加および減少させ、流量を 10% および 25% 増加および減少させました。 システム適合性標準溶液は、パラメータ変更ごとに 2 回ずつ注入されました。

このアッセイ方法は、システム適合性、直線性、特異性、精度、範囲、精度 (再現性および中間精度)、および堅牢性に関して ICH ガイドラインに従って開発および検証されました。

私たちの研究の焦点は、ヘンプオイル注入製品中のCBDとTHCを同時に測定するための新しい分析方法を開発することでした。 さらに、ここで提案した方法は、商業薬物試験所、製薬産業、研究機関で標準的な品質管理手順として利用できます。 クロマトグラフィー条件の最適化は、HPLC 技術における分析物の正確な検出と定量化において重要な役割を果たします。 異なる割合のアセトニトリル (60、70、75、および 80%、v/v) を含む移動相を検査し、CBD の溶出時間と CBD と CBG 間の分離を記録しました。 さまざまな移動相組成のテスト中、流速 2.0 mL/min、検出波長 214 nm が使用されました。 CBN は 305 nm で強いピークを生成するため、フィトカンナビノイド混合物中の CBN を識別するために 305 nm の検出波長が使用されました。 テスト結果から、アセトニトリル/水の移動相濃度は 75/25 v/v であることが推奨されます。 1.5 mL/min と 2.0 mL/min の流速を比較し、CBD がより効率よく溶出する 1.5 mL/min の流速を最終的に決定しました。 さまざまな波長 (214 nm、228 nm、230 nm、240 nm、280 nm、および 305 nm) をチェックし、CBD のピーク強度を記録しました。 カラム寸法 150 mm × 4.6 mm のさまざまなクロマトグラフィー カラムを使用して、他のカンナビノイドから CBD および THC を分離する能力がテストされました。 テストしたすべてのカラムは、Glantreo Limited が社内のシリカ技術プラットフォームを使用して製造したもので、SOLAS 100 Å C18 5 µm、SOLAS ODS 5 µm および 3 µm、SOLAS BDS 5 µm および 3 µm、EIROSHELL C18 2.6 µm が含まれます。 すべてのテスト結果は表にまとめられ、表 1a ～ c​​ に示されています。

表 1a から、流速 1.5 mL/min の 75/25 v/v アセトニトリル/水の移動相により、CBD ピークの溶出効率が向上し、CBG からの分離も比較的良好になることが明らかです。 表 1b は、より高い波長では CBD のピーク強度の強度の大幅な低下が観察されているため、214 nm と 228 nm の両方の検出器波長が適切であることを示しています。 この方法では、214 nm が最適な波長と考えられました。これは、この波長では CBD がより高いピーク強度とより良い効率で溶出するためです (表 1b)。 表 1c は、SOLAS C18 150 mm × 4.6 mm 5 µm カラムが、SOLAS ODS 5 µm、BDS 5 µm、および EIROSHELL 2.6 µm C18 カラムと比較して、CBG と CBD の間で優れた分離能で植物カンナビノイド混合物 10 を良好に分離することを実証したことを示しています。 さらに、SOLAS C18 150 mm × 4.6 mm 5 µm カラムは、CBD の理論段数の点でより高い効率を示し、CBD ピーク対称性 ≤ 1.5 も示しました。

10 μg/mL CBD および 1 μg/mL THC を含む標準混合物に対してシステム適合性テストを実行し、両方の HPLC システム (Agilent 1100 および Jasco Extrema HPLC) で 6 回の反復注入を実行しました。 保持時間、ピーク面積、およびピーク高さについて観察された RSD 値は、1% 未満という許容基準の設定限界内に十分に収まっています。 理論プレート (N)、USP テーリング係数 (T)、容量係数、CBD と THC 間の USP 分離能 (Rs)、および THC の相対保持時間 (RRT) をアッセイのために決定しました。 結果は表 2a にまとめられており、すべての結果は表 2a に記載されている設定された許容限界内にあります。 典型的なシステム適合性クロマトグラムを図 2 に示します。

アッセイ用の CBD および THC 標準混合物 (10 μg/mL CBD および 1 μg/mL THC) のシステム適合性クロマトグラム。

CBD および THC のピーク面積応答の直線性は、メソッド濃度の 50 ～ 150% の段階希釈 (CBD については 10 μg/mL、THC については 1 μg/mL) で標準混合物を分析することによって、アッセイ法について決定されました。 線形回帰分析は、原点をデータポイントとして考慮せずに実行されました。 CBD と THC の両方について、3 回の注入でのピーク面積の RSD の割合は 1.0% 未満であることが判明し、r2 > 0.999 の線形応答を示します (表 2b)。 濃度対ピーク面積応答（強度）のグラフを図 3 に示します。残留物対分析対象物濃度のグラフを図 3 に示します。

CBD および THC アッセイ法検証の直線性および残差プロット図 (a) CBD の残差プロット (b) THC の残差プロット (c) THC のアッセイ直線性プロット、および (d) CBD のアッセイ直線性プロット。

プラセボサンプルは、検証されるメソッドで指定された濃度に関して、適切な量のプラセボ (プラセボはメソッド濃度の 100% のまま) を秤量することによって調製されました。 プラセボ製剤を二重に注射した。 活性物質を 100% 含む 2 つの別々のスパイク溶液を調製しました。 特異性を確認するために、スパイクされたサンプルを 2 回注入しました。 希釈剤ブランク、スパイクされていないプラセボ、およびスパイクされたプラセボ調製物のクロマトグラムの例を図 4 に示します。図 4 は、希釈剤とプラセボからの干渉ピークが観察されなかったため、この方法の選択性を示しています。 さらに、このメソッドは定組成溶出に従うため、キャリーオーバーの存在を評価するために、10 回ごとのサンプル注入後 (チェック標準注入前) と各クロマトグラフィー シーケンスの最後に、ブランク サンプル溶媒 (アセトニトリル) を注入しました。 これらのブランク サンプル溶媒注入は、カラム内に蓄積された遅れて溶出する不純物の影響を最小限に抑えるための予防策として、ルーチンのヘンプオイル注入サンプル分析のクロマトグラフィー シーケンスにも組み込まれました。 これらのブランクサンプル溶媒注入のクロマトグラムでは、CBD および THC の保持時間にカンナビノイド代謝物または未知の不純物に関連するピークが存在しないことが示され、これは、保持されなかった化合物がカラム上に蓄積していないことを証明しています。

CBD および THC アッセイの (a) 希釈剤ブランク (b) スパイクされていないプラセボ サンプル、および (c) スパイクされたプラセボ サンプルの特異性クロマトグラム。

メソッド濃度の 50 ～ 150% の範囲のサンプル濃度をスパイクしたプラセボ溶液を 3 回調製しました。 各調製物から 3 回の注入を行い、原点をデータ ポイントとして考慮せずに線形回帰分析を実行しました。 CBD および THC 標準はどちらも優れた線形応答を示します (r2 > 0.999 (表 2b)。また、3 回の注射および各濃度レベルの平均面積応答の RSD のパーセンテージ (n = 9、n は注射回数) 2.0% 未満であることがわかりました (表 2b)。濃度対面積応答のグラフを図 5 に示します。残留物対検体濃度のグラフを図 5 に示します。

アッセイの精度および範囲テストのための、(a) CBD および (b) THC の濃度対面積応答グラフ。

個々のスパイクされたプラセボサンプルごとの回収率と各濃度レベルでの平均を計算しました。 結果を表２ｂにまとめた。 スパイクされたプラセボの回復率は、3 つの重量の各セットの平均で、CBD については 100 ～ 105%、THC については 98 ～ 100% であることがわかりました (許容基準: ICH ガイドライン 40 に従って 90 ～ 110%)。 個々のサンプルの回収率も 90 ～ 110% の範囲内でした。 回収データは、この方法による CBD と THC の高い抽出効率を示しています。

メソッドの精度 (再現性) は、CBD 5 mg に相当する量を秤量し、CBD 濃度 10 μg/mL のタブレットから 6 つのサンプル溶液を調製することによって実行されました。 各製剤を 2 回注射し、アッセイ値を計算しました。 再現性と中間精度の両方について、CBD と THC のパーセンテージ RSD 値を含む結果を表 2b に示します。 CBD と THC の両方のパーセンテージ RSD 値は 2.0% 未満です。 典型的な標準溶液とサンプル溶液 (5 mg) のクロマトグラムを図 6 に示します。サンプルのクロマトグラムを標準、プラセボ、およびブランクのクロマトグラムと比較しました。 ヘンプオイルサンプルのクロマトグラムではCBGがCBDとわずかに重なっているように見えましたが、それでも分離は明確であり、適切な統合が可能でした。 この方法の中程度の精度は、2 人目の分析者による再現性実験を繰り返すことによって実証されました。 この分析者は、最初の分析者とは異なる溶液調製、試薬、操作条件、カラム、および HPLC システムを使用し、異なる日にテストしました。 すべての合格基準が満たされました (ICH ガイドラインに従って、アッセイ値のパーセンテージ RSD は 2.0% を超えてはなりません。両方の分析者からの合計アッセイ値のパーセンテージ RSD は 3.0% を超えてはなりません)。

(a) CBD および THC アッセイ方法検証のための精密試験からの標準クロマトグラムと (b) サンプルクロマトグラム。

メソッドの堅牢性は、提案されたメソッドで指定されたパラメータからの移動相組成、温度、および流量の変化によって証明されました。 システム適合性標準 (10 μg/mL CBD および 1.0 μg/mL THC) を調製し、パラメーターを変更するたびに 2 回注入しました。 このソリューションはアッセイの堅牢性を実行するために使用され、各パラメーターの変更は一度に 1 つの要素でテストされました。 保持時間 (RT)、理論段数 (N)、テーリング係数 (T)、容量係数 (k)、CBD と THC 間の分離 (Rs)、THC の相対保持時間 (RRT) を表 3 に示します。表 3 の結果を検討すると、移動相組成中の主成分 (アセトニトリル) の体積が 5% および 10% 減少すると、メソッド実行範囲内ではない THC の溶出が生じるため、移動相濃度の変化が重要なパラメーターであることがわかります。時間。 さらに、移動相組成の主成分が 5% および 10% 増加すると、効率が低下します (理論段値の低下、表 3 を参照)。 カラム オーブンの温度が変化しても、システムやカラムの効率パラメータには変化がありません。

さらに、溶液の安定性は、新たに調製した標準溶液を使用して標準溶液のシステム適合性を 2 回テストすることによって 48 時間確立されました。溶液は室温で 24 時間保持され、溶液は 0 ～ 8 °C で 24 時間保持され、溶液は 24 時間保持されました。室温で48時間。 結果は、ピーク面積吸光度値の変動が無視できるほど小さいことを示し、標準溶液の室温で 48 時間の安定性が証明されました。 また、注入回数が 500 回を超える古いカラムをテストしたところ、新しいカラムと比較してテーリングと背圧が高いことがわかり、この HPLC カラム (SOLAS 100 Å C18、150 mm × 4.6 mm 5 µm) のおおよその寿命が 500 回未満であることがわかりました。 。

この検証済みの方法の適合性は、Prism Science LLC、30403 Kings Valley Dr.、Conifer、CO 80433 によって提供された幅広いヘンプオイル注入錠剤を使用して研究されました。サンプルには、Santeer LUV 2.5 mg、5 mg、および 10 mg PET 錠剤が含まれていました。 、Santeer FOCUS および RENEW 5 mg CBD タブレット、Santeer DREAM 10 mg CBD タブレット。 その後、この方法はさまざまなヘンプオイル注入製品に含まれる CBD と THC の定量に適用され、Anakkattillam らによって発表された論文で発表されました 41。 テストされたサンプルは、錠剤、カプセル、チンキ剤、経口ドロップ、飲料強化剤、および植物抽出油で構成されていました。 さらに、この方法は、QuEChERS 抽出法を使用してカンナビノイドが抽出されたヘンプオイル注入チョコレートなどの複雑なマトリックス中の CBD および THC を定量するのに適していることがわかりました 42,43。 さらに、Glantreo Limited は現在、品質管理手順として市販のヘンプオイルを注入したサンプルをテストするためにこのアッセイ方法を採用しています。

CBD および THC を定量するためのこの方法の効率の適合性は、HPLC 技術を使用したさまざまな出版論文で報告された CBD および THC の回収データを考慮することによって比較されました (補足表 S1)。 補足表S1は、17の方法のうち10が勾配溶出4、26、28、29、30、31、32、35、36、37を使用し、残りの7つの方法が定組成溶出を示し、4つの方法が酸または塩基を使用することを明確に示しました。または塩を含む移動相16、27、33、34。 1 つの定組成溶出法では、40 °C のカラム オーブン温度を利用し、元々は超高速液体クロマトグラフィー法でした 25。一方、もう 1 つの定組成法では、55 °C のカラム オーブン温度と 4 °C のオートサンプラー サーモスタットが使用されました 39。 単純であることがわかった唯一の方法は、移動相として 85% メタノールを使用し、実行時間を 10 分に短縮しましたが、この方法では CBD 回収率が 97.1%、THC 回収率が 99.3% であったのに対し、私たちの方法では CBD 回収率が 105.2%、THC 回収率が 100.2% でした。 THC41 の回収率 (%)。 さらに、出版された論文41で言及されているサンプルのアッセイ試験を実行する際、最初はアセトニトリルを抽出溶媒として使用しました。 CBD含有量がラベル表示に比べて非常に低いことが判明したサンプルについては、メタノールを抽出溶媒として使用して分析を実施しました。 CBD が検出されなかったサンプルについては、アセトニトリルおよび/またはメタノールの抽出効率を確認するために、QuEChERS 抽出法 42,43 を使用して抽出をさらに実行しました。 アッセイ試験の結果は、アセトニトリル抽出とメタノール抽出の両方で同等であり、アセトニトリルの方が適切であることがわかりました。

製品にTHCなどの精神病性分子が含まれるカンナビノイドなどの化合物の正確な定量には、研究室が手頃な価格で簡単に適用できる検証済みの手順が必要です。 製品内の THC の量によって、当該製品の法的制限が決まります。 ここで検証され提示されたアッセイ試験方法により、ヘンプオイル注入製品中の CBD と THC を 20 分の実行時間で定量的かつ同時に測定することができます。 このメソッドでは 214 nm の単一波長が使用され、テストは従来の標準的な RP-HPLC および紫外可視検出器を使用して実行できます。 さらに、このメソッドは標準および調製に有機溶媒のみを使用し、移動相には単一の有機修飾剤を使用し、pH 調整は行わず、試験は定組成溶出に続きます。 シンプルさと一貫性により、このメソッドは基本的な HPLC 知識を持つ分析者であれば誰でも使用できます。 この方法は、錠剤強度の公称濃度の 50% ～ 150% の範囲内で、選択的、正確、直線的、および正確であることが示されました。 このメソッドは、移動相の濃度変化や流量などの重要なパラメーターが確立されているため、堅牢であることが示されました。

著者らは、この研究の結果を裏付けるデータが責任著者のエリック・ムーア博士 ([email protected]) からの要請に応じて入手可能であることを確認しています。

逆相高速液体クロマトグラフィー

カンナビジオール

テトラヒドロカンナビノール

相対標準偏差

品質管理

国際調和評議会

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この研究は、雇用ベースの大学院プログラム奨学金に基づいてアイルランド研究評議会によって支援されました (プロジェクト ID: EBPPG/2019/38)。 S. Analakkattillam は、組織内での研究実施を許可してくださった Glantreo Limited (アイルランド、コーク、リー ロード、ERI Building、ERI Building) に感謝しています。

Glantreo Limited、ERI Building、Lee Road、コーク、T23 XE10、アイルランド

サンディヤラニ アナラクッティラ​​ム、ビクター K. ランシ & ジョン P. ハンラハン

ユニバーシティ・カレッジ・コーク、コーク、T12 YN60、アイルランド、化学学部

サンディヤラニ・アナラクッティラ​​ム、ビクター・K・ランシ、エリック・ムーア

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著者全員が研究の構想と設計に貢献しました。 以下に説明する CRediT 分類法に従った著者の貢献: SA: 方法論、検証、形式的分析、調査、執筆 - 原案、視覚化、データキュレーション、資金調達。 EM: 監修、執筆、レビュー、編集。 JH: コンセプト化、監督（雇用メンター）、執筆、レビューと編集、プロジェクト管理。 VL: 方法論、検証、リソース。

エリック・ムーアへの手紙。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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Analakkattillam, S.、Langsi, VK、Hanrahan, JP 他。 RP-HPLC によるヘンプオイル注入製品中のカンナビジオールとテトラヒドロカンナビノールのアッセイ測定のための分析方法の検証。 Sci Rep 12、12453 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-13737-6

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受信日: 2022 年 1 月 17 日

受理日: 2022 年 5 月 4 日

公開日: 2022 年 7 月 21 日

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